2. 西南民族大学, 动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室, 成都 610041;
3. 西南民族大学, 青藏高原生态保护与畜牧业高科技研究示范基地, 成都 610041
2. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China;
3. Environmental Protection and Sustainable Development of Animal Husbandry on the Qinghai-Tibet Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China
生长激素 (Growth hormone, GH)、生长激素受体 (Growth hormone receptor, GHR) 和生长激素促分泌素受体 (Growth hormone secretagogue receptor, GHSR) 是机体生长发育的重要调控因子[1-3]。其中，生长激素 (GH) 具有促进生长、调节物质代谢、影响生殖和免疫等生物学功能，主要体现在促进骨和肌肉等组织细胞的增殖和分化。生长激素受体 (GHR) 大量存在于肝组织中[4]，组织中GHR含量的多少与生长激素 (GH) 生理作用的发挥密切相关，同时GHSR可以刺激GH释放和分泌，从而影响机体的生长发育。
近年来，对不同家畜GH、GHR、GHSR基因多态性与相关性状的关联性分析也进行了大量报道。李军[5]研究发现，荷斯坦牛GH基因第5外显子上G等位基因对生长性能具有正向选择作用。牛志刚等[6]发现，新疆褐牛GH/AluⅠ位点L等位基因可能对早期生长发育具有正效应。宋桃伟等[7]报道了贵州白山羊和黔北麻羊GHSR基因A996G位点可能是提高山羊体重的重要分子遗传标记。胡怡菲[8]报道秦川牛GHR基因第8外显子T4962A与其胸围显著相关。近年来，利用遗传标记技术对牦牛GH、GHR、GHSR基因多态位点的筛查也进行了广泛研究。白晶晶[9]利用PCR-SSCP技术，对甘南牦牛、天祝白牦牛和青海高原牦牛GH基因5个外显子及部分内含子序列进行SNPs分析，在第3内含子1 694 bp处发生T→C转化，检测到AA、AB、BB 3种基因型；其中甘南牦牛第5外显子2 154 bp处A→G单碱基突变，导致由甘氨酸 (Gly) 变为丝氨酸 (Ser)；天祝白牦牛第5外显子2 373 bp处发现G→T单碱基突变，但未引起氨基酸变化；青海高原牦牛在此位点未发现多态性。张森[10]对5个牦牛群体GH、GHR基因进行了PCR-SSCP多态性及性状关联性分析，发现GH基因第3外显子存在一对等位基因A、B，其在1 417、1 425和1 558 bp处发生碱基C→T突变，且该突变与牦牛体重显著相关；第5外显子2 379 bp处发生G→T突变，该突变位点对牦牛的生长发育指标无显著影响；在牦牛GHR基因第5外显子上发现147 939 bp处碱基G→A突变，最小二乘线性分析其与牦牛体重相关。
麦洼牦牛是列入《中国牛品种志》我国青藏高原型草地牦牛的优良地方品种之一，具有适应性强、遗传稳定、产奶量高等特性，是我国牦牛遗传资源宝库中珍贵的种质资源。麦洼牦牛粉嘴 (嘴唇为白色) 和纯黑 (通体黑色) 群体是通过毛色选育的优良品系，在生长性状指标测定时发现纯黑个体部分体尺性状优于粉嘴个体。近年来，受青藏高原自然生态环境的限制，以及多年来管理经营粗放、良种体系不健全、牧民商品意识淡薄和以自然交配为主等诸多不利因素的影响，致使牦牛表现出体格变小、体重下降、繁殖率低、抗病力弱、死亡率高等生产性能“退化”征候，严重制约牦牛业快速、高效的发展。因此，提高牦牛生产水平成为了育种工作的重中之重。本研究通过对麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因进行多态性检测，希望能进一步了解其候选基因多态位点与体尺性状间的关联性，以期为提高牦牛发育和优化选育体系提供初步的科学理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物在四川省阿坝藏族羌族自治州红原县龙日种畜场，选取年龄在2~3岁，且饲养和放牧方式相同的健康雌性麦洼牦牛100头 (粉嘴50头，纯黑50头)。采集耳组织放入75%乙醇保存带回实验室，-80℃保存备用。同时测定其体高、体斜长、胸围、管围、体重等体尺指标。试验在西南民族大学青藏高原研究院动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室完成。
1.2 基因组DNA提取及检测采用动物组织基因组DNA提取试剂盒 (天根生物技术有限公司) 提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的纯度和浓度，-20 ℃保存备用。
1.3 DNA池的构建利用分光光度计分3次测定DNA样品浓度，取其平均值，再分别稀释至50 ng·μL-1。100个DNA样品各取5 μL混合，4℃环境下静置24~48 h。
1.4 引物设计和PCR扩增 1.4.1 DNA池测序根据GenBank中公布的牦牛GH基因序列 (No.: AY271297.1)，针对5个外显子及部分内含子设计特异性引物4对；GHR基因序列 (No.: AM161140.1) 针对第2~10外显子及部分非编码序列设计11对特异性引物；GHSR基因 (No.: AB492175.1) 分别扩增5′-UTR、第1、2外显子及部分非编码序列，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表 1)。
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表 1 扩增麦洼牦牛GH、GHR和GHSR基因的引物序列 Table 1 Primer amplifying GH, GHR and GHSR genes in Maiwa yak |
PCR反应条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，退火温度 (表 1) 退火35 s，72℃延伸45 s，共35个循环；最后72℃延伸6 min，4℃保存备用。
PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒 (TaKaRa) 进行纯化、回收，将纯化产物送往英潍捷基 (上海) 生物科技有限公司进行双向测定。
1.4.2 SNP位点的筛查和检测GH、GHSR基因分别利用DNAMAN5、BioEdit7.0.5软件对扩增序列与参考序列进行比对并查找双峰 (突变位点)。利用直接测序法检测筛查的双峰位点，利用以上软件对所测序列进行校正、比对，判定基因型。
GHR基因酶切体系根据限制性内切酶HinfⅠ和Hind Ⅲ的使用说明书和酶切效果设计，酶切体系20 μL：PCR产物7 μL，Buffer 2 μL，Hinf Ⅰ/Hind Ⅲ1 μL，ddH2O 10 μL。酶切反应时间，Hinf Ⅰ、Hind Ⅲ酶切体系均在37℃下消化过夜，2%琼脂糖凝胶电泳检测判定基因型，并对纯合基因型个体进行测序。
1.5 数据分析根据SNP位点的检测结果，统计不同基因型个体数量。利用PIC_CALC、Popgen32、SPSS17.0等软件分析等位基因频率、基因型频率、SNP位点的多态信息含量、有效等位基因数、基因纯合度、基因杂合度、Hardy-Weinberg平衡检测及与体尺性状的关联性。
2 结果 2.1 GH、GHSR基因的多态性分析 2.1.1 GH基因SNPs位点的筛查与检测经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增条带单一明亮 (图略)，基因组DNA提取效果较好，可进行后续试验。
按照所设计引物进行PCR扩增，将扩增产物直接测序，GH-P1目的片段长度为670 bp，与理论值相符。通过峰图及序列比对筛查SNP位点，首次在GH基因第1内含子中获得2个SNPs位点 (A757G、T949C)，利用DNAMAN5.0生物软件对所测序列进行分析，判定个体基因型 (图 1a)。其中，A757G位点存在AA、GG和AG 3种基因型；T949C位点存在TT、CC和TC 3种基因型。
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图 1 麦洼牦牛GH-P1(a) 和GHSR-P1、GHSR-P3(b) 片段SNPs位点测序图谱 Figure 1 Sequencing of SNPs sites in GH-P1(a) and GHSR-P1, GHSR-P3(b) fragments of Maiwa yak |
电泳检测结果显示，GHSR-P1片段大小为699 bp，GHSR-P3片段大小为626 bp，GHSR-P1和GHSR-P3中分别筛查到1个SNP位点。序列比对发现，GHSR-P1片段上的T1387C位点位于5′-UTR，存在TT、TC和CC 3种基因型；GHSR-P3片段上的T3006C位点位于第1外显子，其中在纯黑类群中存在TT、TC和CC 3种基因型，粉嘴类群仅检测到TC和CC 2种基因型 (图 1b)。
2.1.2 等位基因频率与基因型频率GH-P1扩增片段中2个SNPs位点 (A757G和T949C) 在麦洼牦牛粉嘴和纯黑2个类群中的等位基因及基因型频率见表 2。结果表明，A757G位点中，杂合基因型AG在2个类群中的分布频率为0.52和0.56，均表现为优势基因型；等位基因A在2个类群中的分布频率分别为0.52和0.64，为优势等位基因。T949C位点中，杂合基因型TC在2个类群中的分布频率为0.52和0.56，表现为优势基因型；等位基因T在2个群体中的频率分别为0.52和0.64，为优势等位基因。
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表 2 麦洼牦牛GH、GHSR基因SNPs位点等位基因及基因型频率 Table 2 Frequency distributions of alleles and genotypes of SNP sites in GH and GHSR genes in Maiwa yak |
GHSR基因T1387C位点中，CC基因型在麦洼牦牛2个类群中均为优势基因型，等位基因C的频率分别为0.72(粉嘴) 和0.65(纯黑)，为优势等位基因。T3006C位点的CC基因型在2个类群中均为优势基因型，且在粉嘴类群中未检测出TT基因型，出现严重偏态，原因可能与选择、基因突变有关。等位基因T、C在粉嘴类群和纯黑类群中的分布频率存在差异，后者在2个类群中均占优势地位，其分布频率为0.88和0.85。
2.1.3 群体遗传多态性及χ2适合性检验由表 3可知，GH基因A757G和T949C位点在2个类群中均处于中度多态 (0.25＜PIC＜0.5)，表明其遗传变异程度较大。2个SNPs位点的有效等位基因数 (Ne) 在粉嘴类群和纯黑类群中均接近2，推测等位基因在麦洼牦牛2个类群中分布较均匀。此外，纯黑类群的基因杂合度均高于粉嘴类群。
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表 3 麦洼牦牛GH、GHSR基因SNPs位点的遗传多态性 Table 3 Genetic polymorphism of SNP sites of GH and GHSR genes in Maiwa yak |
GHSR基因中T1387C位点在麦洼牦牛2个类群中均处于中度多态 (0.25＜PIC＜0.5)，而T3006C位点在2个类群中均处于低度多态 (PIC＜0.25)，表明麦洼牦牛在该位点的遗传纯度较高、基因交流较少。在2个SNPs位点中，粉嘴类群的基因杂合度均高于纯黑类群的基因杂合度，推测这可能与粉嘴类群受人工选育程度更高有关。
GH基因2个SNPs位点、GHSR基因T1387C位点在粉嘴和纯黑2个类群的χ2值均未达显著水平，处于遗传平衡状态 (P>0.05)，推测可能经长期进化选择，在适应性方面具有明显的遗传优势[11]，使其达到了遗传平衡状态；而T3006C位点在粉嘴类群处于Hardy-Weinberg平衡状态 (P>0.05)，而在纯黑类群偏离平衡状态 (P＜0.05)，表明选择、基因突变等对该位点有较大影响，可能受到的选择压力较大。
2.1.4 关联性分析采用SPSS17.0生物软件并建立最小二乘线性模型分析GH、GHSR基因多态位点不同基因型与麦洼牦牛体高、体斜长、胸围、管围和体重等生长性状的相关性。由表 4可知，GH基因A757G、T949C位点的各基因型与生长指标均差异不显著 (P>0.05)。
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表 4 麦洼牦牛GH和GHSR基因多态位点对体尺性状的影响 (平均数±标准误) Table 4 Effects of polymorphisms of GH and GHSR genotypes on growth traits in Maiwa yak (Mean±SE) |
GHSR基因T1387C位点不同基因型个体间体重指标存在显著差异，其中CC、TC基因型个体的平均体重分别为244.66和229.82 kg，前者比后者高14.84 kg，差异显著 (P＜0.05)，显示牦牛GHSR基因可能是影响体重的重要功能基因之一，该标记可作为研究牦牛生长情况的重要遗传标记，应用于牦牛的育种改良。而T3006C位点不同基因型间无统计学差异。
2.2 麦洼牦牛GHR基因的遗传多态性 2.2.1 GHR基因SNPs的筛查和检测将PCR产物直接测序，在特异性片段GHR-P4、GHR-P5和GHR-P10中共筛查到3个突变位点。GHR-P4片段的T2416C位点和GHR-P10的A7500G位点分别位于第5和第10外显子，GHR-P5片段的T3490C位点位于第6内含子。利用DNASTAR生物软件分析可知，T2416C位点和A7500G位点的突变均未导致氨基酸变化，属于同义突变。
GHR-P4扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，与目的片段 (401 bp) 大小一致，表明扩增成功。用BioEdit7.0.5对测序结果进行分型 (图 2)，GHR-P4片段的T2416C位点有3种基因型，即TT、TC和CC型，表现出多态性。
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图 2 麦洼牦牛GHR-P4片段SNP位点测序图谱 Figure 2 Sequencing of SNP in GHR-P4 fragment in Maiwa yak |
GHR-P5扩增产物用限制性内切酶Hinf Ⅰ消化酶切，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳检验，GHR-P5片段的T3490C位点存在TT (207 bp)、CC (75 bp/132 bp)、TC (75 bp/132 bp/207 bp)3种基因型 (图 3)，表现出多态性。
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图 3 麦洼牦牛GHR-P5扩增片段HinfⅠ酶切 Figure 3 The Hinf Ⅰ-RFLP results in GHR-P5 amplifying fragment in Maiwa yak |
GHR-P10片段PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验，扩增片段与理论值 (630 bp) 相符，且条带清晰、特异性好。扩增产物用限制性内切酶Hind Ⅲ消化酶切，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检验，表明GHR-P10片段上的A7500G位点有AA (303 bp/327 bp)、GG (630 bp)、AG (303 bp/327 bp /630 bp)3种基因型 (图 4)。
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图 4 麦洼牦牛GHR-P10扩增片段Hind Ⅲ酶切 Figure 4 The Hind Ⅲ-RFLP results of GHR-P10 amplifying fragment in Maiwa yak |
GHR基因3个SNPs位点等位基因及基因型在麦洼牦牛粉嘴和纯黑2个类群中的分布频率见表 5。结果表明，T2416C位点中TT、TC和CC基因型在粉嘴类群的分布频率为0.06、0.54和0.40，TC型为优势基因型；3种基因型在纯黑类群的分布频率为0.06、0.40和0.54，CC型为优势基因型。等位基因C在粉嘴和纯黑2个类群中的分布频率分别为0.67和0.74，为优势等位基因。T3490C位点中，TC基因型个体在粉嘴类群中为优势基因型；而纯黑类群中优势基因型为TT型。2个类群在该位点的优势等位基因均为T。A7500G位点中，粉嘴类群的优势基因型为AG，其基因型频率为0.56；纯黑类群的优势基因型为AA，其基因型频率为0.52，等位基因A为2个类群的优势等位基因。表明麦洼牦牛2个类群间有较大的遗传差异，这是2个品系形成的基础。
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表 5 麦洼牦牛GHR基因SNPs位点等位基因及基因型频率 Table 5 Frequency distributions of alleles and genotypes of SNP sites in GHR gene in Maiwa yak |
麦洼牦牛GHR基因3个SNPs位点的群体遗传多态性见表 6。由表可知，3个SNPs位点在2个牦牛类群中均处于中度多态性 (0.25＜PIC＜0.5)，表明3个多态位点适合进行关联性分析及数量遗传座位的定位研究。有效等位基因数 (Ne) 表明3个多态位点的等位基因在麦洼牦牛类群中分布较均匀。在3个多态位点中，粉嘴类群的基因杂合度均高于纯黑类群，推测纯黑类群人工选育程度更高。
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表 6 麦洼牦牛GHR基因SNPs位点的遗传多态性指标 Table 6 Genetic polymorphism of SNP sites of GHR gene in Maiwa yak |
对GHR基因的T2416C、T3490C和A7500G位点进行卡方适合性检验。结果表明，在T2416C、T3490C位点中，粉嘴和黑嘴2个类群的χ2值均未达到显著水平，处于Hardy-Weinberg平衡状态 (P>0.05)。在A7500G位点中，纯黑类群处于平衡状态 (P>0.05)，而粉嘴类群偏离Hardy-Weinberg平衡 (P＜0.05)，其原因可能与人工选择、自然选择和基因突变等有关。
2.2.4 GHR基因多态性与麦洼牦牛生长性状的关联性麦洼牦牛GHR基因SNP位点不同基因型对体高、体斜长、胸围、管围和体重等指标的影响见表 7，结果表明，3个位点不同基因型个体间除管围指标存在差异外，其他生长指标均无统计学差异。在T2416C位点中，TT基因型个体的管围极显著高于TC、CC基因型 (P＜0.01)，而TC与CC型之间差异不显著；在T3490C位点中，CC基因型个体的管围极显著高于TC和TT基因型个体 (P＜0.01)；在A7500G位点中，GG基因型个体的管围极显著高于AA基因型 (P＜0.01)。结果显示，牦牛GHR基因可能是影响骨胳发育的重要功能基因之一，这3个标记可以作为研究牦牛生长情况的重要遗传标记，应用于牦牛育种中。
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表 7 麦洼牦牛GHR基因多态位点对体尺性状的影响 (平均数±标准误) Table 7 Effects of polymorphisms of GHR genotypes on growth traits in Maiwa yak (Mean±SE) |
GH、GHR及GHSR基因是影响动物生长发育的重要候选基因。同时，三者之间的互作协同作用、关联网状结构也得到了广泛关注。GH可通过JAK2途径、胰岛素受体底物途径 (IRS)、蛋白激酶C途径 (PKC) 与GHR结合[12]，再由GHR打开信号传导通路，将信号传导到细胞内产生生理效应。而生长激素促分泌素受体 (GHSR) 作为由下丘脑分泌的一种多肽，与其前体GHRL的结合能调节GH的分泌，从而影响机体的生长发育[13-14]。
本研究利用DNA池测序法，筛查了麦洼牦牛GH基因5个外显子及部分内含子序列的遗传多态性，结果发现，仅在第1内含子上存在A757G、T949C突变位点，而在其他外显子及内含子区域未检测到多态位点。这与潘和平[15]对天祝白牦牛和青海高原牦牛GH基因5个外显子及部分内含子进行SSCP多态性分析得到的仅在第3内含子和第5外显子存在SNP位点且多态性较低的结果存在差异，可能由于品种和遗传基础不同所致。而本研究结果与李永红等[16]对4个牦牛品种GH基因部分外显子及保守区域分析，发现第3外显子存在T183C突变，且该位点与体重显著相关，而在第5外显子中存在T64C突变，但此SNP位点与生长发育指标不相关的结果不同，同时也与张森[10]、何桦[17]、欧江涛等[18]及Y.X.Sun等[19]对牦牛GH基因外显子及内含子3区域检测到多态位点的研究结果不同，可能遗传起源，所处生态环境、社会经济条件及选育方法等因素均会造成研究结果的差异，此外与研究方法、试验牦牛数量及样品采集不具代表性均有关。在A757G位点中，A等位基因在试验类群中均表现为优势等位基因，在T949C位点中，T等位基因为优势等位基因，这可能是长期定向选育的结果。2个类群在A757G位点和T949C位点中均处于Hardy-Weinberg平衡状态，推测是人工选育、遗传漂变等因素对两个位点的影响较小，使其处于动态平衡。多态信息含量 (PIC) 是群体遗传变异程度的重要衡量指标。A757G位点中，麦洼牦牛粉嘴和纯黑类群的多态信息含量 (PIC) 分别为0.374 6、0.354 6，属于中度多态；T949C位点中，2个试验类群也均处于中度多态，表明麦洼牦牛这2个SNPs位点多态性较高，为今后选育利用提供了基础。相关性分析发现，A757G和T949C位点各基因型与所测性状无相关性，可能由于突变位点均位于内含子区，无功能性突变，与动物机体生长发育无直接相关。
GHSR具有调节生长激素分泌，摄食、能量代谢及生殖等生物学功能[19]。目前，对牦牛GHSR基因的研究主要集中在Ghrelin作为GHSR唯一内源性配体的相关性分析上，张娜[20]发现与Ghrelin通过其受体GHSR相互绑定直接互作协同参与机体能量代谢调控的基因有NPY、AgRP、GOAT、Insulin、GHRH和Leptin；同时GHSR基因在牦牛生殖及犏牛雄性不育方面也有相关研究[21]，而关于牦牛GHSR基因SNP位点与体尺性状的相关分析还未见报道。本研究发现，牦牛GHSR基因位于5′-UTR、第1外显子上的T1387C和T3006C突变中的T3006C位点的突变未导致氨基酸变化，属于同义突变。2个突变位点在麦洼牦牛2个类群中的优势基因型均为CC型；其中在T3006C位点，粉嘴类群没有检测到TT基因型，存在严重偏态，可能由于该品系为人工选育品系，存在长期人工定向选择所致。此外，T3006C位点的T等位基因在粉嘴和纯黑类群中的分布频率均较低，分别为0.12和0.15，其原因可能有两种：一是该突变为一个全新的突变，仅在少数个体中有分布；二是该突变是一个不利的突变，在人工选择和自然选择中逐渐被淘汰。T1387C位点在麦洼牦牛2个类群均处于Hardy-Weinberg平衡状态，建议在今后的选育过程中可通过打破其平衡状态来获取有意义的性状变异；T3006C位点在粉嘴类群处于Hardy-Weinberg平衡状态，而在纯黑类群偏离Hardy-Weinberg平衡状态，可能与纯黑类群受到的选择、遗传改良影响有关。关联性分析显示，T1387C位点的CC型个体体重显著高于TC型个体，表明等位基因C是有利基因，对麦洼牦牛的体重增长具有正效应，可用于牦牛的改良选育，其原因可能是该多态位点与编码区或调控区的其他突变相连锁，对基因表达有正调控作用；也可能是由于突变影响了启动子活性从而影响了牦牛的生长性状。T3006C位点各基因型间不与任何性状相关，从总趋势来看，CC基因型个体对应性状值较高，其是否影响牦牛的生长发育还有待于进一步探讨。
利用DNA池技术，通过PCR-RFLP和直接测序法对麦洼牦牛GHR基因进行SNP筛查，结果在特异性片段GHR-P4上检测到SNP位点，GHR-P5和GHR-P10中发现HinfⅠ、Hind Ⅲ酶切位点，分别位于第5外显子2 416 bp处、第6内含子3 490 bp处和第10外显子7 500 bp处。3个SNPs位点在麦洼牦牛中均具有较高的杂合度，其有效等位基因数均接近2，等位基因在群体中分布较均匀。在麦洼牦牛GHR基因的T2416C位点中，TT基因型个体的管围极显著高于TC、CC基因型个体 (P＜0.01)，而TC型与CC型个体间差异不显著；在T3490C位点中，CC基因型个体的管围极显著高于TC和TT基因型个体 (P＜0.01)；在A7500G位点中，GG基因型个体的管围极显著高于AA基因型个体 (P＜0.01)，3个位点除与管围极显著相关外，与其他性状均无关联性，显示牦牛GHR基因也可能是影响骨胳发育的重要功能基因之一，张森[10]研究发现，牦牛GHR基因第1和第3外显子均存在酶切位点但不具有多态性，而在本研究中第1、3外显子区均未检出酶切位点，可能与试验所选牦牛群体不同有关。以上标记可作为研究牦牛生长情况的重要遗传标记应用于牦牛育种。
4 结论麦洼牦牛GH、GHR及GHSR基因均存在多态位点，且不同SNP位点在粉嘴和纯黑2个类群中的分布频率均有差异，粉嘴类群作为麦洼牦牛依据毛色进行选育的类群，在群体稳定性等方面较纯黑类群均存在差异。其中GHSR基因的T1387C位点与牦牛体重显著相关，GHR基因的T2416C、T3490C、A7500G位点与麦洼牦牛管围极显著相关，部分位点可以作为研究牦牛生长情况的重要遗传标记，应用于牦牛育种中。
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