鹿茸是雄鹿的 (除驯鹿外) 第二性征，是雄鹿的头部附属器官，每年周期性脱落和再生一次。每年春末夏初，鹿茸由角柄上开始生长，夏季快速生长，秋冬季鹿茸骨化。鹿茸软骨是非常独特的软骨组织，它不仅在自然条件下能够自我修复和再生，而且拥有惊人的生长速度，可高达每天2 cm[1]。鹿茸从上到下分为蜡片部位、血片部位和骨片部位[2]。鹿茸的生长中心位于鹿茸的蜡片部位，鹿茸顶端的间充质干细胞不断的快速分裂增殖导致鹿茸的快速生长[3]。而鹿茸基部骨片部位具有快速的骨化速度[4]。
随着基因组学、转录组学等大数据组学技术的不断发展，日益成熟的蛋白质组学技术越来越多的应用于鹿茸的研究中[5-10]。赵东[11]采用双向电泳 (2-DE) 结合MALDI-TOF-TOF质谱技术对梅花鹿鹿茸总蛋白进行了分离鉴定，分离得到500个蛋白点，鉴定成功177种鹿茸蛋白。张然然等[12]运用2-DE和MALDI-TOF-TOF质谱对不同生长时期 (10、40、60、130 d) 的梅花鹿鹿茸进行了差异表达蛋白筛选，筛选到46个差异表达蛋白，并推测P4HB、SPARC、过氧化物还原酶2、过氧化物还原酶4、半乳糖凝集素1、视黄酸结合蛋白1等6种蛋白质在鹿茸快速生长与快速骨化过程中起着重要的作用。尽管前人做了很多工作，但是缺乏关于鹿茸不同部位的差异蛋白质组学研究。
本研究以梅花鹿二杠鹿茸为试验材料，采用2-DE、MALDI-TOF-TOF质谱及生物信息学方法分析鹿茸不同部位 (腊片、血片、骨片) 的差异表达蛋白。以期为鹿茸快速生长与快速骨化机制的研究提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 化学试剂尿素、硫脲、CHAPS、二硫苏糖醇 (DTT)、两性电解质 (Bio-Lyte)、Tris、丙烯酰胺、甲叉-双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 (SDS)、过硫酸铵、四甲基二乙胺 (TEMED)、碘乙酰胺、Mineral oil、17 cm pH 4~7干胶条、Clean-up Kit均购自伯乐公司。胰蛋白酶购自罗氏公司。甘油、甲醇、乙酸、碳酸氢铵、三氟乙酸、乙腈均为国产试剂。
1.2 试验样品试验所用样品为5岁梅花鹿生长期40天二杠鹿茸，不同部位示意图见图 1，样品取自中国农业科学院特产研究所鹿场。
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图 1 梅花鹿鹿茸不同部位示意图 Figure 1 Different parts of sika deer antler |
将不同部位鹿茸组织切成小块，使用PBS缓冲液冲洗鹿茸组织块，利用滤纸吸取鹿茸组织残留PBS缓冲液，之后将鹿茸组织置于研钵中液氮研磨成粉末。分别取不同部位鹿茸研磨粉末2 g加入到10 mL蛋白质裂解液 (7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mmol·L-1 DTT、0.2% Bio-Lyte、1% PMSF) 中，之后利用超声波细胞破碎仪进行超声处理，200 W超声10 s，间隔10 s，共超声10次，然后置于冰上裂解2 h。裂解完成之后20 000 g、4 ℃离心15 min，上清使用伯乐公司2D-clean up蛋白纯化试剂盒 (1632130) 纯化。
1.4 双向电泳与凝胶扫描采用pH 4~7，17 cm IPG胶条进行双向凝胶电泳，上样缓冲液为7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mmol·L-1 DTT、0.2% Bio-Lyte、痕量溴酚蓝，上样体积为400 μL，等电聚焦程序：被动水化2 h；50 V水化14 h；100 V，2 h，快速；200 V，1.5 h，快速；500 V，1.5 h，快速；1 000 V，2 h，快速；10 000 V，7 h，线性；10 000 V，70 000 Vhr，快速；500 V维持。等电聚焦结束后将胶条置于5 mL胶条平衡缓冲液Ⅰ中 (6 mol·L-1尿素、2% SDS、1.5 mol·L-1 pH 8.8 Tris-HCL、30%甘油、1% DTT)，平衡15 min。然后置于5 mL胶条平衡缓冲液Ⅱ中 (6 mol·L-1尿素、2% SDS、1.5 mol·L-1 pH 8.8 Tris-HCL、30%甘油、2.5%碘乙酰胺)，平衡15 min。平衡结束后进行SDS-PAGE电泳，凝胶浓度为12%，15 mA电泳0.5 h，30 mA电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。采用改良的考马斯亮蓝G250染色法对凝胶进行染色脱色。脱色结束后使用扫描仪对凝胶进行扫描，使用PDQuest软件进行凝胶分析，将灰度值大于2倍的点视为差异表达蛋白。
1.5 质谱分析及生物信息学分析用1 mL枪头挖去蛋白点放入EP管中。加入脱色液100 μL浸泡，振荡20 min，弃去溶液，重复1~2次直至蓝色褪尽, 加入乙腈100 μL, 弃废液。冰冻干燥20 min，加入20 μL酶液 (0.01 μg·μL-1)，4 ℃放置30 min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液 (25 mmol·L-1 NH4HCO3) 15 μL，使胶完全浸没，37℃保温15 h以上或过夜。加提取液I (5% TFA) 100 μL, 40 ℃加热水浴1 h，30 min时，超声3 min左右。将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取液Ⅱ (50%乙腈，2.5% TFA) 100 μL, 30℃保温1 h，30 min时，超声3 min。将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。加入5 μL左右的0.1% TFA溶液混匀，用于质谱分析。使用MALDI-TOF-TOF的方法进行质谱分析，得到肽指纹图谱 (PMF) 使用Mascot进行数据库搜索。
使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) 对鉴定到的蛋白进行GO和KEGG富集分析，分析结果使用R语言进行绘图。使用STRING (http://string-db.org/) 构建蛋白相互作用网络。
2 结果 2.1 鹿茸腊片、血片、骨片部位双向电泳图谱凝胶经扫描仪扫描后，使用PDQuest图像分析软件分析图谱，3个样品每个样品两次重复，共6块胶。每块胶平均检测到800个左右的蛋白点。图 2为不同部位双向电泳图谱。鹿茸腊片部位、血片部位、骨片部位共检测到69个差异蛋白点。
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A.腊片；B.血片；C.骨片。图中数字标出的点为鉴定蛋白质点 A.Lapian; B.Xuepian; C.Gupian. The marked spots by numbers are identified proteins 图 2 梅花鹿鹿茸蛋白质2-DE图谱 Figure 2 2-DE proteome profile of velvet antler of sika deer at different parts |
经过酶解、质谱分析、搜库，共鉴定了37个差异表达蛋白 (表 1)，其鹿茸腊片、血片、骨片组织中分别有18、5与14个蛋白质表达上调，18个鹿茸腊片部位表达上调蛋白分别为：点L1-L2、L9-L23、G10，5个鹿茸血片部位表达上调蛋白分别为：点L3、L6、X1-X3，14个鹿茸骨片部位表达上调蛋白分别为：点L4-L5、L7-L8、G1-G9、G11，差异蛋白聚类结果见图 3。对鉴定到的蛋白进行GO功能注释，分别有27、28、28个蛋白注释到各生物学过程、亚细胞组分和分子功能 (图 4)。生物学过程分类包括多细胞生物体发生、解毒、细胞成分组织或生物发生、细胞聚集、定位、对刺激的反应、生物粘附、发育、单一生物体发生、免疫系统；亚细胞定位显示差异蛋白主要在细胞外基质富集。分子功能包括结构分子活性、抗氧化活性、转运活性。
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表 1 鉴定成功蛋白点数据 Table 1 The data of protein spots successfully identified |
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图 3 差异蛋白质层次聚类分析 Figure 3 Hierarchical clustering of significant differentially expressed proteins |
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图 4 差异蛋白质GO功能分类 Figure 4 GO functional categories of the differentially expressed proteins |
对差异蛋白进行KEGG信号通路富集分析，有20个蛋白8条通路得到富集, 按照P值由低到高的顺序分别为：血小板激活 (Platelet activation：FGG, FGB, MYL12B, COL2A1, COL1A1, COL11A1), 心肌收缩 (Cardiac muscle contraction：TPM2, TPM1, TPM4), 黏着斑 (Focal adhesion：MYL12B, COL2A1, COL1A1, COL11A1), 肥厚型心肌病 (Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)：TPM2, TPM1, TPM4), 扩张型心肌病 (Dilated cardiomyopathy：TPM2, TPM1, TPM4), 细胞外基质受体相互作用 (ECM-receptor interaction：COL2A1, COL1A1, COL11A1), 蛋白质消化吸收 (Protein digestion and absorption：COL2A1，COL1A1，COL11A1), 阿米巴病 (Amoebiasis：COL2A1, COL1A1, COL11A1)。
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表 2 差异蛋白的KEGG富集分析 Table 2 KEGG analysis of the differentially expressed proteins |
37个差异蛋白中有26个存在相互作用，两两之间形成35种连接，如图 5。其中，ALB、PHB、TUBA1A、MYL12B、TTR、TNC 6个蛋白连接度较高，属于网络中的关键节点。
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图 5 差异蛋白质相互作用网络 Figure 5 Protein interaction network of the differentially expressed proteins |
鹿茸具有惊人的生长速度，鹿茸尖部细胞不断分裂增殖分化，而中下部细胞不断骨化。本研究对鹿茸从尖端到底端的腊片部位、血片部位、骨片部位的组织进行差异蛋白筛选，共得到37个差异表达蛋白。
18个蛋白在鹿茸蜡片部位表达上调。其中微管蛋白、肌球蛋白等细胞骨架蛋白以及胶原蛋白等骨基质蛋白在鹿茸蜡片部位表达量显著上调可能与软骨细胞快速分裂增殖有关。另外，转录延伸因子EFB1在蜡片部位表达量显著上调，是骨片部位的11倍，血片部位的3倍，转录延伸因子主要参与蛋白多肽链的合成，可能参与调控鹿茸快速生长过程中的大量蛋白质合成过程。视黄酸结合蛋白CRABP 1在鹿茸腊片部位表达上调，视黄酸结合蛋白属于维甲酸调节基因，在维生素A介导的信号通路中具有重要的调节作用，维生素A进入细胞后与视黄醇结合蛋白结合，并被水解为视黄酸，视黄酸经由视黄酸结合蛋白的运输进入细胞核，视黄酸主要调节胚胎时期骨的发育和上皮代谢[13]。S.P.Allen等证明，在鹿茸生长的各个阶段在茸尖部位都有大量的视黄酸存在，视黄酸对鹿茸骨组织形成过程中的细胞分化具有重要的调节功能[14]。因此推测，CRABP 1在鹿茸腊片部位表达上调，可能与鹿茸茸尖部位的细胞快速分裂增殖、鹿茸快速生长相关。研究表明，Tetranectin蛋白在鲨鱼的软骨中富集，它可能参与组织重塑过程中的纤维蛋白溶解和蛋白水解[15]，可能参与哺乳动物的成骨过程[16]。本研究首次在鹿茸中鉴定到Tetranectin蛋白，其在鹿茸腊片部位表达上调，可能在鹿茸生长过程中具有一定作用，但具体在鹿茸生长过程中的功能和作用机制尚需要进一步的研究。
14个蛋白在鹿茸骨片部位表达上调。其中载脂蛋白A1(APOA1)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4) 等与脂肪相关的蛋白在鹿茸骨片部位表达量显著上调，其中APOA1的表达量是蜡片部位的20倍，推测鹿茸可能以脂蛋白介导的骨矿化机制进行骨化。骨矿化即在骨组织的细胞外基质中出现磷酸钙沉积，骨矿化的机制主要有两种，一种是基质小泡介导的矿化基质[17]，基质小泡是一种细胞外的膜状细胞器，其膜上具有钙离子、磷酸根离子转运通道，钙离子和磷酸根离子先进入基质小泡形成矿物晶体，然后离开基质小泡在胶原纤维上沉积[18-19]；一种是脂蛋白介导的矿化机制[20]，脂蛋白可与胶原蛋白结合，覆盖在胶原蛋白表面，使原本带正电的胶原蛋白提供负电的结合位点，不断结合钙离子而沉积。鹿茸骨片部位高表达的载脂蛋白、脂肪酸结合蛋白可以提供大量的脂蛋白，加速骨的矿化过程。另外，在鹿茸血片部位表达上调的ATP酶可能通过水解作用为骨片部位的骨矿化提供必须的磷酸。转甲状腺素蛋白 (TTR) 在鹿茸骨片部位表达上调，它主要参与甲状腺素及视黄醇的转运[21]。它对骨的发育和矿化也是必不可少的，能显著影响成骨细胞和破骨细胞的正常生理活动，甲状腺功能缺陷通常会导致骨质疏松及骨发育不全等。在鹿茸骨片部位高表达，推测可能在鹿茸的骨矿化中起重要调节作用。
4 结论本研究通过蛋白质组学技术对梅花鹿鹿茸不同部位 (腊片部位、血片部位、骨片部位) 进行了差异表达蛋白鉴定，并结合鹿茸腊片部位快速生长而骨片部位快速骨化的独特生长过程，对差异表达蛋白质做了进一步分析，并发现EFB1、CRABP 1蛋白在鹿茸的快速生长中起重要调控作用，而载脂蛋白A1、脂肪酸结合蛋白4、转甲状腺素蛋白在鹿茸的快速骨化中起重要的调控作用，为鹿茸生长与骨化机制的进一步研究奠定了基础。
| [1] | GOSS R J. Deer antlers: regeneration, function and evolution[M]. Salt Lake: Academic Press, 2012. |
| [2] |
王艳梅. 东北梅花鹿茸主要成分系统性比较研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2004.
WANG Y M. A systematic comparative study of main chemical composition of northeast sika deer (Cervus nippon hortulorum) velvet[D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2004. (in Chinese) |
| [3] | LI C Y, ZHAO H P, LIU Z, et al. Deer antler-a novel model for studying organ regeneration in mammals[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 56: 111–122. DOI: 10.1016/j.biocel.2014.07.007 |
| [4] |
张伟, 褚文辉, 李春义. 鹿茸成骨过程及其相关调控机制研究进展[J]. 中国农学通报, 2015, 31(8) :6–11.
ZHANG W, CHU W H, LI C Y. Recent progress on regulatory mechanisms of deer antler ossification[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(8): 6–11. DOI: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb14100088 (in Chinese) |
| [5] | PARK H J, LEE D H, PARK S G, et al. Proteome analysis of red deer antlers[J]. Proteomics, 2004, 4(11): 3642–3653. DOI: 10.1002/(ISSN)1615-9861 |
| [6] |
高亮, 乔晓强, 梁振, 等. 基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析[J]. 色谱, 2010, 28(2) :146–151.
GAO L, QIAO X Q, LIANG Z, et al. Application of on-line two-dimensional liquid chromatography in comparative proteome analysis of antlers with different growing stages[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(2): 146–151. (in Chinese) |
| [7] | SUI Z G, ZHANG L H, HUO Y S, et al. Bioactive components of velvet antlers and their pharmacological properties[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 87: 229–240. DOI: 10.1016/j.jpba.2013.07.044 |
| [8] |
王权威. 鹿茸再生干细胞膜蛋白质组研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016.
WANG Q W. Membrane proteome of antler regeneration stem cells[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016. (in Chinese) |
| [9] |
靳梦亚, 董玲, 罗元明, 等. 利用iTRAQ技术联合2D LC-MS研究不同加工工艺鹿茸的差异蛋白质组学[J]. 药学学报, 2015, 50(12) :1637–1644.
JIN M Y, DONG L, LUO Y M, et al. Comparative proteomics study of different processing technology for pilose antler using iTRAQ technology coupled with 2D LC-MS[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2015, 50(12): 1637–1644. (in Chinese) |
| [10] |
董振, 王权威, 刘振, 等. 梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白表达的2D-DIGE分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(1) :92–104.
DONG Z, WANG Q W, LIU Z, et al. Analysis of differentially expressed proteins in the potentiated and dormant antler stem cells through 2D-DIGE[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(1): 92–104. (in Chinese) |
| [11] |
赵东. 梅花鹿鹿茸双向电泳体系建立及蛋白质组学的研究[D]. 镇江: 江苏科技大学, 2012.
ZHAO D. Establishment of two-dimensional electrophoresis system and proteome analysis of Sika deer antler[D]. Zhenjiang: Jiangsu University of Science and Technology, 2012. (in Chinese) |
| [12] |
张然然, 刘华淼, 邵元臣, 等. 不同生长时期梅花鹿鹿茸差异蛋白质组学分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(3) :493–501.
ZHANG R R, LIU H M, SHAO Y C, et al. Comparative proteomic analysis in different growth stages of Sika deer velvet antler[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(3): 493–501. (in Chinese) |
| [13] |
查晓军. TSC 1/TSC 2失活上调LDHB与下调CRABP 1的机制与功能[D]. 北京: 北京协和医学院, 2010.
ZHA X J. The mechanisms and functions of up-regulation of LDHB and down-regulation of CRABP1 by loss of TSC1/TSC2 complex[D]. Beijing: Peking Union Medical College, 2010. (in Chinese) |
| [14] | ALLEN S P, MADEN M, PRICE J S. A role for retinoic acid in regulating the regeneration of deer antlers[J]. Dev Biol, 2002, 251(2): 409–423. DOI: 10.1006/dbio.2002.0816 |
| [15] | NEAME P J, YOUNG C N, TREEP J T. Primary structure of a protein isolated from reef shark (Carcharhinus springeri) cartilage that is similar to the mammalian C-type lectin homolog, tetranectin[J]. Protein Sci, 1992, 1(1): 161–168. |
| [16] | WEWER U M, IBARAKI K, SCHJØRRING P, et al. A potential role for tetranectin in mineralization during osteogenesis[J]. J Cell Biol, 1994, 127(6): 1767–1775. DOI: 10.1083/jcb.127.6.1767 |
| [17] | GOLUB E E. Role of matrix vesicles in biomineralization[J]. Biochim Biophys Acta, 2009, 1790(12): 1592–1598. DOI: 10.1016/j.bbagen.2009.09.006 |
| [18] | ANDERSON H C, GARIMELLA R, TAGUE S E. The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization[J]. Front Biosci, 2005, 10(1-3): 822–837. DOI: 10.2741/1576 |
| [19] | GOLUB E E. Biomineralization and matrix vesicles in biology and pathology[J]. Semin Immunopathol, 2011, 33(5): 409–417. DOI: 10.1007/s00281-010-0230-z |
| [20] | XU S H, YU J J. Beneath the minerals, a layer of round lipid particles was identified to mediate collagen calcification in compact bone formation[J]. Biophys J, 2006, 91(11): 4221–4229. DOI: 10.1529/biophysj.105.075804 |
| [21] |
彭晨, 王子安. 转甲状腺素蛋白在临床肿瘤中的研究进展[J]. 中华全科医学, 2014, 12(1) :122–123, 156.
PENG C, WANG Z A. Research progress of Transtgyretin in oncology abstract[J]. Chinese Journal of General Practice, 2014, 12(1): 122–123, 156. (in Chinese) |