2. 国家动物寄生原虫实验室, 农业部动物流行病学重点实验室, 北京 100193
2. National Animal Protozoa Laboratory, Key Laboratory of Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, Beijing 100193, China
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,能感染人及多种动物。弓形虫病在世界范围内广泛流行,可引起人和动物的流产、死胎等,尤其危害例如艾滋病人等患免疫抑制病的人群,甚至是致死性的。目前,弓形虫只发现刚地弓形虫一个种,但有141多种不同的基因型(www.toxodb.org),根据它们对小鼠致病力的差异分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[1]。其中,Ⅰ型虫株致病力最强,一个速殖子的有效感染便可以导致小鼠死亡,常与人先天性弓形虫病有关;而Ⅱ、Ⅲ型虫株是自然感染的主要虫株,致病力相对较弱,对小鼠的全数致死量(LD100)≥103;Ⅱ型虫株可引起慢性感染,是多数艾滋病患者感染的主要虫株,感染小鼠后可在脑内形成包囊;Ⅲ型虫株主要感染动物,对小鼠是低毒力的,感染小鼠后主要引起神经症状[2-3]。关于Ⅱ、Ⅲ型虫株致病力的具体差异以及在小鼠各个组织器官中的分布规律,目前的报道主要集中在对组织病理学的动态观察。而且,关于不同基因型弓形虫对我国特有远交鼠(昆明小鼠)致病性的研究较少,目前仅有关于RH株[4]、CT1株[5]典型强毒株和Fukaya株[6]、AH株[7]、Toxo#17[8]弱毒株的报道。本试验用不同基因型弓形虫速殖子腹腔接种昆明鼠,观察感染小鼠的临床症状、血清抗体变化,以及用PCR方法检测虫体在组织器官的分布规律和脑荷虫量的情况,比较分析各基因型弓形虫对小鼠致病力,以期丰富多种基因型虫株对小鼠致病特性的认识,为弓形虫入侵机制及防治提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料弓形虫虫株:Ⅱ型虫株BJ和Pru、Ⅲ型VEG虫株,Vero细胞,由国家动物寄生原虫实验室培养和保存;实验动物:清洁级8周龄雌性昆明小鼠,购自北京华阜康生物科技有限公司;试剂及材料:全血组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术公司;PCR相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司;实时荧光定量PCR检测试剂购自宝生物(大连)工程有限公司。
1.2 试验方法 1.2.1 试验动物分组和试验设计将昆明小鼠随机分成3组,分别腹腔接种Ⅱ型Pru株1 000个、BJ株50个,Ⅲ型VEG株速殖子1 000个,另设一组对照组不攻虫(表 1)。感染处理后,每天观察小鼠发病、饮食、活动和精神状态,并记录死亡情况;每隔1 d称小鼠体重,记录体重变化。在感染后第1、2、4、8、16、32、48、64天,每组感染小鼠随机取2只,PBS组取1只,进行摘眼球采血,分离血清,并无菌取出心、肝、脾、肺、肾、脑及肌肉组织,保存至-20 ℃冰箱待检。
间接ELISA方法检测每组各时间点小鼠血清样品的抗体水平。碳酸盐缓冲液将弓形虫全虫抗原稀释至0.5 μg·well-1,4 ℃包被过夜;1% BSA 37 ℃封闭40 min;0.05%的PBST洗涤3次后,1:200稀释待检小鼠血清,37 ℃孵育1 h;再次用PBST洗涤后,用1% BSA 1:10 000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h;同上洗涤,加入显色液,用酶标仪(Model 680, 美国Bio-Rad公司)测定OD450 nm/630 nm值。
1.2.3 组织中弓形虫分布的检测利用DNA快速提取试剂盒提取各组织器官的基因组DNA,以弓形虫特异性引物(上游引物F1:5′-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3′,下游引物R1:5′-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3′,扩增片段大小529 bp)扩增弓形虫529 bp重复序列。1%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果。
1.2.4 弓形虫脑荷虫量检测以感染后第1、2、4、8、16、32、48、64天感染小鼠的脑组织DNA为模板,利用实时荧光定量PCR方法扩增脑组织中弓形虫529 bp序列(F2:5′-CACAGAAGGGACAGAAGT-3′,R2:5′-TCGCCTTCATCTACAGTC-3′,扩增片段大小94 bp),扩增小鼠组织28S rRNA序列(F3:5′-TGCCATGGTAATCCTGCTCA-3′,F4:5′-CCTCAGCCAAGCACATACACC-3′,扩增片段大小为71 bp)为内参。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行反应,反应程序为95 ℃预变性30 s,随后95 ℃变性5 s,60 ℃退火和延伸34 s,进行40个循环。反应结束后分别根据目的基因和内参基因的Ct值计算出所含虫体的数量及组织DNA含量,运用Roche 4500分析扩增曲线和标准曲线计算小鼠脑组织荷虫量,本文中小鼠脑荷虫量表示为每100 ng脑组织DNA中的虫体数量。
2 结果 2.1 感染小鼠的临床症状感染不同虫株所引起的小鼠症状有所差异。Ⅱ型虫株感染后第3天开始出现精神萎靡、活动性下降、被毛蓬乱、蜷缩发抖等临床症状。其中,BJ株在感染后第8天体重开始下降,第9天出现死亡,死亡时间主要集中在第9—16天,至第30天小鼠全部死亡。感染Pru株小鼠的体重第12天开始下降,至第25天时降至最低,至第34天体重始终维持在低水平,第34天后体重开始缓慢增加。Ⅲ型虫株感染小鼠未出现明显的临床症状,与PBS对照组小鼠的体重变化无差别,呈缓慢上升趋势(图 1)。
感染Ⅱ型虫株的小鼠腹水增多,脾肿大、淤血,肝肿大、淤血,肺肿胀实变,脑沟回变平,心肿大充血,与对照组小鼠相比,试验组小鼠肾体积明显变大(图 2),肌肉变化不明显。感染Ⅲ型虫株小鼠的病理变化不明显。
感染两种Ⅱ型虫株的小鼠血清抗体变化趋势大致相同,在感染后第4天检测到弓形虫特异性抗体,第8天后开始迅速增加,Pru到第64天仍然保持上升趋势,但感染VEG株第32天达到峰值,之后维持在较高水平(图 3)。
以各取样时间点小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和后肢肌肉组织DNA为模板,PCR扩增弓形虫529 bp特异性基因,综合各取样点的PCR检测结果如表 2所示。三种虫株感染小鼠后,在体内的分布趋势大体相同。最先扩增出弓形虫特异性基因片段的组织是肺、肾和肌肉,中期多分布在心、肺、肌肉、脑中,且存在时间可以达到一周以上,后期虫体仅在脑中检测到,其中Pru株在第64天时仍然可以检测到。对照组小鼠未在脾、肾、肝三种组织中检测到任何一种虫株。
用绝对荧光定量PCR检测小鼠在Pru感染后不同时间脑组织荷虫量,结果如图 4所示。感染Pru株小鼠的脑组织在第8天检测到弓形虫,第16~64天脑荷虫量呈上升趋势,与感染初期相比差异显著(P < 0.05),脑组织DNA中的量达到约2.7×104个·100 ng-1。
本试验中所选用的三种虫株(Pru株、BJ株和VEG株)是引起人和动物弓形虫病的主要虫株,其中BJ株属于Chinese 1型(ToxoDB #9),国际上已经确定在中国以Chinese 1型(ToxoDB #9) 为优势基因型[9-10],国内约60%的弓形虫株基因型属于Chinese 1型[11]。而流行于欧洲和北美地区的优势基因型为弓形虫原型克隆谱系(archetype clonal lineage, 即TypeⅠ、Ⅱ和Ⅲ)。其中Ⅰ型虫株对小鼠的毒力最强,而Ⅱ型的代表虫株是ME49和Pru,Ⅲ型虫株有VEG、CTG等,Ⅱ型是欧洲人源性弓形虫优势基因型[12]。
弓形虫不同基因型的虫株在基因水平的差异小于1%,但是对小鼠的急性毒力表现却差异很大[13]。这是由于不同基因型虫株的分子致病机制不同,引起的小鼠免疫应答状态和疾病转归不同[14]。有报道显示,原型克隆谱系虫株致病性的差异与棒状体蛋白(ROPs)的多态性有着密切联系。TgROP18是弓形虫Ⅰ型强毒株和Ⅲ型弱毒株毒力差异的关键因子[15]。K. D. C. Jensen等证明致密颗粒蛋白也是重要的效应因子,GRA15能抑制ROP16产生精氨酸酶-1,而激活NF-κB,促使巨噬细胞向M1极化,导致小鼠两种不同偏向的免疫效应[16]。另外,免疫相关GTP酶(IRGs)也与弓形虫对小鼠致病力差异相关。IRGs在IFN-γ存在的情况下会大量表达,并聚集在纳虫空泡膜表面,使纳虫空泡膜破裂并导致弓形虫死亡。但对小鼠的保护作用只针对弱毒株的侵袭,对强毒株无效[17]。国际上,对基因型相关疾病或虫株特异性效应分子多态性相关疾病方面的研究已成为弓形虫病研究的前沿和热点。本试验用典型Ⅱ型和Ⅲ型弓形虫速殖子感染昆明小鼠,比较研究了弓形虫三种基因型虫株对昆明小鼠的致病性。结果显示,Ⅱ型和Ⅲ型虫株两种弱毒株均可以引起昆明鼠发生特定的免疫反应,但Ⅱ型致病性略高,与Ⅲ型虫株对小鼠的侵袭力及其所造成的慢性感染差异显著。本试验同时还引入了弓形虫非典型虫株BJ株,发现BJ株对小鼠的致病力较Pru株强。一般来说,弓形虫非典型或自然重组的虫株对小鼠的毒力比典型的Ⅱ型或Ⅲ型要强,但由于基因组差异较大,很难放在一起比较,国内相关报道也比较少。本试验中所用BJ株为猫源非典型基因型ToxoDB#9,在进化树上,BJ株与典型虫株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及其他非典型基因型位于不同的分支上;同源性分析显示,BJ株HP-intro2、GRA6、GRA7基因分别与RH株、Me49、TgCgCa1虫株的相似性为100%,推测可能是由弓形虫古老克隆系Ⅰ型、Ⅱ型和TgCgCa1之间重组演化而来[18]。有报道显示,由两个基因型重组的虫株毒力或同母代虫株相似或高于母代虫株,这与两个母代虫株的基因比例有关[19]。本试验验证了BJ株对小鼠的毒力强于Ⅱ型(Pru)虫株,为进一步研究基因重组弓形虫株毒力提供依据。
目前诊断弓形虫病最常用的分子生物学检测方法就是聚合酶链式反应(PCR),利用的靶基因很多,例如B1、ITS-1等[20-21],而使用频率最高且敏感性最好的靶基因是拷贝数为300、长度为529 bp的特异性片段[22]。本试验利用常规PCR方法,以529 bp为靶序列,对弓形虫基因进行特异性扩增。PCR结果显示,感染中期(第8天)为弓形虫在体内大量增殖的时期,并广泛分布于内脏器官中,而此时ELISA检测也发现小鼠血清弓形虫特异性抗体水平快速升高,说明感染中期,大量增殖并迁移的弓形虫引起小鼠强烈的免疫反应,导致小鼠产生典型的弓形虫病症状,甚至死亡。李亚飞等用20个Pru株包囊灌胃给不同品系的小鼠,发现昆明鼠存活率100%,检测2 d后小鼠脑组织包囊数为290.00±129.743,适合做弓形虫耐受模型[23]。吴升伟等给IRC小鼠腹腔注射10个Pru株包囊·只-1,病理切片观察到第10天小鼠脑组织有明显的神经元变性、卫星现象及噬神经现象,第15天起见神经胶质结节及较小的弓形虫包囊,第20天起珠网膜下腔见炎症细胞浸润;并利用Real-time PCR方法检测宿主脑组织中IFN-γ、IL-6和TNF-α细胞因子在感染第10或15天处于低表达水平,这有利于弓形虫逃避宿主的免疫杀伤作用[24]。上述结果均与本试验中脑组织的情况相似。据J. P. Dubey报道,口服感染VEG株包囊76 d后,直接通过显微镜检即可在小鼠脑内观察到组织包囊[25]。此外,从第32天起,感染小鼠的抗体滴度和脑荷虫量均保持增长,但增长速度大大减慢,可能是机体在急性期耐过后,免疫系统对弓形虫强烈的抑制作用,导致弓形虫速殖子逐渐向缓殖子转变,从而与宿主形成动态平衡。李林杰等用RH速殖子腹腔注射SD大鼠,发现在第3周时血清IgG含量达到最高[26]。PCR检测结果也显示,除脑组织外,其他组织中的虫体减少至检测线以下。另外,本试验中采用的PCR方法经实验室验证,最低检测弓形虫的数量为75个,低于检测线时无法用肉眼观察到琼脂糖凝胶电泳的PCR扩增产物。因此,本试验中的阴性检测结果并非完全无弓形虫感染,有可能是虫体量在该感染时间和感染状况下未达到检测线。想要进一步精确判断组织当中有无弓形虫感染,需要用敏感性更高的检测方法进行检测,例如荧光定量PCR等。
4 结论本次弓形虫感染小鼠试验,通过观察感染小鼠临床症状和病理变化,比较了三种虫株对小鼠的致病力,发现Ⅱ型比Ⅲ型虫株的毒力强,非典型弓形虫BJ株毒力比Pru株强。通过分子生物学技术,初步了解三种基因型的弓形虫虫株在小鼠体内动态分布规律,为进一步研究弓形虫在脑内成囊过程及致病机制提供背景资料。
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