隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的寄生性原虫，在世界多个国家和地区广泛分布，可以感染包括人在内的多种宿主动物[1-2]，引起人兽共患隐孢子虫病(cryptosporidiosis)。前人研究表明，牛是最常见的隐孢子虫宿主，也是人类感染隐孢子虫的主要来源[3-4]。可感染牛的隐孢子虫包括微小隐孢子虫(C. parvum)、安氏隐孢子虫(C. andersoni)、牛隐孢子虫(C. bovis)和瑞氏隐孢子虫(C. ryanae)等，其中C. andersoni是最为常见的隐孢子虫种之一[5]。牛感染C. andersoni后，常伴随着体重降低和产奶量减少，犊牛发生水样腹泻甚至危及生命[6-7]。近年来，关于C. andersoni的流行病学研究表明，在各个年龄段的牛中均有C. andersoni感染发生，但在断奶后犊牛感染率较高，且不同地域存在差异[8-11]。此外，C. andersoni感染人体病例首次发现于英国腹泻患者[12]，在国内也有人感染C. andersoni的报道[13-14]。
隐孢子虫的传统鉴定主要基于形态学检查，采用Sheather′s蔗糖溶液漂浮法[15]和改良抗酸染色法[16]，但因为它们的形态相似，在隐孢子虫种的确定中具有一定的难度[17]。近年来，分子生物学方法可以准确识别隐孢子虫种类并对其进行种群遗传学研究[18-19]，其中核糖体小亚基RNA(small subunit ribosome RNA，SSU rRNA)基因[20]和隐孢子虫卵囊壁蛋白(Cryptosporidium oocyst wall protein，COWP)基因[21-22]已被成功用于鉴定宿主和环境中隐孢子虫种类与基因型的遗传标记。但是由于这些基因位点用于检测基因型时分辨率较低，在分子流行病学研究中受到一定的限制。为了评价隐孢子虫的群体遗传结构，Y.Y. Feng等[23]成功建立用于C. andersoni与鼠隐孢子虫(C. muris)基因分型的多位点序列分型工具——MLST(multilocus sequence typing)技术，能够获得详细的多态性序列信息，准确评价其系统发生位置，进一步丰富隐孢子虫的分子遗传学数据。
秦川牛作为国内一种著名的地方肉牛品种，形成于陕西省关中平原，目前已被引入国内多个省份，为人类生活提供必不可少的肉制品。本研究拟采用MLST技术，将陕西省秦川牛犊牛的C. andersoni亚型分布情况与本省的奶牛犊牛阳性样品亚型分布情况进行比较，明确该地区的C. andersoni基因亚型及其分布，评估C. andersoni的感染传播风险，为西北地区隐孢子虫研究积累更多参考数据，以期为制定针对安氏隐孢子虫病的有效防治措施提供详实数据。
1 材料与方法 1.1 样品来源本研究中所用371份犊牛(0~6月龄)粪便样品分别来自于陕西省杨凌、宝鸡、咸阳、铜川、汉中、渭南6个地区20个农场，其中秦川牛犊牛样品173份、奶牛犊牛样品198份，200份来自断奶前犊牛、171份来自断奶后犊牛。每份粪便样品置于15 mL离心管中，标明采样时间、地点以及宿主品种、年龄等信息，置2.5%重铬酸钾溶液4 ℃保存备用。
1.2 粪便基因组DNA提取从2.5%重铬酸钾保存液中取出50~100 mg粪样至1.5 mL离心管中，然后加入蒸馏水清洗样品直至上清透亮后，按照E. Z. N. A. Stool DNA Kit(OMEGA Bio-Tek公司生产)说明提取粪便基因组DNA，于-20 ℃保存备用。
1.3 PCR扩增试验中所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成(表 1)，基于SSU rRNA基因的PCR反应体系中所使用的酶为Ex Taq，用于MLST分型的PCR反应体系中所使用的酶为rTaq，其余试剂均相同(TaKaRa公司)。所有位点均采用巢式PCR扩增，第一轮PCR反应体系包括2.5 μL 10×PCR Buffer，2.0 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，2.0 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，10 nmol·mL-1第一轮上下游引物各1 μL，0.125 μL rTaq或Ex Taq(5 U·μL-1)酶，1 μL DNA模板，双蒸水补齐至25 μL。第二轮PCR反应除了所用模板为第一轮PCR产物，引物为第二轮上下游引物外，其余试剂种类与剂量均与第一轮相同。所有扩增条件除退火温度不同外，其余条件均为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃(或58 ℃、50 ℃、52 ℃)(表 1)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取4 μL第二轮PCR扩增产物在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳结束后，于凝胶成像系统下观察结果。
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表 1 本研究中所用引物的序列及退火温度 Table 1 Primers and annealing temperatures used in the study |
将电泳结果为阳性的第二轮PCR产物以及第二轮引物送上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，测序仪为ABI PRISM 3730 XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。将测得的序列应用软件Clustal X 1.83进行比对，然后将校正后的序列，运用Blast将其与GenBank数据库中的参考序列进行同源搜索，参照图谱进行校正。最后参照Y.Y. Feng等[23]和R.J. Wang等[24]所提供的重复序列(表 2)，对照测定序列进行MLST亚型鉴定与分类。
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表 2 4个基因位点的微卫星和小卫星重复序列 Table 2 The repeat sequence of microsatellite and minisatellite repeats at 4 genetic loci |
为分析安氏隐孢子虫各亚型分布与样品来源地区以及宿主品种的相关性，本研究利用SPSS 19.0软件对其进行χ2检验，当P < 0.05时，差异显著。
2 结果 2.1 Cryptosporidium SSU rRNA基因PCR扩增本研究中利用基于SSU rRNA基因位点的巢式PCR对371份犊牛(0~6月龄)粪便样品进行隐孢子虫检测和虫种鉴定，36份粪便样品成功扩增到约830 bp的目的片段(图 1)，鉴定为C. andersoni，分别来自于陕西省杨凌、宝鸡、咸阳、铜川4个地区10个牛场的0~6月龄奶牛和秦川牛犊牛(表 3)，其中秦川牛犊牛样品10份、奶牛犊牛样品26份，断奶前犊牛样品11份、断奶后犊牛样品25份。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~5. C. andersoni阳性粪便样品；C.阴性对照 M. DNA marker DL2000; 1-5. Fecal samples positive for C. andersoni; C. Negative control 图 1 Cryptosporidium SSU rRNA基因PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplication of Cryptosporidium SSU rRNA gene |
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表 3 本研究中C. andersoni阳性粪便样品信息 Table 3 The information of fecal samples positive for C. andersoni in the present study |
基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点对36份C. andersoni分离株样品进行巢式PCR扩增，分别有19、16、19、15份DNA样品在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点成功扩增(图 2)。10份秦川牛源C. andersoni分离株中有6、5、5、5份分离株分别在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点扩增成功，26份奶牛源C. andersoni分离株中有13、11、14、10份分离株分别在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点扩增成功。
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M. DNA相对分子质量标准DL2000；1~3. CM-MS1位点；4~6. CM-MS2位点；7~9. CM-MS3位点；10~12. CM-MS16位点；C1、C2、C3、C4.阴性对照 M. DNA marker DL2000; 1-3. CM-MS1 locus; 4-6. CM-MS2 locus; 7-9. CM-MS3 locus; 10-12. CM-MS16 locus; C1, C2, C3, C4. Negative control 图 2 C. andersoni 4个基因位点PCR扩增结果 Figure 2 PCR amplication of C. andersoni at four genetic loci |
在36份C. andersoni分离株样品中，有15份在上述4个基因位点均被成功分型，并且它们都来自于断奶后犊牛，其中奶牛样品10份，秦川牛样品5份。多位点基因分型共形成4个MLST亚型，分别为A4、A4、A2、A1，A4、A4、A4、A1，A5、A4、A4、A1，A1、A4、A4、A1。C. andersoni分离株在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16基因位点分别产生3、1、2、1个亚型，其中奶牛源C. andersoni分离株在上述4个基因位点分别产生3、1、2、1个亚型，秦川牛源C. andersoni分离株在上述4个基因位点各产生1个亚型。MLST亚型A4、A4、A2、A1，A5、A4、A4、A1，A1、A4、A4、A1各发现于1头奶牛，而MLST亚型A4、A4、A4、A1为优势亚型，共发现于5头秦川牛和7头奶牛(表 4)。样品来源不同地区以及不同宿主品种的安氏隐孢子虫各亚型分布差异不显著(P>0.05)。
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表 4 不同地区与品种C. andersoni分离株在4个基因位点的MLST亚型分布 Table 4 MLST subtype distribution of C. andersoni isolates at four genetic loci from different regions and breeds |
1907年，E. E. Tyzzer首次在实验鼠胃腺发现隐孢子虫并描述了该物种卵囊的多种特征，后来将其所发现物种命名为C. muris并详细公开报道了该隐孢子虫完整的生活史[25]。1991年，B. C. Anderson从骆驼粪便中分离出C. muris样卵囊并在动物感染试验中成功感染小鼠胃腺，而从牛中获得的卵囊却不能感染小鼠[26]。猜测牛感染的隐孢子虫可能为不同于之前的新物种。2000年，较大的C. muris样卵囊在牛胃中被发现，根据其分子特征和宿主特异性被确立为不同于C. muris的一种新虫种并被命名为C. andersoni[27]。2003年，在日本有关牛隐孢子虫卵囊的研究中，利用卵囊形态学、动物试验和基因分析的方法，发现了疑似C. andersoni的新虫种，推测存在C. andersoni基因亚型[28]。因此，关于C. andersoni的进一步研究需要严格区分其基因型及亚型，开发适用于C. andersoni的基因分型工具。
2011年，Y.Y. Feng等[23]通过筛选C. muris全基因组序列中微卫星和小卫星靶标序列，建立了适用于C. muris和C. andersoni的多位点序列分型工具MLST。在通过PCR和DNA序列评估的13个潜在基因位点中，最终筛选出用于C. andersnoi基因分型的4个有效基因位点CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16[23]。与其他3个位点相比，CM-MS16基因位点的核苷酸序列最为保守，因此，可以从特定宿主C. andersoni分离株的除CM-MS16基因位点外的3个基因位点进行基因分型，来研究该寄生虫的基因内遗传变异情况。在CM-MS1位点，C. andersoni的6种亚型(A1-A6) 遗传差异完全反映在微卫星/小卫星重复的拷贝数中。相比之下，在CM-MS2(A1-A5) 和CM-MS3(A1-A4) 位点，除了依据微卫星/小卫星重复的拷贝数命名C. andersoni单倍型外，在具有相同重复的拷贝数的情况下，C. andersoni单倍型的区分主要根据非重复区域的碱基变化差异[23, 29]。基因亚型分型工具在C. andersoni研究上的应用有助于描述其基因内相对较小的变异，更加细致地表征隐孢子虫的分子遗传特征和传播特征。
利用MLST分型工具，对来自国内外不同地区不同宿主的C. andersoni分离株进行分型，发现美国、加拿大、捷克等欧美国家的C. andersoni分离株基因亚型集中在A1、A3、A4、A1，A2、A3、A1、A1，A2、A3、A2、A1，A2、A3、A4、A1等。而在国内，上述基因亚型较罕见，发现了不同于上述4种亚型的多种C. andersoni基因亚型。总体上，在黑龙江、陕西、新疆等国内许多地区牛源C. andersoni的A4、A4、A4、A1亚型呈广泛分布[9, 29-30]，具有明显优势，这也与本研究的调查结果相同。此外，与Y.Y. Feng等[23]和R.J. Wang等[24]的调查结果相比，本研究在奶牛中发现一种新的C. andersoni MLST亚型(A4、A4、A2、A1)。不同国家与地区牛感染C. andersoni的亚型分布呈现出一定的差异性，这可能与动物品种、样品数量、地理位置及检测方法等因素有关。
总之，本研究对陕西地区奶牛和秦川牛犊牛C. andersoni的流行病学情况进行了调查，分析当地感染的C. andersoni MLST亚型，为有效预防和控制人和牛隐孢子虫病的传播提供理论依据，对当地的人畜健康具有重要的公共卫生学意义。
4 结论利用基于SSU rRNA基因位点的巢式PCR对371份犊牛(0~6月龄)粪便样品进行隐孢子虫检测和虫种鉴定，36份粪便样品为C. andersoni阳性。基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点对该36份犊牛C. andersoni阳性粪便样品进行PCR检测和序列分析，15份C. andersoni分离株在4个基因位点均被成功分型，分别形成A4、A4、A2、A1，A4、A4、A4、A1，A5、A4、A4、A1和A1、A4、A4、A1共4个MLST亚型。其中A4、A4、A4、A1广泛分布于各个养殖场与不同品种犊牛中，为该地区犊牛C. andersoni的优势亚型。陕西地区犊牛C. andersoni存在遗传多样性，具有多种MLST亚型。
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