2. 山东省农业科学院家禽研究所, 济南 250100;
3. 中国牧工商集团总公司, 北京 100070
, LI Jing1, LU Jia-yin1, WANG Zi-xu1, CHEN Yao-xing1, HUANG Di-hai2, QIN Zhuo-ming2, MA Bao-chen3
, DONG Yu-lan1
2. Institute of Poultry, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China;
3. China Animal Husbandry Group, Beijing 100070, China
作为饲料添加剂，抗生素和抗菌促生长剂近些年已经在动物生产中大量使用。但由于耐药菌的出现，欧盟在2006年禁止了抗生素的使用。因此发现抗生素的新型替代品在目前的动物生产中十分重要[1-3]。对人或动物注射某一特定的病原可以获得特异性的转移因子。人、牛、鼠的血液及脾中广泛存在转移因子，因而其来源很广泛，动物外周血、淋巴结、脾、扁桃体以及高免鸡的卵黄，高免奶牛的初乳均可制备转移因子。我国家禽养殖业发达，与其他多种原料相比，鸡的脾最容易获得，且成本低，安全性较好，有利于工业化生产，而且鸡脾作为原料来制备转移因子实现了养禽业副产品的高效回收利用，符合当前经济发展，因此鸡的脾常被作为原料来获得鸡脾转移因子。鸡脾转移因子(chicken spleen transfer factor，TF)属于小分子多肽，前期应用质谱分析检测已经发现其主要由T细胞凋亡抑制相关蛋白(TIAL1) 和胸腺素β4(Tβ-4) 组成，其相对分子质量集中于800~4 000 u[4]，是一种新型的动物源性免疫激发剂，已有研究表明其有增强机体免疫力，提高生产性能的作用，效价高，效果好[5]。
肠道作为与外界接触面积最大的黏膜免疫屏障，其表面分布了丰富毛细血管网，这种结构使得黏膜处存在丰富的对流氧交换体系，每时每刻都会产生氧化和抗氧化反应。已有研究表明，肠道炎症的发生与肠道抗氧化功能有着密切的关系，氧自由基ROS是激活NF-κB的重要分子，活化的NF-κB诱导TNF-α、IL-1、IL-6等炎性细胞因子表达，诱发炎症[6]；活性氧的累积会使肠道抗氧化能力下降，导致炎症进一步恶化，阻止肠道黏膜损伤的恢复[7]，氧化与抗氧化产生的自由基或有机过氧化物能够损伤脂质、蛋白质和DNA的结构，从而改变动物产品的质量[8]，而一些因素(如营养、环境、病理和生理)能够加剧自由基的生物形成，从而引起氧化应激损害肉鸡的健康、整体性能和肉品质[9]。因此提高肠道抗氧化能力、增加肠道免疫力对提高家禽的生产养殖很重要。机体中存在的抗氧化酶GSH-PX能够保护脂质膜不被氧化损伤[10]，CAT与GSH-PX共同作用，可以使过氧化氢还原为水[11]。丙二醛(MDA)是脂质过氧化代谢产物之一，能够衡量氧化程度[12]，这些抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)和总抗氧化能力(T-AOC)及脂质过氧化产物MDA都可以作为判断组织氧化程度的指标。
许多研究表明氨基酸摄入可提高机体抗氧化功能，改善氧化应激，保护肠黏膜免受氧化损伤[12]。鸡脾转移因子成分与氨基酸类似，经口给药，通过肠道吸收，那么鸡脾转移因子会对肠道的抗氧化功能有怎样的影响呢？本研究拟通过口服不同剂量鸡脾转移因子，探讨其对SPF雏鸡肠道组织抗氧化能力的影响，比较12日龄和19日龄雏鸡肠组织中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)的活力、总抗氧化能力T-AOC和脂质过氧化产物MDA含量，不仅为鸡脾转移因子调节机体免疫力的作用提供更直接的证据，而且为生产中合理利用饲料添加剂提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 材料1日龄SPF鸡(山东省农业科学院家禽研究所)100羽，于实验动物房中饲养，饲喂自配的玉米-豆粕型全价料(表 1)，自由采食与饮水。光照时间5日龄为19 h，之后每天减少2 h，直至8 h光照为止。鸡舍内温度4~7日龄为28~30 ℃，以后每周降低2 ℃，降至18~20 ℃为止。将100羽SPF雏鸡随机分成5组，每组20羽，自5日龄开始从饮水中加入鸡脾转移因子，饲喂1周，停喂1周，饲喂分为对照组和试验组(鸡脾转移因子溶液，多肽含量1 mg·mL-1)，后者设置4个剂量组，分别为0.05、0.10、0.25、1 mL·只-1，均以混饮水的方式饲喂，限时饮水。分别于12日龄、19日龄称量体重，处死，取十二指肠、空肠、回肠和直肠中段，将不同肠段组织称重，然后放入2 mL玻璃匀浆器中，按照1:9比例加入0.75%生理盐水进行研磨，然后转移到1.5 mL EP管中，保存。
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表 1 饲喂日粮成分及营养水平 Table 1 Composition and nutrient level of the experimental diet |
BCA蛋白定量试剂盒(CW0014，北京康为世纪生物科技有限公司，北京)。总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(A015)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(A003-1)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒(A005)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(A001-1) 与过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(A007-1)，均购自南京建成生物工程研究所。
鸡脾转移因子[生产批号为鲁饲证：(2013)01004]由山东省农业科学院家禽研究所和山东省健牧生物药业有限公司制备提供，100 mL·瓶-1，其中免疫活性肽1 mg·mL-1、核酸300 μg·mL-1。纯度为95%，粗蛋白质≥2%，pH6.0~8.0。
1.3 试验方法将12日龄和19日龄雏鸡的各离体肠段组织进行匀浆，根据试剂盒操作步骤测定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。
1.4 数据处理数据均使用SPSS 20.0统计软件分析，One-Way ANOVA分析组间差异显著性，P≤0.05为差异显著，统计结果采用“ x±s”表示。
2 结果 2.1 TF对SPF雏鸡体重的影响如表 2所示，口服鸡脾转移因子一周，低剂量组试验鸡的体重有升高的趋势，但是应用时间太短，变化尚不显著。
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表 2 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡体重的影响 Table 2 Effect of TF on the body weight of laying hens in 12 and 19 d of SPF chicken |
通过对12、19日龄SPF雏鸡在不同剂量鸡脾转移因子作用下的十二指肠、空肠、回肠和直肠组织匀浆的总抗氧化能力T-AOC活力进行检测，发现在连续使用鸡脾转移因子7 d后，鸡肠道T-AOC均比对照组有所增加。随着TF剂量增加，各肠段T-AOC的含量也增加，尤其是0.25和1.00 mL·只-1剂量组增加显著(P < 0.05), 分别比对照组增加了10.58%~29.12%，16.48%~43.16%。饲喂TF一周并停喂一周即19日龄雏鸡肠道T-AOC比对照组也有不同程度升高，但仅见回肠(0.10~1.00 mL·只-1剂量组)仍保留有显著效果，其他各肠段不同剂量组增加趋势不一致(图 1)。
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同一肠段所标字母不同表示差异显著(P < 0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同 Different letters on column diagram indicate significant differences in the same intestinal segment among different treatment groups (P < 0.05), same letter in the same column means no significant difference among the treatments (P>0.05). The same as below 图 1 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡小肠和直肠中T-AOC活力的影响 Figure 1 Effect of TF on the content of T-AOC in small intestine and rectum in 12 and 19 d SPF chicken |
通过对12、19日龄SPF雏鸡在不同剂量鸡脾转移因子的作用下各肠段中过氧化氢酶(CAT)活力的检测，发现在连续使用鸡脾转移因子7 d后，不同剂量组各肠段CAT活性都有所升高，尤其是0.25~1.00 mL·只-1剂量组效果显著，且随着TF剂量的增加而升高，1.00 mL TF组升高最为显著(P < 0.05)，各肠段分别比对照组升高了16.98%~25.77%。对饲喂一周停喂一周即19日龄雏鸡肠道测量后发现CAT也有所升高，但幅度与12日龄相比下降，且与对照组相比无显著性差异(除0.25 mL组在空肠和回肠显著升高)。因此，连续灌服TF一周能显著升高各肠段CAT活力，停药一周后，作用明显减弱(图 2)。
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图 2 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡小肠和直肠中CAT活力的影响 Figure 2 Effect of TF on the content of CAT in small intestine and rectum in 12 and 19 d SPF chicken |
不同剂量TF对12日龄雏鸡各肠段中SOD活力的变化与CAT活力和总抗氧化能力的变化趋势相似，与对照组相比，中、高剂量组显著升高各肠段SOD活力(P < 0.05)，从十二指肠到直肠的各段肠道TF 1.00 mL·只-1剂量组SOD活力最大，且分别比对照组显著升高17.07%~31.54%(P < 0.05)。19日龄各肠段中、高剂量组的SOD活力仍比对照组高，尤其是TF 1.00 mL·只-1剂量组十二指肠、回肠、直肠仍比对照组呈显著升高趋势(图 3)。
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图 3 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡小肠和直肠中SOD活力的影响 Figure 3 Effect of TF on the content of SOD in small intestine and rectum in 12 and 19 d SPF chicken |
连续使用不同剂量的鸡脾转移因子7 d后，即12日龄测定各肠段谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力，结果如图 4所示，TF 1.00 mL·只-1剂量组各肠段分别比对照组显著提高13.99%~23.59%(P < 0.05)。TF 0.25 mL·只-1剂量组仅空肠中升高显著(P < 0.05)，TF 0.10、0.25 mL·只-1剂量组的回肠与对照组相比差异均显著(P < 0.05)；直肠GSH-PX的变化趋势与回肠相似。对用药一周，停药一周，即19日龄的肠道GSH-PX活力检测结果显示，各剂量组的作用效果均比12日龄时下降；与同日龄对照组相比，中、高剂量组对其仍有一定的影响。
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图 4 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡小肠和直肠中GSH-PX活力的影响 Figure 4 Effect of TF on the content of GSH-PX in small intestine and rectum in 12 and 19 d SPF chicken |
对12日龄SPF雏鸡各段肠道组织匀浆中MDA含量的检测结果显示(如图 5所示)，使用鸡脾转移因子可有效降低肠道中MDA的含量，且鸡脾转移因子使用剂量越高，下降幅度越大。除最低剂量组(0.05 mL·只-1)外，其他组十二指肠中MDA浓度均显著降低(P < 0.05)，在空肠和回肠高剂量组对MDA浓度影响最为明显(P < 0.05)；中剂量和高剂量组对直肠效果最为明显(P < 0.05)。用药一周停药一周后，即19日龄，尽管相较于12日龄其作用有所减弱，但与同日龄对照组相比仍有抑制效果。
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图 5 不同剂量TF对12、19日龄SPF雏鸡小肠和直肠中MDA含量的影响 Figure 5 Effect of TF on the content of MDA in small intestine and rectum in 12 and 19 d SPF chicken |
鸡脾转移因子(TF)是由小分子多肽与核苷酸结合而成的小分子物质，本研究团队前期对其多肽成分分析发现其含有多种具有生物活性的蛋白质，共计581种，包括非酶切方式获得的多肽共512种(主要有T细胞凋亡抑制相关蛋白、胸腺肽β4、杀菌/通透性增加蛋白、酶、肌动蛋白、血红蛋白等)和酶切方式获得的多肽共69种(主要有抑制因子活化蛋白、抗菌肽、细胞色素C等)[4]。许多研究表明，Tβ-4能结合胞内肽促进伤口愈合[13]、组织重建、血管生成[14-15]、抗菌和抗病毒免疫的过程[16]。Tβ-4片段能通过抑制生物膜的形成表现出抗菌活性，从而保护机体[17]。抗菌肽能显著提高肉鸡的生产性能，具有抗氧化功能，饲料中添加抗菌肽可以显著提高肉鸡超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性，显著降低丙二醛的含量[18-19]。生产中，为避免灌胃引起的氧化应激对机体的影响，一般采用饮水给药、饲料添加的口服途径，减少了氧化应激给试验带来的影响。
在本研究中，对SPF雏鸡连续口服不同剂量的鸡脾转移因子仅仅一周后，已经有升高体重的趋势，但是效果尚不明显。这可能是应用时间短的原因，或者SPF作为蛋鸡增重受饲料添加剂影响不明显。那么，对机体免疫能力和抵御外来病原菌能力的影响如何呢？很多病原菌均通过破坏消化道屏障，进而侵袭机体。本文从肠道局部抗氧化能力入手，试图发现鸡脾转移因子对消化道屏障的调节作用。对肠道局部抗氧化能力检测发现，高剂量组(TF 1.00 mL·只-1)可显著增加十二指肠、空肠、回肠、直肠多种抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX的活力，以及总抗氧化能力T-AOC，可显著降低脂质过氧化产物MDA的含量。鸡脾转移因子中含有的Hsps，是一组高度保守的跨物种蛋白，其充当着分子伴侣和抗氧化剂的作用，在日常可以保护细胞，抗细胞凋亡，抗氧化[20]，识别和修复细胞内错误折叠的蛋白质[19]，对缺血、缺氧和一些毒性物质引起的细胞损伤具有保护作用[21-22]。有研究报道鸡脾转移因子中包括游离的氨基酸和组成多肽的氨基酸，而大量的研究已经证明多种氨基酸具有抗氧化功能，如干燥红细胞喷雾能作为抗氧化剂是因为其中富含组氨酸，能够清除1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基，增加SOD和GPX活性[23]；谷氨酰胺也对肠道起到重要的免疫调节作用，能够提高肠道抗氧化性能，抑制自由基的能力[24]。因此，鸡脾转移因子显著提高肠道抗氧化能力可能是因为鸡脾转移因子包含具有生物活性的多肽(胸腺肽、抗菌肽、热休克蛋白)或者氨基酸。有文献报道，TLR信号可通过MyD88和抗炎因子IL-10活化核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2) 并结合抗氧化反应相关元件(ARE)来促进相关抗氧化物质的产生[25]。本课题组研究发现口服鸡脾转移因子对肠道TLR和抗炎因子IL-10有显著影响(数据待发表)，推测鸡脾转移因子对肠道抗氧化功能的影响可能是通过TLR信号通路活化Nrf2与ARE结合促进抗氧化物质产生，但是其具体的作用机制还有待进一步探究，期望纯化出单一物质，进行更为针对性研究。
4 结论SPF雏鸡连续灌服不同剂量的鸡脾转移因子一周后，高剂量组(TF 0.10 mL·只-1)能显著提高肠道多种抗氧化酶活力和总抗氧化能力，显著抑制脂质过氧化产物生成，因此高剂量的鸡脾转移因子作为饲料添加剂具有提高鸡抗氧化应激能力的作用，推测其具有提高免疫能力和抵御外来病原菌的能力。
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