, CHENG Long-fei, WAN Chun-he, FU Guang-hua, SHI Shao-hua, CHEN Hong-mei, LIU Rong-chang, CHEN Cui-teng, CHEN Zhen, ZHU Chun-hua, HUANG Yu
鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)又称小鹅瘟病毒，是我国学者方定一于1956年在我国扬州地区发现并首次报道，随后世界许多国家和地区均有陆续报道[1]。该病毒引起1月龄以下的雏鹅或雏番鸭出现急性肠炎、肝和心等实质脏器炎症，其发病率和死亡率高均可达100%，是严重危害养鹅(番鸭)业的重要传染病病原之一[2]。在2015年以前，该病的易感动物为雏鹅和雏番鸭，不感染半番鸭。然而，在2015年初，我国福建等地报道重组鹅细小病毒感染半番鸭、樱桃谷鸭和麻鸭，这打破了鹅细小病毒只感染鹅和番鸭的局势，其特征性临床症状为短喙和生长抑制，并未出现典型的Derasy症状[3-4]。至今，已报道鹅细小病毒对鹅胚和番鸭胚的致死率达100%、不感染致死鸡胚[5-6]，但目前GPV能否在半番鸭胚中垂直传播还未见报道。
在开展种鸭胚垂直传播病原的检测中，笔者于半番鸭胚中检测到GPV的存在，并在同批次胚蛋孵出的1日龄雏半番鸭中也检测到GPV的感染。本研究通过电镜观察、胶体金试验和病毒基因组序列分析等首次确定半番鸭胚与同批次孵出的1日龄雏半番鸭均携带GPV，且基因组序列相似性100%，并明确其基因组分子特征，这为进一步研究GPV的垂直传播及生态学特性提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料经检测无GPV及番鸭细小病毒母源抗体的10日龄番鸭胚和半番鸭胚购自福建省漳州某非免疫区的孵化场。GPV的胶体金试纸条由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室研制并保存；DNA/RNA抽提试剂盒购自QIAGEN公司；DL2000 DNA Marker、Fast Pfu DNA聚合酶和pEASY-Blunt载体购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 引物根据GenBank中登录的GPV经典毒株序列，并参照万春和等[7-8]的方法，设计6对引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表 1。
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表 1 GPV全基因组扩增引物序列 Table 1 The primers used to amplify complete genomic sequences of GPV |
无菌采集10日龄半番鸭胚尿囊液保存于-80 ℃，备用；同时无菌采集同批半番胚孵化后的1日龄雏半番鸭的肝、心和脾，按样品:PBS=1:3的比例，加入灭菌PBS缓冲液(pH 7.2)进行匀浆，样品冻融3次后，于4 ℃，8 000 r·min-1离心10 min后，取上清经0.22 μm滤器过滤后，经尿囊腔接种5枚无母源抗体的10日龄番鸭胚，每枚0.2 mL，37 ℃孵育，弃去24 h内死亡的胚，同时每日观察2次，5 d后将接种鸭胚放入4 ℃，过夜无菌收取尿囊液。经无菌检验后，以10日龄鸭胚继续传3代，无菌回收含病毒胚液，保存于-80 ℃。
1.4 胶体金试验检测用GPV的胶体金试纸条检测10日龄半番鸭胚内的尿囊液和1日龄雏半番鸭组织匀浆液，2 min后观察检测线和质控线颜色变化。质控线没有变红色，说明试纸条不能用；质控线变红色，检测线变红色，判为阳性结果；质控线变红色，检测线没有变红，判为阴性结果。
1.5 电镜观察收集经PCR鉴定为阳性的病毒液，参照文献[7]进行高速、超速离心等步骤纯化、浓缩后，以2%磷钨酸负染，透射电镜观察并拍照。
1.6 全基因组克隆与测序按照DNA/RNA抽提试剂盒说明书，分别提取半番鸭胚内收集的尿囊液和1日龄雏半番鸭组织匀浆液的DNA，以此作为PCR模板进行PCR反应，50 μL PCR反应体系: 10×Buffer 5 μL，dNTP (2.5 mmol·L-1) 4 μL，Fast Pfu DNA polymerase 1 μL(2.5 U·μL-1)，上游和下游引物各1 μL(20 pmol·L-1)，模板3 μL，用ddH2O补充体积为50 μL，分别参照文献[8]PCR反应条件进行目的产物的扩增。PCR产物胶回收后克隆到pMD18-T载体中，转化DH5α E. coli感受态细胞。菌液经PCR验证，阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序。
1.7 全基因组序列分析应用Lasergene v 7.1 DNAStar软件分别对分离于半番鸭胚内的病毒液和1日龄雏半番鸭组织的病毒液进行序列拼接得到全基因组序列。为了解分离的毒株与其他水禽细小病毒之间的进化关系，使用BLAST对所得序列进行同源序列比对，MEGA4.1构建了基于全基因、VP1和NS1基因的neighbor-joing(NJ)进化树。Simplot3.5.1软件对全基因组序列进行重组分析。所用病毒参考毒株及其GenBank登录号见表 2。
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表 2 水禽细小病毒全基因参考毒株 Table 2 Information of reference waterfowl parvovirus strains |
利用检测GPV的胶体金试纸条对半番鸭胚尿囊液和1日龄雏半番鸭组织匀浆液进行病原检测，结果显示，C线(质控线)上都出现条带，说明结果有效，且T线(检测线)出现条带，表明半番鸭胚尿囊液和1日龄雏半番鸭组织匀浆液中均检测到鹅细小病毒(图 1)。
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1.阳性对照；2.半番鸭胚尿囊液；3. 1日龄雏半番鸭组织匀浆液；4.阴性对照 1. Positive control; 2. Allantoic fluid of mule duck embryos; 3. Tissue homogenate of 1-day-old mule duckling; 4. Negative control 图 1 胶体金试纸条检测结果 Figure 1 The colloidal gold test results |
将盲传至第4代的鸭胚尿囊液病毒，经纯化和浓缩、2%磷钨酸负染后，在透射电镜下观察到病毒粒子呈球形、无囊膜，其粒子直径为20~24 nm，具有典型GPV的形态特征(图 2)。
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图 2 分离病毒负染电镜照片 Figure 2 Negative stain electron microscopic image of MDE strain |
测序结果经Lasergene v 7.1 DNAStar软件拼接后获得5 016 bp(GenBank基因登入号MF438102)，序列分析发现分离于10日龄半番鸭胚尿囊液和1日龄雏半番鸭组织匀浆液中病毒均为GPV，且基因组相似性达100%，因此视为同一株病毒，命名为MDE株。该株病毒核酸由ITR、NS和VP1构成，其中5′和3′端ITR长为444 bp，可折叠形成“U”形双链发夹结构，外形如“箭”状的发夹结构，其包含181 bp的无错配“茎”部和1个44 bp的“泡”区，在其箭头上有一个Sph Ⅰ限制性内切酶的酶切位点(GCATGC)；在ITR前有个含Poly(A)的尾。该毒株基因组左侧编码非结构蛋白NS(NS1和NS2)，为1 884 bp，右侧编码的结构蛋白基因VP(编码VP1、VP2和VP3)，为2 199 bp。NS1(537~2 420 bp)编码的蛋白质长度为627个氨基酸(amino acid, aa)，NS2(1 065~2 420 bp)编码的蛋白质长度为451个aa；VP1(2 439~4 637 bp)编码VP1蛋白长度为732 aa，VP2(2 874~4 637 bp)编码的VP2蛋白长度为587个aa，VP3(3 033~4 637 bp)编码的VP3蛋白长度为534个aa，这些都具有GPV基因组的结构特征。
2.4 分离株全基因组特征分析将MDE株病毒全基因组与其他16株水禽细小病毒全基因组的核苷酸序列进行比对，结果表明全基因组核苷酸序列相似性为93.2%~98.1%，其中与SH株和GDaGPV株的相似性最高，与半番鸭源的重组GPV M15株相似性最低，同时与GPV经典株B的相似性为95.6%，而与MDPV的经典毒株FM的相似性为81.3%。应用MEGA4.1软件，以MDPV代表株(FM)为对照，绘制全基因组遗传进化树，从遗传进化关系可以看出，GPV可以分成两大亚群(GPV-Ⅰ和Ⅱ)，GPV-Ⅰ又分成两个小亚群(GPV-Ⅰa和GPV-Ⅰb)，其中MDE独立处于GPV-Ⅰa小分支上，且与亚洲疫苗株SYG61v等关系较近；GPV-Ⅰb又分成两个小分支，分别为中国大陆株与中国台湾株和欧洲株；同时半番鸭源GPV M15株独立形成GPV-Ⅱ亚群(图 3)。
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图 3 MDE株全基因组序列进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of genome of MDE isolate |
比较ITR序列结果显示，MDE株与SH株和疫苗株GDaGPV在ITR区都为444 bp，而其他GPV毒株在ITR区长度不等，其中GPV代表株B株为444 bp，疫苗株SYG61v为442 bp，M15株为404 bp。结果表明不管是GPV强毒株、弱毒株还是疫苗株的ITR长度均不等，即长度大小没有规律性。尽管ITR长度有所不同，但都能形成GPV典型的“U”形双链发夹结构。
2.6 分离株与其他GPV VP1的序列分析将MDE株VP1基因序列与GenBank中下载的GPV VP1进行核苷酸相似性比较。结果表明与大陆疫苗株SYG61v的VP1核苷酸序列相似性最高(达96.2%)，与重组株M15的相似性最低(为94%)，而与MDPV FM株VP1核苷酸相似性仅为81%。比较MDE株VP1与其他GPV VP1氨基酸序列相似性，MDE株与疫苗株SYG61v的VP1氨基酸序列相似性最高(98.4%)；与疫苗株SYG61v比较，共存在12处氨基酸发生突变，分别为L207M、A210S、S261A、T265N、S450N、L476F、K523E、V524G、L573I、T583S、Y637H和D703N；但与同为半番鸭源的M15株的氨基酸相似性最低(96.9%)，氨基酸突变区主要分布在28—49 aa、89—149 aa、656—718 aa区段；同时与代表株B株的相似性为97.3%，共有17处氨基酸发生突变；与MDPV FM株VP1核苷酸相似性为86.6%。
应用MEGA4.1软件，以MDPV代表株(FM)为对照，绘制结构蛋白VP1核苷酸序列遗传进化树，从遗传进化关系可以看出，GPV明显分成两大亚群，MDE株与欧洲株和所有的亚洲株均处于GPV的一大亚群(GPV-Ⅰ)，但处于一个独立的分支(GPV-Ⅰb)；重组GPV分离株M15为GPV另一亚群(GPV-Ⅱ)(图 4)。
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图 4 MDE株的VP1基因核苷酸序列进化树 Figure 4 Phylogenetic tree of VP1 gene of MDE isolate |
MDE株非结构蛋白NS1与其他的15株GPV NS1相比较，NS1核苷酸序列相似性为93.7%~99.5%，氨基酸序列相似性为95.4%~99.5%；其中核苷酸和氨基酸序列均与SH株的相似性最高，与重组GPV M15株相似性最低。以番鸭细小病毒代表株FM为对照，绘制非结构蛋白NS1核苷酸序列遗传进化树，从遗传进化关系可以看出，GPV在NS1基因可以分为两个明显的基因亚群(GPV-Ⅰ和Ⅱ)，MDE株与我国疫苗毒株同一小分支(GPV-Ⅰ)，而鹅细小病毒匈牙利株(B株)、欧洲疫苗株(VG32/1)、中国大陆株和中国台湾株均处在另一亚群的分支上(GPV-Ⅱ)，而重组分离株M15同处于这亚群的另一分支上(GPV-Ⅱb)(图 5)。
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图 5 MDE株的NS1基因核苷酸序列进化树 Figure 5 Phylogenetic tree of NS1 gene of MDE isolate |
利用在线软件NetNGlyc 1.0 Server对MDE株和GenBank公布的17株鹅细小病毒分离株的VP1蛋白糖基化位点进行预测，结果表明，GPV毒株最多存在6个糖基化位点，分别为219NASG、331NLTS、582NTTT、700NFSN、703NRTS和712NETG。MDE株与分离株(B、SH、SDLC01和QH15株)存在的糖基化位点和可能发生糖基化的位点均一致，共有6个糖基化位点和3个可能发生糖基化的位点。与Y和E等分离株为同一进化分支的GPV毒株均不存在703NRTS糖基化位点。2015年后分离的重组GPV毒株，如M15、SDLC01和QH15株，均存在703NRTS潜在糖基化位点，宿主也由原来的鹅或番鸭变成了半番鸭、樱桃谷鸭和麻鸭。MDE株的宿主为半番鸭胚，其VP1区也存在703NRTS潜在糖基化位点(表 2)。
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表 2 GPV VP1区潜在糖基化的分析结果 Table 2 The deduced glycosylation sites in VP1 protein of GPV |
利用Simplot 3.5.1软件对MDE株全基因组进行重组分析，结果表明，MDE株未发生重组现象，GPV M15株在VP3区段发生重组。因此，该毒株不是重组毒株，属于经典GPV毒株，不同于半番鸭源的重组GPV毒株M15(图 6)。
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图 6 MDE株全基因组的重组分析 Figure 6 Homologous recombination analysis of complete genome of MDE isolate |
鹅细小病毒(GPV)自1956年国内外首次报道至2014年，该病毒仅感染鹅和番鸭。然而，2015年初，国内学者陈浩等报道樱桃谷鸭、半番鸭、绿头鸭、白改鸭以及褐莱鸭感染GPV后发病，发病率达50%以上[3-4]，揭示了GPV感染谱的扩大。尽管GPV在番鸭胚和鹅胚中具有较强的垂直传播能力，但还未见报道半番鸭胚感染GPV。本研究在半番鸭胚和刚孵化的1日龄雏半番鸭分离鉴定了同一株GPV毒株，揭示了GPV亦能通过半番鸭胚引起垂直传播。
研究报道表明，GPV的非结构基因和结构基因的大小均不会随ITR的长度不同而改变，即所有GPV的NS基因、VP1基因均分别为1 884和2 199 bp[8-10]。除了重组株GPV QH15 VP2结构蛋白的起始密码子为ATG，其他所有GPV的VP2结构蛋白的起始密码子均为ACG。本研究获得的GPV分离株(MDE株)也不例外，具有与经典GPV相似的基因组结构特征。MDE株基因组核苷酸、结构蛋白VP1核苷酸和氨基酸序列均与疫苗毒株SYG61v的相似性最高，但在VP1结构蛋白氨基酸序列仍有12处氨基酸突变。基于VP1和NS1基因核苷酸序列的遗传进化结果表明，MDE株独立处于GPV的一个小分支上。基于MDE株的基因组特征，该毒株可能由GPV弱毒疫苗毒株变异而来。目前半番鸭等多种鸭可感染GPV，可能是由于GPV长期在弱毒活疫苗的免疫选择压力下，尤其在我国水禽品种(系)增多和不同品种(系)鸭混养给该病毒突破种间传播提供了有利条件。
MDE株的基因组分子特征又不同于当前引起我国半番鸭短喙侏儒综合征的新型GPV毒株(M15株)。MDE株具有经典GPV的基因组结构特征，不是重组毒株；而GPV M15株在VP3处与MDPV发生重组现象[11]。与M15比较发现，MDE株基因组、NS1和VP1核苷酸序列及相应氨基酸序列均与M15株的相似性最低。经分析MDE株的遗传进化关系表明，尽管MDE株和M15株均处于GPV分支上，但均处于GPV不同的进化分支上，表明两个毒株是由不同的GPV毒株进化而来。
结构蛋白糖基化在病毒对宿主的受体识别、入侵、免疫逃逸及病毒毒力等方面发挥着重要作用[12]。目前的研究结果表明，糖基化位点的差异可能改变病毒感染宿主的特异性[13-15]。经分析GPV VP1蛋白糖基化位点发现，除个别毒株外，我国在2015年之前分离的GPV在VP1区只存在5个潜在糖基化位点，均缺少703NRTS糖基化位点；而其之后分离的GPV在VP1区的潜在糖基化位点数量无规律性，且均存在703NRTS糖基化位点。如MDE株感染宿主为半番鸭胚和半番鸭，其VP1也存在703NRTS糖基化位点；当前引起我国半番鸭短喙侏儒综合征的新型M15 GPV毒株亦存在该糖基化位点。据此糖基化特征推测，随着我国GPV的不断进化，其感染宿主的扩大极可能与VP1蛋白703NRTS的糖基化有关。而我国存在该糖基化位点的GPV是否更易于逃避宿主免疫系统的攻击，有待进一步研究。
4 结论自半番鸭胚及孵化的雏半番鸭中分离了鹅细小病毒(GPV)毒株，命名为MDE株。该病毒粒子直径20~24 nm，球形、无囊膜。病毒基因组全长为5 106 bp，与15株GPV基因组序列相似性为93.2%~98.1%，其中与SH株及疫苗株SYG61v株等的相似性较高。遗传进化分析表明，MDE与GPV疫苗毒株的亲缘关系最近，处于同一个独立的分支上。GPV可通过半番鸭胚垂直传播给雏鸭。
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