2. 秦皇岛圣蓝皇家海洋公园, 秦皇岛 066000
, HOU Ning1,2, WANG Xiao-yan1, GAO Xue-li1, LIU Chao-nan1, LÜ Xiao-ping1, ZHENG Shi-min1
2. Qinhuangdao Saintland Ocean Park, Qinhuangdao 066000, China
禽网状内皮组织增生病(reticuloendotheliosis, RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(REV)引起的综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织以及其他组织的慢性肿瘤增生性疾病。RE是继鸡淋巴细胞性白血病、鸡马立克病之后的第三种禽病毒性肿瘤病[1]。近年来，国内REV的感染呈现逐年上升趋势，部分地区REV感染鸡群高达80%以上。REV感染动物后，除造成病毒感染鸡群一定程度的死亡外，更重要的是病毒感染后雏鸡免疫器官中淋巴细胞数量减少，导致其胸腺和法氏囊等免疫器官萎缩从而发生不同程度的免疫抑制，易引发其他生物性致病因素的继发感染及混合感染[2]，给养禽业健康发展造成严重危害。
研究表明，REV感染雏鸡后，相关免疫器官萎缩导致的免疫抑制和淋巴细胞凋亡有关，而且凋亡并非直接由病毒感染引起，可能是病毒激活了宿主细胞凋亡基因所致[3]。细胞凋亡是机体一种非常重要及常见的自我调节机制，在机体发育和内环境稳态维持中至关重要[4]。研究发现，细胞凋亡与某些病毒感染和肿瘤发生密切相关[5]。许多病毒感染，可诱导宿主细胞发生凋亡[6]。目前，病毒诱导细胞凋亡确切的机制虽尚未明确，但Caspases依赖途径在其凋亡路径中极其重要，其中Caspase-3、Caspase-9是被认为在多种组织、细胞类型中常涉及的凋亡分子，检测其酶活性对细胞凋亡的研究有重要意义[7]。Bcl-2在线粒体凋亡途径中起重要作用，是凋亡研究中最受学者们关注的目标之一，其蛋白质含量及mRNA的表达水平与细胞凋亡密切相关。因此，检测Caspase-3、Caspase-9酶活性及Bcl-2的表达变化，在细胞凋亡的研究中具有重要的指导意义。
REV感染对SPF雏鸡免疫器官细胞凋亡，尤其是REV感染对雏鸡免疫器官凋亡相关酶活性及其有关基因表达的影响，迄今未见系统报道。故本研究对REV感染SPF雏鸡后，中枢免疫器官细胞凋亡及Caspase-3、Caspase-9酶活性和Bcl-2蛋白含量及mRNA表达水平的动态变化进行了较全面系统的检测，为深入阐述REV的免疫致病机制和开发新的抗病毒制剂提供帮助，也可为病毒感染导致的细胞凋亡提供新的科学实验参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物1日龄SPF混合雏鸡70只，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心，孵化出壳后在SPF笼中按SPF鸡饲养标准隔离饲养。
1.1.2 病毒禽网状内皮增生病病毒(REV-T株)，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC No. CACCAV107)，通过病毒感染CEF细胞，对其进行复制，测定TCID50为10-4.62·0.1 mL-1。
1.1.3 主要试剂和仪器Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)；cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green、荧光定量PCR相关材料(北京天根公司)；引物由上海生工公司合成；TUNEL试剂盒(南京凯基生物有限公司)；Caspase-3、Caspase-9酶活性检测试剂盒(碧云天生物有限公司)；Bcl-2抗体(英国ABCAM公司)；ELx808酶标仪(美国伯腾公司)；LightCycler2. 0荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)；PTC-200 PCR仪(美国Bio-Rad公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；GDS800凝胶成像系统(美国UVP公司)。
1.2 实验动物分组及其处理将70只SPF雏鸡随机分为2组，即对照组(C组)和REV感染组(I组)，每组各35只雏鸡。在1日龄时，I组雏鸡经腹腔注射REV稀释液，0.5 mL·只-1；C组雏鸡经腹腔注射等量灭菌生理盐水。两组雏鸡分别饲养于SPF鸡隔离器内，按SPF雏鸡标准饲养管理。
1.3 被检材料采取及其处理两组雏鸡分别于REV感染后1、7、14、21、28和35 d，每组随机抽取5只雏鸡，心脏采血处死，无菌快速采取胸腺、法氏囊分别做如下处理：
1.3.1 Caspase-3、Caspase-9酶活性检测样品取部分组织加入预冷的Lysis Buffer制成组织匀浆液，放入1.5 mL预冷的离心管中，于4 ℃恒温离心机上，10 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液，放入新的离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2 细胞凋亡数量检测样品取另部分组织置于冰箱4 ℃预冷的10%中性福尔马林缓冲溶液中固定。
1.3.3 Bcl-2 mRNA转录检测样品再另取部分组织于液氮中速冻，然后转入-80 ℃冰箱中冻存备用。
1.3.4 Bcl-2蛋白含量检测样品部分组织样品与预冷裂解液按1:10比例混合制成组织匀浆液，放入预冷的1.5 mL离心管中，于4 ℃恒温离心机上，10 000 r·min-1离心5 min。吸取上清液，放入新的离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.4 检测指标及方法 1.4.1 胸腺、法氏囊中Caspase-3、Caspase-9活性的检测取上述研磨好的样品上清液，吸取50 μL组织裂解上清加入96孔板中，如不足50 μL，用Lysis Buffer将其补足至总体积50 μL。然后加入50 μL 2×Reaction Buffe/DTT Mix，随后再每孔加入5 μL 2 mmol·L-1 Ac-DEVD-pNA(Caspase-3) 或Ac-LEND-pNA(Caspase-9)，37 ℃避光孵育2 h。最后用酶联免疫检测仪测OD值，检测波长为405 nm。
1.4.2 胸腺、法氏囊中凋亡细胞数量检测取上述固定的组织常规制作石蜡切片，二甲苯脱蜡后经100%、95%、80%、70%梯度酒精室温各5 min水化；PBS洗涤3次，5 min·次-1；每张切片滴加新配制的蛋白酶K工作液(2 μL 50×Proteinase K+98 μL PBS)，37 ℃避光30 min；DNase-free水洗2次，2 min·次-1；新鲜配制的3% H2O2溶液，室温15 min，PBS洗5 min；每张切片滴加50 μL TdT标记反应混和液，37 ℃避光1 h后PBS洗涤3次，5 min·次-1；每张切片滴加新鲜配制的anti-fluorescein antibody(40 μL PBS+10 μL anti-fluorescein antibody)，37 ℃避光作用30 min后PBS洗3次，5 min·次-1；DAB避光显色，室温15 min后PBS洗涤3次，5 min·次-1；苏木素复染1~3 min后1%盐酸酒精分化30 s，水洗5 min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。光学显微镜下计5个油镜视野下的凋亡阳性细胞数，并计算其均值。
1.4.3 胸腺、法氏囊中Bcl-2 mRNA转录量的检测上述取材的试验组对照组各50 mg，按照Trizol reagent说明书提细胞总RNA，分光光度仪检测RNA浓度和纯度。按cDNA第一链合成试剂盒说明将RNA逆转录合成cDNA后，按SYBR Green荧光法进行PCR反应[8]。反应以β-actin为内参照。以下为反应各引物序列，Bcl-2引物序列:上游5′-CGCCGCTACCAGAGGGACTT-3′，下游5′-CCGGACCCAGTTGACCCCAT-3′；β-actin引物序列:上游5′-CGGGACGGATGAGAAGAA-3′，下游5′-TCGGCGCTCCAGATGTAC-3′。各组设置3个复孔，记录各孔Ct值，并采用2-ΔΔCt法对结果进行分析。
1.4.4 胸腺、法氏囊中Bcl-2蛋白表达量的检测取离心好的组织裂解上清液用包被液1:800稀释，加入96孔板中每孔100 μL，各样本设3个重复孔，4 ℃过夜；洗涤(每孔加洗涤液200 μL，每次5 min，洗3次)；加封闭液100 μL，37 ℃孵育2 h；洗涤；用PBS将Bcl-2一抗1:3 000稀释后每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h；洗涤；将二抗(山羊抗兔)按1:5 000稀释后，每孔中加100 μL，37 ℃孵育1 h；洗涤；每孔加新配的联苯二胺(OPD)100 μL，37 ℃避光显色15 min；洗涤；每孔加50 μL 2 mol·L-1 H2SO4终止显色，检测490 nm波长下的OD值。数据取重复孔的平均值。
1.5 数据处理全部试验数据，均采用SPSS20.0软件进行数据处理，分析组间差异。结果用“ x±s”表示，差异显著性检验采用独立样本t检验。差异显著性判断标准：P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 REV感染SPF雏鸡中枢免疫器官Caspase-3、Caspase-9活性变化REV感染SPF雏鸡后，其中枢免疫器官中Caspase-3和Caspase-9活性不同程度高于对照组，呈现先升高后下降的趋势，并且Caspase-9酶活性出现显著升高的时间点比Caspase-3的更早。胸腺中Caspase-3和Caspase-9活性分别于21~28 d和7~21 d显著(P < 0.05) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异；法氏囊中Caspase-3活性于14~21 d极显著(P < 0.01)、28 d显著(P < 0.05) 高于对照组雏鸡，Caspase-9活性于7、28 d显著(P < 0.05)、14~21 d极显著(P < 0.01) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异。具体见表 1、表 2。
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表 1 REV感染雏鸡胸腺中Caspase-3、Caspase-9活性变化(OD405 nm) Table 1 Changes of Caspase-3 and Caspase-9 activities in thymus of chicks infected with REV(OD405 nm) |
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表 2 REV感染雏鸡法氏囊中Caspase-3、Caspase-9活性变化(OD405 nm) Table 2 Changes of Caspase-3 and Caspase-9 activities in bursa of chicks infected with REV(OD405 nm) |
REV感染SPF雏鸡后，其中枢免疫器官细胞在14 d开始检测出显著性凋亡，但法氏囊细胞凋亡比胸腺更明显。胸腺中凋亡细胞数量于14~21 d显著(P < 0.05) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异；而法氏囊中凋亡细胞数量于14、35 d显著(P < 0.05)、21~28 d极显著(P < 0.01) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异。具体见表 3。
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表 3 REV感染SPF雏鸡中枢免疫器官中凋亡细胞数量变化 Table 3 Changes of the number of apoptosis cell in central immune organs of chicks infected with REV |
REV感染SPF雏鸡后，其中枢免疫器官中Bcl-2 mRNA表达于7 d开始检测到显著性差异。胸腺中Bcl-2 mRNA于7 d显著(P < 0.05)、14~21 d极显著(P < 0.01) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异；法氏囊中Bcl-2 mRNA于7~14 d极显著(P < 0.01)、21 d差异显著(P < 0.05) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异。胸腺中Bcl-2蛋白含量于21~28 d显著(P < 0.05) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异；法氏囊中Bcl-2蛋白含量在14、28 d检测到差异显著(P < 0.05)、21 d检测到差异极显著(P < 0.01) 高于对照组雏鸡，其他时间点未见统计学差异。如表 4、5。
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表 4 REV感染SPF雏鸡中枢免疫器官中Bcl-2 mRNA转录量变化 Table 4 Changes of the transcription of Bcl-2 mRNA in central immune organs of chicks infected with REV |
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表 5 REV感染SPF雏鸡中枢免疫器官中Bcl-2蛋白含量变化 Table 5 Changes of the protein content of Bcl-2 in central immune organs of chicks infected with REV |
细胞凋亡是由凋亡信号引发的一系列级联激活的程序性细胞死亡过程。Caspase-9在Caspase家族中属于凋亡启动子，位于级联反应的上游，能激活下游的Caspase，如Caspase-3，后者是凋亡过程中的主要执行因子。本研究发现，REV感染SPF雏鸡后，其中枢免疫器官中与细胞凋亡密切相关的Caspase-3、Caspase-9活性均不同程度的高于对照组雏鸡，且Caspase-9酶活性检测到显著升高的时间点在中枢免疫器官中比Caspase-3的更早。无论是体外、体内还是毒性T细胞引起的凋亡最终都会活化Caspase-3[9]。据Z.Q.Yu等[10]研究发现，REV感染雏鸡后21~28 d，促凋亡因子(如C-myc、Caspase-6、Caspase-7等)mRNA转录显著升高。Caspase-6、Caspase-7与Caspase-3同为Caspase家族的凋亡执行因子，被上游Caspase启动因子激活而发挥凋亡作用。上述研究与本试验中Caspase-3活性检测结果相符，提示在REV感染引起的细胞凋亡中，Caspase-3的活化发挥了重要作用。同为能引起免疫抑制的病毒，HP-PRRSV感染仔猪后，其可通过Caspases依赖性通路介导细胞凋亡，仔猪胸腺内Caspase-9和Caspase-3表达显著增加[11]。结合本试验中感染组Caspase-3、Caspase-9活性变化，提示REV感染雏鸡后是Caspase-9先活化，然后激活Caspase-3，引起细胞凋亡。因此，REV感染雏鸡极可能是通过Caspases依赖途径介导了中枢免疫器官的细胞凋亡。
REV感染SPF雏鸡引起的免疫器官细胞凋亡过程中Bcl-2的作用机制尚无报道。本研究发现，REV感染1日龄SPF雏鸡后，其中枢免疫器官无论是Bcl-2 mRNA转录还是其蛋白质含量均不同程度的增加。机体的免疫系统在面对病毒的侵袭时会产生应答反应，可通过Bcl-2的表达升高来抵抗病毒诱导的细胞凋亡[12]。还有文献报道，IBDV感染雏鸡的免疫器官细胞发生凋亡，同时病毒感染后3~7 d，其Bcl-2 mRNA转录显著增高，而14~28 d未见统计学差异，并指出该结果很可能与病毒复制阻碍细胞凋亡有关[13]。本试验结果与上述已有报道除存在时间点差异外，其他基本一致。产生这种差异的主要因素可能是不同病毒对机体侵袭力与复制效率不同。李奎等[14]发现，Bcl-2蛋白是鸡免疫器官发育的重要调节物，在淋巴细胞分化中发挥调控作用，在固始鸡免疫器官发生凋亡过程中，Bcl-2表达量相对Bax少。Bax是一种主要促进凋亡的因子，具有颉颃Bcl-2的作用，Bax/Bc1-2值可反映细胞的凋亡调控[15]。还有研究表明，一些禽免疫抑制病毒感染雏鸡或相关细胞，会使其C-myc表达量升高[10, 16]。Bcl-2与C-myc在细胞发育、成熟中存在密切联系[17]，过表达的C-myc会促进细胞凋亡，在此过程中Bcl-2可阻碍C-myc诱导细胞凋亡功能的释放。由本试验结果可知，REV感染SPF雏鸡中枢免疫器官的Bcl-2 mRNA在第7天出现显著性升高，而细胞凋亡是在14 d开始检出显著性差异，这说明Bcl-2升高在REV感染的前期发挥了抑制凋亡的作用，但随着疾病的发展，Bcl-2的蛋白质高表达并没能成功抑制淋巴细胞的凋亡，提示在淋巴细胞凋亡过程中Bcl-2的功能受到了其他因子的影响，如Bax、C-myc等的高表达。还有可能涉及了REV的其他致病机制。因此，REV感染SPF雏鸡后中枢免疫器官Bcl-2的异常表达与其细胞凋亡密切相关。但由于条件所限，本试验中对与Bcl-2相互作用相关因子(Bax、C-myc等)的研究还不够全面，故REV感染SPF雏鸡后Bcl-2在淋巴细胞凋亡中所发挥的确切机制还有待进一步深入探讨。
本试验中，REV感染SPF雏鸡后，中枢免疫器官中细胞凋亡数量明显升高，且法氏囊细胞凋亡数量比胸腺更明显，这与REV感染雏鸡法氏囊内病毒载量显著高于胸腺有关[10]。结合本试验中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2的表达变化，表明REV引起的感染雏鸡免疫功能抑制与其中枢免疫器官细胞发生凋亡有关。有研究发现[18-19]，淋巴细胞或网状内皮细胞为REV的主要靶细胞，该病毒感染可引起雏鸡胸腺、法氏囊等免疫器官组织萎缩，使其功能受到损伤并导致严重的免疫抑制。刘玉洁[20]发现，用REV和ALV-J单独或混合感染动物，均可诱导雏鸡胸腺细胞发生凋亡，但二者混合感染时，其细胞凋亡发生程度较两种病毒分别单独感染动物明显加重，并指出病毒感染雏鸡胸腺细胞凋亡是导致其萎缩的主要因素。另外，周莹珊[21]认为，猪圆环病毒2型(PCV2) 感染仔猪后引起的细胞凋亡可能是淋巴组织缩小甚至消失的主要原因之一。据G. Wang等[22]报道，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染仔猪后引发骨髓和胸腺细胞大量凋亡，导致病毒感染仔猪免疫功能抑制，给该病防治带来巨大困难。上述病毒引发的免疫抑制都伴随着细胞凋亡的发生，进一步表明REV感染导致的雏鸡免疫抑制和胸腺及法氏囊等免疫器官的细胞凋亡有密切关系。该项研究为进一步探讨REV的免疫致病机制提供了重要的参考依据。但REV感染引起的细胞凋亡具体机制还不明确，后续尚需要更深入的研究。
4 结论REV感染后引起SPF雏鸡中枢免疫器官Caspase-3和Caspase-9活性的增强、Bcl-2 mRNA及其蛋白质表达上调，并导致了其细胞的凋亡。表明REV感染诱导的雏鸡免疫功能抑制与中枢免疫器官的细胞凋亡密切相关。
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