鸭坦布病毒病是由鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)引起的一种以蛋鸭产蛋量骤然下降为特征的一种急性传染病，该病于2010年在我国江浙地区首次暴发，并迅速传播蔓延，给我国鸭养殖业造成了巨大的经济损失[1-2]。DTMUV属于黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，病毒基因组大小为10 990 nt，含5′-UTR、3′-UTR及中间一个开放的阅读框，不含Ploy A尾巴，病毒基因组共编码3种结构蛋白：C蛋白、M前体蛋白PrM、E蛋白，七种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5[3-5]。黄病毒中E蛋白是病毒的主要结构蛋白，位于病毒颗粒的表面，是引起宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，其表面存在大量的抗原决定簇，具有良好的免疫原性与反应原性，能够诱导宿主产生中和抗体[6-7]。
由于传播迅速，DTMUV的监测和疾病诊断越来越被学者们所重视[8-9]。DTMUV与登革热病毒(DENV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)等黄病毒属同科同属病毒，而黄病毒E蛋白间又有一定的相似性，因此黄病毒属各个病毒阳性血清间具有一定的交叉反应性，这为疾病的血清学诊断造成了一定困难[10]。因此，本研究利用噬菌体展示技术筛选DTMUV E蛋白抗原表位，并利用特异性抗原表位建立Epitope-ELISA血清学诊断方法，为该病的快速检测和临床上抗体水平的评估提供技术手段。
1 材料与方法 1.1 实验材料单克隆抗体(MAb)1A5由本实验室制备保存；鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭瘟病毒(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV)阳性血清均由本实验室保存；登革热病毒(DENV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)等阳性血清由华荣虹与祁贤博士提供。pGEX-6P-1质粒、感受态大肠杆菌DH5α及感受态细胞BL21(DE3) 均购自宝生物(TaKaRa)公司。
1.2 主要试剂噬菌体随机12肽库及限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ购自New England Bio labs公司；T4连接酶购自TaKaRa公司；质粒小量试剂盒购自Axygen公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗M13IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗鸭IgG、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗人IgG均购自KPL公司；蛋白质相对分子质量Marker购自MBI公司；DAB显色液购自北京中杉金桥公司；TMB显色液购自武汉博士德公司；Immobilized Protein G Column购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.3 抗原表位鉴定 1.3.1 单克隆抗体的纯化本实验室以原核表达的DTMUV TA株的囊膜(E)蛋白免疫小鼠，成功制备了一株单克隆抗体(MAb)1A5[11-12]。利用Protein G亲和层析柱对MAb 1A5进行纯化，纯化步骤参考相关文献[13-16]。取500 μL单克隆抗体1A5，10 000 r·min-1离心5 min去除杂质，取上清，用5倍体积的Binding Buffer(PBS, pH 7.2) 进行稀释，将单抗稀释液经过Protein G亲和层析柱进行纯化，上样流速为1.0 mL·min-1。然后用10 mL Binding Buffer再次清洗柱子除去杂质。用5 mL Elution Buffer(PBS, 0.1 mol·L-1 Gly, pH 2.5) 洗脱结合在亲和层析柱上的抗体，流速0.5 mL·min-1，收集洗脱液，每1 mL加入100 μL Neutralization Buffer(PBS, 0.1 mol·L-1 Tris，pH 8.5) 进行中和。纯化后的单克隆抗体用紫外分光光度计测其浓度并取10 μL抗体加入2 μL β巯基乙醇室温孵育5 min，进行SDS-PAGE分析。
1.3.2 生物淘选以纯化的单克隆抗体1A5为固相载体分子对噬菌体随机12肽库进行淘选，淘选步骤参考文献[14-17]。将纯化的MAb 1A5以100 μg·mL-1浓度包被ELISA板，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜，以BSA作为阴性对照。第二日，弃去包被液，用封闭缓冲液(0.1 mol·L-1 NaHCO3, pH 8.6，5 mg·mL-1 BSA, 0.02% NaN3)37 ℃封闭2 h，以0.1%的TBST洗6次。加入噬菌体肽库，室温轻柔振荡1 h，使噬菌体与抗体结合。再次洗涤6次后，每孔加入100 μL 0.2 mol·L-1 Glycine-HCl(pH 2.7) 洗脱，将洗脱液转至1.5 mL离心管，加入15 μL 1 mol·L-1 Tris-HCl (pH 9) 中和至中性。取1 μL中和液测定噬菌体滴度，其余扩增纯化并进行下一轮筛选。共对噬菌体淘选4轮，并且在第2~4轮淘选过程中将包被的抗体浓度分别降低至50、10与10 μg·mL-1，Tween-20的浓度提高到0.5%。第四轮淘选后，挑取单个噬菌斑进行增殖，筛选阳性噬菌斑克隆。
1.3.3 噬菌斑阳性克隆的筛选将MAb 1A5 (100 μg·mL-1)包被ELISA板上，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜。第二天加满封闭缓冲液，37 ℃封闭1 h。甩干封闭缓冲液，加入1×106 pfu噬菌斑克隆，以原始的噬菌体文库为阴性对照，室温温和作用1 h。TBST(0.5% Tween-20) 洗涤6次，加入1:5 000倍稀释的HRP标记的鼠抗M13 IgG，每孔200 μL，37 ℃孵育1 h。洗涤6次，每孔加入100 μL TMB底物溶液，避光室温作用20 min，加入2 mol·L-1 H2SO4终止反应。测定450 nm吸光值。ELISA检测结果阳性者进行测序。
1.3.4 模拟表位分析阳性噬菌斑克隆测序成功后，对噬菌体所展示的12肽序列进行相似性比较分析，根据12肽中各个氨基酸出现的频率及位置关系确定出模拟表位的氨基酸序列，再对模拟表位与DTMUV E蛋白氨基酸序列进行同源性比较，初步确定DTMUV E蛋白上的抗原表位氨基酸序列。
1.3.5 序列合成及重组质粒构建人工合成筛选到的抗原表位的寡核苷酸序列，并用C端与N端逐个氨基酸缩短的方法，设计合成相应多肽的寡核苷酸序列。寡核苷酸序列见表 1。在互补的两条寡核苷酸链中，正义链5′端引入XhoⅠ酶切位点，反义链5′端引入EcoRⅠ酶切位点。寡核苷酸链由吉林省库美生物科技有限公司合成。两条互补的寡核苷酸链，退火后可形成双链的DNA，可直接与EcoRⅠ和XhoⅠ酶切处理的pGEX-6P-1载体连接，得到重组质粒送吉林省库美生物科技有限公司进行测序验证。
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表 1 寡核苷酸序列和其对应的短肽序列 Table 1 The oligo nucleotide sequence of designed short peptide expressions |
将测序正确的重组质粒进行诱导表位，表达后的样品经SDS-PAGE电泳后，电转移到纤维硝酸素(NC)膜上；用5%脱脂乳(PBS)4 ℃封闭过夜，PBS洗3遍，每遍5 min；以1:1 000倍稀释的单抗1A5作为一抗，37 ℃孵育1 h，PBST(0.1% Tween-20) 洗3遍，每遍5 min；然后1:2 000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，37 ℃孵育1 h，PBST(0.1% Tween-20) 洗3遍，每遍5 min；DAB显色，观察结果。
1.3.7 抗原表位同源性分析从GenBank上选取具有代表性的黄病毒属病毒株，如表 2，利用DNAStar Lasergene Program(DNASTAR Inc, Madison, WI, USA)对DTMUV与黄病毒属DENV、JEV、WNV的E蛋白进行序列比对，以分析筛选到的DTMUV E蛋白的线性抗原表位在黄病毒中的同源性。
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表 2 黄病毒毒株相关资料 Table 2 Flaviviruses strains used in the sequence analysis in this study |
利用Dot-Blotting分析筛选到的DTMUV E蛋白的线性抗原表位在DTMUV、JEV、DENV、WNV阳性血清间的交叉反应性。方法：将融合表达的肽段，取5 μL点于NC膜上，室温干燥30 min；用5%脱脂乳(PBS)37 ℃封闭1 h，PBS洗3遍，每遍5 min；将DTMUV(鸭源)、JEV(兔源)、DENV(人源)、WNV(兔源)阳性血清1:10倍稀释，4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍，每遍5 min；将HRP标记的羊抗人IgG、羊抗鸭IgG、羊抗兔IgG二抗进行1:250倍稀释，37 ℃孵育1 h，PBS洗3遍，每遍5 min；DAB显色。
1.4 Epitope-ELISA诊断方法的建立 1.4.1 抗原蛋白和血清最佳稀释度的确定用矩阵滴定法[18-19]对抗原表位融合蛋白的最佳包被浓度及DTMUV阳性血清最佳反应浓度进行确定。将抗原表位融合蛋白以1:10开始进行10倍梯度稀释，包被ELISA板上，每孔加100 μL的包被液，4 ℃孵育过夜。将DTMUV阳性与阴性血清以1:20开始进行2倍梯度稀释，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h。以1:1 500倍稀释的HRP标记的羊抗鸭IgG进行二抗的孵育，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。其他步骤按照ELISA程序进行。最后TMB底物显色液，每孔加50 μL，在37 ℃避光温育显色10 min，以2 mol·L-1 H2SO4终止液中止显色，酶标仪450 nm读取OD值。判定标准：选取阳性血清(P)/阴性血清值(N)＞2.1，且阳性OD450 nm值为接近1.0左右的抗原表位蛋白包被浓度和血清的最大稀释倍数为蛋白质和血清的最佳工作浓度。
1.4.2 封闭液的选择确定抗原表位蛋白与血清最佳工作浓度之后，再分别以5%聚乙烯醇、5%脱脂乳、1% BSA、1%明胶、2%卵清蛋白作为封闭液。计算P/N值，选P/N最大值为最佳封闭液进行后续试验。
1.4.3 待检血清反应时间的确定在确定抗原表位蛋白和血清的最佳工作浓度、最佳封闭液后，将血清孵育时间分别定为37 ℃ 45 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 75 min、37 ℃ 90 min，比较不同孵育时间的P/N值，取P/N最大值为血清最佳反应时间。
1.4.4 酶标二抗最佳反应时间的确定根据上述反应条件，加入二抗后，孵育时间分别为37 ℃ 45 min、37 ℃60 min、37 ℃ 75 min、37 ℃ 90 min，比较各组的P/N值，取P/N的最大值时为二抗最佳反应时间。
1.4.5 阴阳性临界值的确定根据试验确立的ELISA最佳反应条件，对25份鸭DTMUV阴性血清样品进行检测，根据结果计算阴性样品的OD450 nm平均值(x)和标准差(s)，确定阴阳性标准的临界值，阴阳性临界值=阴性样品x+3s。
1.4.6 特异性试验用已经建立的鸭DTMUV血清Epitope-ELISA检测方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)阳性血清进行检测，分析其交叉反应性。
1.4.7 重复性试验批内重复性试验：用同一批次包被的ELISA板，检测6份不同DTMUV血清，进行批内6次重复试验，用统计学分析其结果，以检验其批内重复性。
批间重复性试验：用不同批次包被的ELISA板，加入6份DTMUV血清，进行批内6次重复试验，其结果用统计学分析，以检验其批间重复性。
1.4.8 敏感性试验以血清中和试验(serum neutralization tests，SN)作为标准对126份鸭血清样品进行检测[18]。用建立的Epitope-ELISA对上述126份鸭血清进行检测，以血清中和试验作为标准，根据检测结果计算其特异性与敏感性。
2 结果 2.1 抗原表位鉴定结果 2.1.1 单克隆抗体纯化经Immobilized Protein G Column纯化后的单克隆抗体1A5，利用β巯基乙醇打断二硫键并通过SDS-PAGE进行分析，结果显示分别在55与26 ku处出现单一的重链和轻链条带(图 1)，说明抗体纯化成功，利用紫外分光光度计测得纯化后抗体质量浓度为1.4 mg·mL-1。
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图 1 纯化抗体SDS-PAGE分析 Figure 1 SDS-PAGE analysis of purified MAb |
通过ELISA反应，最终筛选到与单克隆抗体1A5呈现特异性反应的12个阳性克隆，见图 2。
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图 2 噬菌体克隆与MAb结合的ELISA检测结果 Figure 2 Detection of combination between phage and MAb by ELISA |
通过分析阳性噬菌体表面所展示的各个氨基酸出现频率及位置关系，最终确定一个模拟表位序列为YAEYI，将该序列与DTMUV E蛋白氨基酸序列进行比对分析，发现模拟表位序列与E蛋白87-YAEYI-92序列一致(表 3)。
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表 3 噬菌体克隆展示的12肽序列及其同源性分析 Table 3 Peptides sequences of phage clones and their consensus sequences |
将人工合成的寡核苷酸链退火后，直接与酶切的pGEX-6P-1质粒相连，得到的阳性重组质粒进行诱导表达并进行Western blot分析，结果表明，表达的融合蛋白GST-1A5-1可与MAb 1A5发生特异性反应，说明单抗1A5所针对的抗原表位核心氨基酸短肽序列为YAEYI，见图 3。
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Negative control. GST protein; 1A5-1. GST-YAEYI; 1A5-2. GST-AEYI; 1A5-3. GST-YAEY; Positive control. E protein 图 3 短肽融合蛋白与单抗的Western blot分析 Figure 3 Western blot analysis of the reactivity of short peptide-fused protein |
利用DNAStar，将筛选到的线性抗原表位YAEYI与DENV、JEV、WNV的E蛋白序列进行比较，结果显示DTMUV E蛋白抗原表位YAEYI的氨基酸序列在DTMUV中具有高度的保守性，无氨基酸位点差异，而与其他几种黄病毒则不具有同源性，表明抗原表位YAEYI为DTMUV所特有的抗原表位，见图 4。
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图 4 黄病毒属病毒之间同源序列比较 Figure 4 Homologous sequence comparison of flaviviruses |
通过Dot-Blotting结果发现抗原表位YAEYI与DTMUV阳性血清均具有良好的亲和性，且在其他黄病毒阳性血清间不具有交叉反应性，表明抗原表位YAEYI是DTMUV所特有的抗原表位，见图 5。
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图 5 抗原表位与黄病毒阳性血清交叉反应性分析 Figure 5 The cross-reactivity of the epitopes to the Japanese encephalitis virus (JEV), dengue virus (DENV), West Nile virus (WNV) |
通过矩阵法对血清与抗原表位融合蛋白进行倍比稀释，确定了血清的最佳稀释倍数和抗原表位融合蛋白的最佳包被浓度。检测结果见表 4，当抗原表位蛋白浓度1:100稀释至6.4 μg·mL-1，血清样品进行1:80稀释时，此时P/N值最大，为8.48，因此6.4 μg·mL-1为表位蛋白最佳包被浓度，1:80为血清最佳稀释倍数。
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表 4 抗原蛋白和血清最佳稀释度的确定(OD450 nm) Table 4 The optimum antigen protein coating concentration and the best dilution of the serum (OD450 nm) |
分别以5%聚乙烯醇、5%脱脂乳、1% BSA、1%明胶、2%卵清蛋白作为封闭液对ELISA板进行封闭，血清样品进行检测，如表 5，结果显示当封闭液为1% BSA时，P/N值(为7.8) 最大，因此所建立的Epitope-ELISA检测方法中最佳封闭液为1% BSA。
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表 5 最佳封闭液的确定 Table 5 The optimal blocking agent |
在确定抗原表位蛋白和血清的最佳工作浓度、最佳封闭液后，将血清孵育时间分别定为37 ℃ 45 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 75 min、37 ℃ 90 min，结果见表 6，当反应时间为1 h时，P/N值最大，为7.327。据此，确定血清最佳反应时间为1 h。
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表 6 血清最佳反应时间确定 Table 6 The optimal reaction time of serum |
根据以上反应条件，加入二抗后，孵育时间分别为37 ℃ 45 min、37 ℃ 60 min、37 ℃ 75 min、37 ℃ 90 min，结果见表 7，当二抗作用时间为1 h时，P/N值为7.643，高于其他二抗反应时间的检测结果，据此确定二抗最佳作用时间为1 h。
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表 7 酶标二抗最佳反应时间的确定 Table 7 The optimal reaction time of enzyme labeled antibody |
根据以上试验确立的ELISA最佳反应条件，对25份鸭DTMUV阴性血清样品进行检测，见图 6，根据结果计算阴性样品的OD450 nm的x和s，阴阳性临界值=0.235+3×0.046 5。最终得出阴阳性临界值为0.375。检测结果≥0.375即为阳性，检测结果＜0.375即为阴性。
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图 6 DTMUV特异性抗原表位与鸭阴性血清ELISA反应 Figure 6 ELISA reactivities of DTMUV synthetic peptide with negative serum samples |
用已经建立的特异性抗原表位ELISA检测方法对DHV-Ⅰ、DEV、MDPV阳性血清以及DENV、JEV、WNV黄病毒阳性血清检测。结果见图 7，DTMUV阳性血清检测结果为阳性，其他病毒阳性血清检测结果均为阴性，OD值小于0.375。说明本研究建立的ELISA检测方法与其他病毒阳性血清没有交叉反应，特异性比较好。
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A.DTWUV阳性血清；B.DHV-Ⅰ阳性血清；C.DEV阳性血清；D.MDPV阳性血清；E.DENV阳性血清；F.JEV阳性血清；G.WNV阳性血清 A.DTWUV positive sera; B.DHV-Ⅰ positive sera; C.DEV positive sera; D.MDPV positive sera; E.DENV positive sera; F.JEV positive sera; G.WNV positive sera 图 7 特异性试验 Figure 7 The specificity experiment result |
根据统计学分析结果，见表 8，批内重复性试验变异系数小于9%，批间重复性试验变异系数均小于11%，说明本实验室建立的Epitope-ELISA诊断方法重复性良好。
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表 8 批内、批间重复性试验结果 Table 8 Intra and inter-assay of ELISA |
用建立的Epitope-ELISA检测方法与血清中和试验(SN)标准检测方法对126份鸭血清样品进行检测，见表 9，血清中和试验分别检测出101份鸭阳性血清(P)与25份鸭阴性血清(N)，Epitope-ELISA方法分别检测到97份鸭阳性血清(P)与29份鸭阴性血清(N)，两种检测方法一致的结果共有97份鸭阳性血清与25份鸭阴性血清，以血清中和试验作为标准，则计算得到Epitope-ELISA检测结果的相对特异性为100%，相对敏感度为96%。
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表 9 血清中和试验与Epitope-ELISA血清检测结果对比试验 Table 9 The result of SN tests and Epitope-ELISA for detection of DTMUV-related sera |
鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，黄病毒属各种病毒E蛋白间的相似性较高，因此黄病毒属各个病毒血清间存在一定的交叉反应性，利用DTMUV E蛋白建立的E-ELISA(E-Protein-BasedEnzyme-Linked Immunosorbent Assay)血清学诊断方法以及利用纯化的灭活病毒作为抗原建立的ELISA血清学诊断方法均存在黄病毒阳性血清的交叉反应问题，这为鸭坦布苏病毒病的诊断造成了一定困难[20-22]。本试验利用噬菌体展示技术成功筛选到一个DTMUV E蛋白特异性抗原表位YAEYI，并利用表位建立了Epitope-ELISA诊断方法。Epitope-ELISA诊断方法是一种特异性的检测方法，该方法仅对DTMUV阳性血清具有反应性，而对鸭其他种类传染病病原的阳性血清以及DENV、JEV、WNV等阳性血清不具有反应性。
本研究优化完善了Epitope-ELISA反应条件，通过矩阵滴定法最终确定抗原表位融合蛋白的最佳包被浓度为6.4 μg·mL-1，血清的最佳稀释度数为1:80。为达到最佳的封闭效果本研究以1% BSA作为封闭液，最大限度减小了非特异性的结合。利用建立的Epitope-ELISA检测方法对25份鸭阴性血清进行检测，根据检测结果最终确定阴阳性临界值为0.375。特异性试验表明，DEV、DHAV、MDPV、DENV、JEV和WNV阳性血清检测值均为阴性，说明该种检测方法值仅针对于DTMUV血清的检测。Epitope-ELISA检测方法的批内变异系数为5.08%~8.07%，批间变异系数为8.24%~10.97%，变异系数都小于11%，说明同一样品在同批次和不同批次的ELISA板的检测结果差异不大，该方法具有良好的重复性。用建立的Epitoe-ELISA检测方法和血清中和试验对126份鸭血清样品进行检测，以中和试验为标准确定出101份鸭阳性血清样品，25份鸭阴性血清样品，分别在利用Epitope-ELISA检测方法对这101份鸭阳性血清样品进行检测，结果确定97份阳性，25份阴性，则相对特异性为100%，而利用Epitope-ELSIA检测方法对25份鸭阴性血清进行检测，结果也均为阴性，则其相对敏感度为96%。
但是本试验建立的Epitope-ELISA检测方法所检测到的阳性样品的OD值均偏低，在亲和力上还有待进一步优化提高。
4 结论成功鉴定到一个DTMUV E蛋白特异性的抗原表位YAEYI，并利用该表位建立了Epitope-ELISA血清学诊断方法，该方法特异性好、无交叉反应性，可用于DTMUV的临床诊断和抗体水平的评价。
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