2. 新疆农业大学动物医学学院, 乌鲁木齐 830052;
3. 新疆尉犁县畜牧兽医工作站, 尉犁 841500;
4. 新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心, 库尔勒 841000
, Jiapaer HASIMU3, XUE Xin-mei4, DING Meng-yue1,2, MA Xiao-jing1, YE Feng1, MA Jun-jie1, YI Xin-ping1, GU Wen-xi1
, ZHONG Qi1
2. College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;
3. Yuli Animal Husbandry and Veterinary Station, Yuli 841500, China;
4. Animal Eppidemic Control and Diagnosis Center, Bayingol Mongolian Autonomous Prefecture, Korla 841000, China
盖塔病毒(Getah virus, GETV)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)西门利克病毒复合组的一种单链RNA病毒，由吸血节肢动物传播[1]。最早发现于马来西亚的吸血蚊虫体内[2]。现广泛分布于蒙古、日本、韩国、中国、越南、泰国、马来西亚、菲律宾、印度、澳大利亚等国家[3]。该病毒可感染多种脊椎动物，引起发热、荨麻疹、全身淋巴结肿大、流产等症状，在人体内也检测到盖塔病毒抗体[4]，它对人畜健康是一个巨大的潜在威胁。本研究于新疆尉犁县库蠓标本中分离到一株病毒，经中和试验、免疫电镜观察、盖塔病毒C基因特异性引物PCR扩增等方法鉴定其为盖塔病毒，这是从新疆境内分离到的首株盖塔病毒，该研究结果为研究盖塔病毒在我国的分布流行以及防控提供重要的科学依据。
1 材料与方法 1.1 样品材料2016年7月中、下旬于新疆尉犁县墩阔坦乡(N 41°09′，E 86°03′)牛、羊圈内采集到的18 000只库蠓，液氮保存；蓝舌病病毒和痘病毒由新疆畜牧科学院兽医研究所保存；盖塔病毒抗体阳性血清和阴性血清购自上海酶联生物科技有限公司。
1.2 细胞及试剂BHK-21、C6/36、Vero细胞由新疆畜牧科学院兽医研究所保存；TransZol Up、反转录试剂盒、2×Easy Taq PCR SuperMix (+dye)、RT-PCR一步法试剂盒、DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；pGEM-T为北京普洛麦格生物技术有限公司产品；5-氟脱氧尿核苷(FUdR)购自Sigma公司；甲醛、冰醋酸、亚甲基蓝购自新疆宝信生物工程有限公司。
1.3 病毒分离将采集到的18 000只库蠓按每50只分为一组，添加1 mL MEM细胞培养液，低温研磨直至无明显组织块，30 000 r·min-1离心15 min，取上清，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞，盲传5代，每天观察并记录细胞形态变化。
1.4 病毒的鉴定 1.4.1 病毒核酸类型的鉴定将病毒液连续作10倍稀释，每个稀释度分成两份，一份用于TCID50测定，另一份每个稀释滴度均加入5-氟脱氧尿核苷(FUdR，终质量浓度为50 μg·mL-1)，37 ℃条件下作用30 min，随后测定TCID50，比较两者的TCID50值，确定病毒的核酸类型。设立已知RNA病毒(蓝舌病病毒)和已知DNA病毒(痘病毒)作为对照。
1.4.2 病毒种属的初步鉴定(PCR鉴定)提取病毒液总RNA并反转录，参考有关文献[5-10]，用常用虫媒RNA病毒鉴定引物进行PCR扩增，引物序列见表 1。反应条件均为预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火温度根据使用的扩增相应病毒的引物条件而定：布尼亚病毒属、版纳病毒、辽宁病毒、Toti病毒等为55 ℃，黄病毒属、甲病毒属为52 ℃，云南环状病毒为57 ℃，蓝舌病病毒、鹿流行出血热病毒为50 ℃，时间均为30 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环；72 ℃终延伸10 min，最后4 ℃保存。其中Cypo病毒引物F与引物R反向互补，先用T4 RNA连接酶将引物F连接到Cypo病毒dsRNA的3′端，用引物R将3′端连接引物F的基因片段逆转录为cDNA，再进行PCR扩增[11]。经1%琼脂糖凝胶电泳，若出现阳性扩增条带，则胶回收纯化，送测序公司测序，测序结果与NCBI数据库中的序列比对，确定病毒的种属。
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表 1 本研究用虫媒RNA病毒鉴定引物 Table 1 Primers used to identify RNA arboviruses |
参考文献[9]有关步骤进行操作。
1.4.4 免疫电镜观察将分离到的盖塔病毒液反复冻融，离心取上清，与盖塔病毒抗体阳性血清进行中和，送新疆农业大学生物显(超)微结构研究实验室，滴至铜网上，磷钨酸负染色，于透射电子显微镜下观察。
1.4.5 盖塔病毒C基因RT-PCR鉴定参照文献[12]设计合成盖塔病毒C基因引物，序列为CF: 5′-CAGGATTACACTACATCTAAAG-3′；CR: 5′-ACGTTGGCTAAGACGCACATC-3′，使用RT-PCR一步法试剂盒进行扩增，对目的条带进行胶回收，连接pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落送公司测序。选取GenBank中盖塔病毒的C基因序列进行比对，用MEGA 5.1绘制系统发育树。
2 结果 2.1 细胞接毒及病变观察将采集到的18 000只库蠓按每50只为一组，共计360组，研磨后将其接种于BHK-21、Vero和C6/36细胞，且分别盲传5代。结果Vero和C6/36细胞均没有CPE现象产生，而73号组库蠓研磨液在BHK-21二代第3天开始出现CPE，随后细胞间隙增大、皱缩、变圆并大面积脱落，形成空斑，第6天细胞完全脱落，见图 1。将该细胞液收集后连续在BHK-21细胞传代，均能出现CPE。同时将该出现CPE的病毒液再次接种于Vero和C6/36细胞，盲传3代，均无CPE产生。
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a.接种24 h；b.接种72 h；c.接种96 h；d.正常细胞96 h a. BHK-21 after inoculation for 24 h; b. BHK-21 after inoculation for 72 h; c. BHK-21 after inoculation for 96 h; d. Control cells (96 h) 图 1 接种分离株后BHK-21细胞病变(100×) Figure 1 The morphology of XJ73 isolates infected BHK-21 cells (100×) |
比较XJ73毒株、蓝舌病病毒(RNA病毒)、痘病毒(DNA病毒)在加入FUdR前后的TCID50，结果显示：蓝舌病病毒原始毒价为10-4.83 TCID50·0.05 mL-1，加入FUdR后毒价为10-4.92 TCID50·0.05 mL-1，相差10-0.09 TCID50·0.05 mL-1；痘病毒原始毒价为10-3.75 TCID50·0.05 mL-1，而加入FUdR后毒价变为10-2.08 TCID50·0.05 mL-1，FUdR对痘病毒的抑制作用明显，对照成立。XJ73毒株毒价为10-4.08 TCID50·0.05 mL-1，与FUdR混合作用后毒价为10-4.17TCID50·0.05 mL-1，与其原始毒价相比无明显变化。因此，判定XJ73毒株属于RNA病毒。
2.3 病毒种属初步鉴定提取XJ73病毒液总RNA，反转录成cDNA后，应用常用虫媒RNA病毒鉴定引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳后，该病毒在甲病毒属引物扩增后，在450 bp左右出现阳性条带，如图 2所示。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.版纳病毒；2.辽宁病毒；3. Kadipiro病毒；4. Cypo病毒；5. Toti病毒；6.云南环状病毒；7.蓝舌病病毒；8.鹿流行出血热病毒；9.布尼亚病毒属；10.黄病毒属；11.甲病毒属 M. DL2000 DNA marker; 1. Banna virus; 2. Liaoning virus; 3. Kadipiro virus; 4. Cypovirus; 5. Totivirus; 6. Yunnan Orbivirus; 7. BTV; 8. EHDV; 9. Bunia virus; 10. Flavivirus; 11. Alphavirus 图 2 虫媒RNA病毒RT-PCR检测结果 Figure 2 RT-PCR amplification of RNA arboviruses |
回收阳性条带测序，将测序结果登录NCBI进行BLAST比对，结果显示该片段与盖塔病毒相似性高达99%。由于对比序列片段较短，所以初步鉴定XJ73毒株为甲病毒，疑似盖塔病毒。
2.4 中和试验将XJ73毒株与盖塔病毒抗体阳性血清和阴性血清进行中和试验，结果显示，XJ73毒株可以与盖塔病毒抗体发生特异性中和反应，而与盖塔病毒阴性血清无中和反应。
2.5 免疫电镜观察通过免疫电镜观察可见，XJ73病毒颗粒与盖塔病毒抗体结合而聚集在一起。病毒粒子呈圆形，直径大小约70 nm，有囊膜，与盖塔病毒颗粒形态描述一致[1]，见图 3。
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图 3 透射电镜观察XJ73病毒颗粒 Figure 3 Electron microscopy observation of XJ73 strain |
盖塔病毒C基因RT-PCR扩增结果如图 4所示，经回收测序后得到长882 nt的序列。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准; 1.空白对照; 2. XJ73 M. DL2000 DNA marker; 1. Blank control; 2. XJ73 图 4 盖塔病毒C基因扩增结果 Figure 4 RT-PCR amplification of GETV capsid gene |
从GenBank数据库中选取15株盖塔病毒C基因序列与XJ73毒株比较，构建系统进化树，如图 5所示，所有参与比对的盖塔毒株分为三大分支。XJ73毒株与日本毒株Kochi/01/2005、MI-110-C2和蒙古LEIV 17741 MPR处于同一大分支；中国首株盖塔病毒M 1与俄罗斯LEIV 16275 Mag毒株、Sagiyama virus处于同一分支；中国河北HB0234、HB0215-3、云南YN0540、YN08、四川SC1210、韩国South Korea与日本14-I-605-C2、12IH26盖塔毒株处于同一分支。XJ73毒株与2005年日本高知县猪分离株相似性最高，达99%，而我国其他地区盖塔病毒分离毒株亲缘关系相对较远。
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图 5 盖塔病毒XJ73株与其他株衣壳蛋白基因进化树 Figure 5 Capsid gene phylogenetic analysis of XJ73 strain |
我国的虫媒病毒病研究起步相对较晚，而盖塔病毒的发现正式拉开了我国虫媒病毒病研究的序幕。自1964年在海南首次发现盖塔病毒后，将近40年时间未有关于我国盖塔病毒的研究报道。进入21世纪后，河北、上海、云南、甘肃、辽宁、贵州等地相继分离到盖塔病毒，地域横跨我国东、西、南、北，而且在我国人也检测到盖塔病毒抗体[13]。
盖塔病毒属于虫媒病毒，其传播有一定的季节性和地域性限制。新疆处于亚欧大陆中心地带，远离海洋，处于亚欧大陆中部，日照时间长，昼夜温差大，水源一般来源于昆仑山、天山、阿尔泰山的积雪，冰川融化后汇集，最终分布于天山南北盆地，加上有大量的牛、羊等易感动物存在，为媒介昆虫的繁衍、虫媒病毒病的传播形成了有利的条件[14]。
盖塔病毒易生长于蚊细胞，也可用BHK-21和Vero细胞来分离盖塔病毒，目前国内外的盖塔病毒均是从蚊、猪、马等动物体内分离得到，XJ73毒株不仅是新疆分离到的首株盖塔病毒，也是国内外首株库蠓源性盖塔病毒，提示盖塔病毒等虫媒病毒病的传播媒介已经不仅仅局限于某一单一物种，随着气候的改变，盖塔病毒乃至虫媒病毒病有明显扩大蔓延的趋势。
5-氟脱氧尿核苷(FUdR)是嘧啶卤化物，是用于鉴定分离的未知病毒核酸类型的常用药之一[15]，即在病毒分离时，在细胞液内加入终浓度一般为50 μg·mL-1的FUdR，该剂量不影响细胞正常代谢活动，对RNA病毒没有或仅有极低的抑制作用，而对DNA病毒的复制有明显的抑制作用。这是因为FUdR在磷酸化后能够代替胸腺嘧啶掺入新合成的DNA，对正常DNA的复制产生干扰，抑制正常DNA的合成。
虫媒病毒病在世界各地广泛流行，严重危害人类健康和畜牧业健康发展。据推测，尚有部分虫媒病毒未被发现，其带来的危害也无法预知，快速、准确地鉴定出病毒种类及特性对虫媒病毒病的预防和控制具有重要意义。每种虫媒病毒都有最适应的细胞系，本研究将采集到的库蠓样品分别接种于三种细胞(C6/36、BHK-21和Vero)并盲传五代，最大限度地来分离病毒，用5-氟脱氧尿核苷对获得的毒株进行病毒核酸类型鉴定，根据鉴定结果选取常用的DNA或RNA虫媒病毒引物进行PCR扩增，将阳性条带回收测序即可鉴定出该病毒种类甚至亚型。
盖塔病毒核心蛋白与病毒RNA紧密结合，包装成核衣壳，对病毒粒子的形成和存活至关重要[16]，盖塔病毒C基因相对保守，对于盖塔病毒的分子生物学鉴定以及各毒株间亲缘关系研究具有十分重要的意义。C基因相似性分析结果表明，XJ73毒株与2005年日本高知县猪分离株(GenBank: AB859822.1) 相似性最高，而与我国海南、云南、河北、四川分离到的盖塔毒株亲缘关系相对较远，推测可能是由于引进日本种公畜或精液等畜牧贸易活动有关。提示我国在引进活畜或精液，尤其是从日本等盖塔病疫情较为严重的国家进口时，应加强盖塔病毒的检疫工作。
4 结论首次从新疆尉犁县库蠓标本中分离到盖塔病毒，该毒株与2005年日本分离株相似性高达98%，推测可能与引进日本带病种公畜或精液有关，提示在进出口畜牧贸易活动中，应加强盖塔病毒的检疫工作。
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