2. 华中农业大学动物医学院, 武汉 430070;
3. 生猪健康养殖协同创新中心, 武汉 430070
, KU Xu-gang1,2, YU Xue-xiang1,2, GUO Heng-ke1,2, HE Dong-xian1,2, FAN Sheng-xian2, HE Qi-gai1,2,3
2. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
3. The Innovative Center for Pig Healthy and Substantial Production, Wuhan 430070, China
IFN-γ作为一种具有免疫调节作用的细胞因子，可促进静止的CD4+T细胞分化为Th1型细胞，促进Th1型细胞因子的分泌，增强细胞免疫功能[1]，通常认为，其内源性水平高低能反映出机体的细胞免疫状态，而机体的细胞免疫状态在抵抗猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)的过程中起到重要的作用[2-7]。考虑到常用的抗体检测方法不能完整地反映出机体对PRV的保护力[8]，因此建立PRV特异性的细胞免疫检测手段势在必行。目前常见的细胞免疫评估方法有IFN-γ-ELISA、RT-qPCR、有限稀释法、Cr51释放法和四聚体法等[9-15]，与这些方法相比，ELISpot法不但敏感性高、特异性强，而且在单细胞水平上反映机体针对特定病原的细胞免疫状态，排除了机体代谢对试验结果的影响，结果准确，可信度高[16]。1983年，C. C. Czerkinsky等首先提出并成功地利用ELISpot技术检测出分泌抗体的B细胞[17]，此后，随着抗体制备技术改良、PVDF膜等新材料的引进，ELISpot方法逐渐成熟、完善[18-19]，如今已成为世界公认灵敏性最高的体外检测抗原特异性T细胞的技术，并被广泛应用于感染性疾病的诊断、疫苗研究和免疫学研究等多方面[20-24]，但目前尚未见PRV相关ELISpot方法的应用。因此在参考其他病原相关ELISpot检测方法[25-27]基础上，笔者旨在建立PRV特异性IFN-γ的ELISpot检测方法，结合动物免疫攻毒试验，从细胞免疫角度，评价现有伪狂犬病疫苗免疫效果，进而评价不同猪伪狂犬病疫苗免疫程序的免疫效果，为该病免疫防控提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂检测单抗Anti-Porcine Interferon-γ mAb P2C11-biotin(Code：3130-6-250)，捕获单抗Anti-Porcine Interferon-γ mAb pIFNγ-Ⅰ-purified(Code：3130-6-250) 购于MAB公司，Streptavidin-HRP(Lot.4AD111614F)购于北京四正柏公司，AEC coloring system(Cat: DKW02-0001) 购于达科为生物工程有限公司，PVDF膜板：Multiscreen 96-well Filtration Plate(Cat. No. MAHAS4510) 购于Millipore公司，RPMI1640购于GIBCO公司，人外周血淋巴细胞分离液(Lot.20150805-0656) 购于天津灏洋生物制品有限公司，荧光定量PCR试剂盒THUNDERBIRD qPCR Mix和Genomic DNA Purification Kit MagExtractor购自日本TOYOBO公司。
1.1.2 细胞、病毒及疫苗猪伪狂犬病毒野毒株(HNX株)由本实验室分离保存；本试验刺激原为HNX株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化，取30%与45%之间层，经PBS脱糖后，分光光度计测定蛋白质含量后分装，于-80 ℃保存；本试验使用弱毒疫苗为商品化猪伪狂犬弱毒疫苗[兽药生字(2016)170041117]；灭活疫苗为本实验室制备，即将HNX-gE缺失株经0.4%甲醛37 ℃灭活3 d，并盲传3代确认灭活后，使用ISA201佐剂制备而成，最终病毒滴度为108 TCID50·mL-1。
1.1.3 试验动物32头14日龄体重相近的健康杜长大仔猪，经gB-ELISA抗体检测试剂盒(IDEXX, USA)检测为伪狂犬病抗体阴性。
1.2 方法 1.2.1 IFN-γ ELISpot方法的建立 1.2.1.1 外周血单核细胞(PBMC)的分离无菌采集猪前腔静脉血2.5 mL于抗凝管中，立即摇匀；将抗凝血与等量3%胎牛血清PBS混匀，以提高分离效果，降低细胞凝聚；取3 mL淋巴细胞分离液于无菌15 mL离心管中，将离心管倾斜45°，距分离液上方约1 cm处缓慢加入抗凝血，注意保持两者界面清晰；室温下2 000 r·min-1离心30 min，取第二层(灰白色层，即PBMC)加入到约5 mL 3%胎牛血清PBS，1 000 r·min-1离心10 min，3 mL红细胞裂解液重悬并静置5 min，1 000 r·min-1离心5 min，5 mL 3%胎牛血清PBS重悬；1 000 r·min-1离心10 min，用1 mL含10%胎牛血清的1 640培养基重悬并计数细胞。随后开展活细胞检测，即4%台盼蓝与等量分离细胞混合均匀，静置2 min后镜检，此时活细胞不着色，死细胞染成蓝色，要求细胞活率95%以上。
1.2.1.2 ELISpot基本步骤取PVDF膜板，35%乙醇15 μL·孔-1预湿不超过1 min；无菌水200 μL·孔-1洗板5次，每次3 min；加入100 μL用培养基稀释好的捕获单抗(10 μg·mL-1)，4 ℃过夜包被(约16 h)。取出包被好的膜板，倾去多余单抗，加入无菌PBS 20 μL·孔-1，洗5次，每次3 min；再加入含10%胎牛血清1640培养基200 μL·孔-1，37 ℃封闭2 h；倾去培养基，加入一定量刺激原，并悬滴加入一定量的PBMC，37 ℃、5% CO2培养箱培养；取出后倾去培养液，加入PBS 200 μL·孔-1洗5次；用含0.5%胎牛血清的PBS稀释检测抗体浓度至0.5 μg·mL-1，每孔加入100 μL，室温下静置2 h；加入PBS 200 μL·孔-1洗5次；加入亲和素化HRP(用含0.5%胎牛血清PBS按1:500稀释)100 μL·孔-1，室温静置1 h；每孔加入200 μL PBS，洗5次；每孔加入100 μL AEC显色底物，避光显色约30 min；待出现明显斑点后用去离子水洗涤数次，通风处自然干燥后计数。
1.2.1.3 最佳刺激原浓度选择PRV抗体阴性猪用商品化伪狂犬病弱毒疫苗免疫后14 d，采集阳性全血，免疫前血液作为阴性全血。分离外周淋巴细胞并计数，加入PBMC至细胞密度为106·孔-1，培养时间36 h。加入不同刺激原浓度(每孔分别为0.1、1、2、4、8 μg)，每个处理设置3个重复，继续ELISpot其余步骤。以试验组斑点数目合适(斑点清晰、无重叠，便于计数)，同时对照组无明显斑点为判断标准，确定最佳刺激原浓度。
1.2.1.4 最佳作用时间选择采集“1.2.1.3 ”中的阴阳性全血，以刺激原浓度分别为0和2 μg·孔-1的刺激下，设置作用时间梯度为24、36、48、60、72 h，每个处理设置3个重复，继续ELISpot其他步骤。以试验组斑点数目合适(斑点清晰、无重叠，便于计数)，同时对照组无明显斑点为判断标准，确定最佳培养时间。各种对照组设置如下：阴性刺激组、阴性未刺激组分别为阴性全血设置条件梯度后加或不加刺激物；免疫全血未加刺激物为阳性样品未刺激对照；试验组为阳性全血加刺激物。
1.2.1.5 最佳细胞浓度选择取“1.2.1.3 ”制备的阴、阳性全血，以刺激原浓度分别为0和2 μg·孔-1刺激，培养36 h，设置每孔细胞浓度梯度分别为2×105、4×105、6×105、8×105、106个，每个处理设置3个重复，继续ELISpot其他操作步骤。以试验组斑点数目合适(斑点清晰、无重叠，便于计数)，同时对照组无明显斑点为判断标准，确定最佳培养时间。
1.2.2 方法的特异性验证将12头猪随机分为6组，每组2头，1组做阴性对照，其余5组分别免疫猪伪狂犬病弱毒苗和临床上常用的猪流行性腹泻弱毒苗、猪瘟弱毒苗、猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗和轮状病毒弱毒苗，免疫后14 d采集全血做ELISpot检测。
1.2.3 三种伪狂犬病免疫程序的体液及细胞免疫评价 1.2.3.1 试验猪的分组、免疫、攻毒及采样将20头猪随机分为弱毒疫苗免疫组、灭活疫苗免疫组、弱毒疫苗-灭活疫苗免疫组和对照组等4组，每组5头。灭活疫苗免疫剂量为2 mL·头-1，弱毒疫苗免疫剂量为1头份；免疫前及首免后3、7、10、14 d，二免后3、7、10、14 d采集全血及血清。各组在二免后14 d用HNX株经滴鼻攻毒，剂量为2×107 TCID50·头-1。攻毒后每天采集鼻拭子检测排毒情况。
1.2.3.2 IFN-γ ELISpot检测将采集的各组全血分离PBMC后，按照建立的ELISpot试验步骤检测(刺激原浓度为2 μg·孔-1、PBMC浓度为106·孔-1，培养时间为36 h)。每份样品做1孔阴性对照(刺激原为等量无菌PBS)。
1.2.3.3 伪狂犬病gB抗体ELISA检测利用商品化试剂盒检测免疫前及一免后7、14 d和二免后7、14 d各组血清中gB抗体。
1.2.3.4 伪狂犬病中和抗体检测将200 TCID50的HNX株病毒液与不同稀释度的各组血清孵化，加入PK-15细胞悬液，设立病毒对照和正常细胞对照，连续观察3 d，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。当中和效价≤1:2时，判为伪狂犬病抗体阴性。
1.2.3.5 攻毒猪临床症状观察攻毒后每天定时测定体温及观察临床症状，临床症状除观察其是否死亡外，主要观察呼吸道症状、精神状态及神经症状，每头猪出现一项症状记1分，以综合判定攻毒后各组动物的临床症状。
1.2.3.6 动物排毒监测用无菌棉签采集试验猪鼻拭子，用PBS重悬震荡，10 000 r·min-1离心10 min，取上清，按DNA提取试剂盒步骤提取伪狂犬病毒DNA，采用gD 基因TaqMan荧光定量PCR方法检测排毒情况，引物和探针序列为：PRV-gD-F (5′-CATCCTCACCGACTTCAT-3′)、PRV-gD-R(5′-TACCAGTAGTTCACCACC-3′)和PRV-gD-probe(5′-CAAGAGTGCCCGTTCGCC-3′)。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 20 s、60 ℃ 50 s，40个循环；72 ℃ 10min。
1.3 试验数据统计分析所有数据以均值±标准差(x±s)表示。采用Graphpad prism 6统计软件进行作图及统计学分析，组间差异显著性采用t检验进行处理，P < 0.05认为差异显著，P < 0.01认为差异极显著。
2 结果 2.1 IFN-γ ELISpot最佳反应条件的确定 2.1.1 确定最佳刺激原浓度如图 1所示，随着伪狂犬病毒蛋白刺激原浓度的升高，试验组全血出现的斑点数目逐渐增加。在刺激原浓度为2 μg·孔-1时斑点数目达到最高，为(158.33±7.57) 个·孔-1，此时对照组非特异性斑点为(7.67±0.58) 个·孔-1，信噪比最大。当继续增加刺激原浓度时，试验组斑点数目几乎不变，但对照组出现非特异性斑点增加，达到(13.33±4.51) 个·孔-1。因此本试验选择2 μg·孔-1为最适刺激原浓度。
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图 1 刺激原浓度对IFN-γ分泌的影响 Figure 1 Effect of stimulant concentrations on the IFN-γ secretion |
如图 2所示，随着作用时间的增加，试验组形成斑点数目逐渐增加，在24、36、48、60和72 h时，每孔的斑点数分别达到71.33±4.16、150.67±5.03、205.33±13.01、210.00±14.79和289.33±4.16个。在48和60 h时试验组斑点数变化不明显，而在作用时间为36 h时，试验组斑点数为(150.67±17.16) 个·孔-1，阴性刺激组为(5.33±0.47) 个·孔-1，信噪比最高，因此选择36 h为试验方法的最佳培养时间。
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图 2 作用时间对IFN-γ分泌的影响 Figure 2 Effect of incubation time on the IFN-γ secretion |
如图 3所示，随着每孔PMBC细胞数目的增加，试验组形成的斑点数目逐渐增多，而阴性刺激组、阳性未刺激组及阴性未刺激组斑点数目均很少，为0~5个·孔-1，在细胞浓度为106个·孔-1时，斑点数目为(169.33±5.51) 个·孔-1，斑点数目对比最高。
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图 3 细胞数目对IFN-γ分泌的影响 Figure 3 Effect of cell number on the IFN-γ secretion |
用所建立方法分别检测单独免疫猪伪狂犬病弱毒苗、猪流行性腹泻弱毒苗、猪瘟弱毒苗、猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗和轮状病毒弱毒苗各组的样品，结果如图 4所示，仅免疫过猪伪狂犬病弱毒苗组可检测到明显斑点，其余各疫苗免疫组结果与阴性对照无明显差异。
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A.阴性对照；B.猪伪狂犬病弱毒苗组；C.猪流行性腹泻弱毒苗组；D.猪瘟弱毒苗组；E.猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗组；F.猪轮状病毒弱毒苗组 A. Negative control; B. PRV vaccine group; C. PEDV vaccine group; D. CSFV vaccine group; E. PRRSV vaccine group; F. PoRV vaccine group 图 4 PRV弱毒苗与其他弱毒疫苗免疫组IFN-γ检测斑点结果比较 Figure 4 Comparison of ELISpot results between PRV vaccinated group and other live vaccine immunized group |
如图 5所示，单独弱毒疫苗组和弱毒疫苗-灭活疫苗组在首免后7 d，能检测到明显斑点，说明开始产生IFN-γ，并在二免后3 d显著升高，产生的斑点数可分别达到(182.40±16.01) 和(167.00±28.87) 个·孔-1，并维持至二免后14 d；但在二免后7、14 d，这两组的斑点数存在显著差异(P < 0.05)。单独灭活疫苗组在首免后第10天出现明显斑点，持续升高至一免后14 d，斑点数为(39.40±8.71) 个·孔-1，再用灭活疫苗加强免疫后，斑点数无明显升高，维持该水平至二免后14 d，且自首免后7 d起，单独灭活疫苗组与其余两试验组在斑点数上存在极显著差异(P < 0.01)。对照组在检测中无明显斑点。
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图 5 免疫后不同时间动物全血ELISpot检测结果 Figure 5 The IFN-γ-ELISpot results at different time after immunization |
结果如图 6所示，三组试验组均在一免后7 d gB抗体转阳，且三组间S/N值无明显差异，一免后14 d灭活苗组显著低于其余两组(P < 0.05)，一免弱毒苗二免灭活苗组二免后7 d S/N值开始下降并于二免后14 d显著低于弱毒苗组(P < 0.05)。
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图 6 免疫后不同时间动物血清gB抗体检测结果 Figure 6 The gB-ELISA results at different time after immunization |
如表 1所示，单独灭活疫苗组在首免后2周即可检测到中和抗体，并在二免后1周中和抗体效价显著上升，大部分猪(4/5) 中和抗体效价在1:32以上；免疫弱毒疫苗组在二免后2周，部分试验猪(3/5) 可检测到中和抗体；首免弱毒疫苗二免灭活疫苗组，在二免后1周有3头试验猪(3/5) 可检测到中和抗体，并在二免后2周有较显著的升高，效价均在1:11.22以上。
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表 1 中和试验结果 Table 1 The results of neutralization test |
如图 7、8所示，非免疫对照组于攻毒后4 d死亡3头，5 d后均死亡。而三种不同免疫程序免疫组均能获得良好的保护力，在攻毒后观察期间的存活率为100%。三组试验组均在攻毒后第2天开始出现体温升高、精神沉郁，部分猪出现后肢抽搐等神经症状。其中弱毒疫苗-灭活疫苗组在攻毒后症状较轻微，且攻毒后猪体温全程较其余两组低，攻毒8 d后仅部分试验猪(2/5) 表现为呼吸道症状，至第11天症状消失；而弱毒疫苗组在攻毒后8 d内表现出呼吸道症状和神经症状等，8 d后逐渐恢复正常，第11天也恢复正常；灭活疫苗组在攻毒5 d开始出现神经症状，且攻毒8 d后仍有部分猪(2/5) 表现出该症状，但11 d后症状消失，猪群食欲正常。
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图 7 攻毒后各组体温变化 Figure 7 The rectal temperature changes of each group after challenge |
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图 8 攻毒后各组临床症状分值 Figure 8 The clinical symptom values of each group after challenge |
如图 9，荧光定量PCR结果显示，攻毒后第1天四组即可检测到明显排毒，并在第5天左右排毒开始减少。弱毒疫苗-灭活疫苗联合组的排毒量，均低于其余两免疫组，其中攻毒后第2、4、7天排毒量显著低于弱毒疫苗组(P < 0.05)，第4、5天的排毒量显著低于灭活疫苗组(P < 0.05)。
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图 9 攻毒后仔猪排毒变化 Figure 9 Virus shedding in the piglets post challenge |
目前临床上常用gB-ELISA及中和试验来评价猪伪狂犬病疫苗的免疫效果，中和试验是最为可靠和经典的方法，应用十分广泛，然而有学者在猪伪狂犬基因缺失苗研究过程中的结果显示，基因缺失弱毒疫苗免疫后，虽未检测到明显中和抗体，却仍能提供足够的保护力[28]，这与本试验结果相似，同时考虑到猪伪狂犬病毒作为疱疹病毒科的一员，机体的细胞免疫水平在病毒入侵初期及恢复期时起到的重要作用，这提示我们，仅从体液免疫角度评价猪伪狂犬病疫苗过于片面。
目前临床使用的疫苗有活疫苗和灭活疫苗。传统疫苗在预防新毒株引起的伪狂犬病方面有其局限性，不能提供完整的保护力，究其原因有两个：体液免疫和细胞免疫均不能同时兼顾。文献报道，在鸡新城疫和禽流感防控中，活疫苗和灭活疫苗组合取得了良好的免疫效果[29-30]。本研究中，笔者比较了单独使用活疫苗或灭活疫苗以及活疫苗与灭活疫苗组合的免疫应答。抗体测定显示，含ISA201佐剂的HNX-gE缺失灭活疫苗在初次免疫后1周，全部产生gB抗体，并有部分猪(3/5) 开始产生中和抗体，首免后2周，gB抗体水平继续升高，所有免疫猪均产生了针对新毒株HNX中和抗体，在三种疫苗免疫组合中，灭活疫苗刺激产生的中和抗体和ELISA抗体水平最高。相反，活疫苗首免后1周和2周，虽然都产生了与灭活苗组相似水平的gB抗体，但是针对新毒株的中和抗体并没有产生，gB抗体与抗HNX株的中和抗体没有呈现很强的相关性；临床上以gB抗体效价来评价疫苗保护力，证据尚未充足。不过，活疫苗组产生的IFN-γ水平最高，证明了活疫苗比灭活疫苗能诱导更高水平的细胞免疫能力。而在活疫苗与灭活疫苗组合在二免后猪的gB抗体与灭活苗组接近、同时也产生针对HNX株的中和抗体，加上可刺激产生高于单独使用灭活苗免疫猪的IFN-γ，但在研究中未能获得IFN-γ水平高低与临床保护力之间的直接关系。IFN-γ具有免疫调节作用，诱导细胞免疫，从而抑制病毒急性感染并限制病毒在神经节中的数量，使其不能以潜伏状态存在，同时也能阻止体内重新激活病毒的传播，机体虽呈潜伏感染状态，临床症状却不出现或不明显。此外，在本试验中还可以看出，传统活疫苗能刺激产生gB抗体，但不能中和HNX毒株，这提示中和试验结果受伪狂犬病毒株类型的影响，但用以新毒株HNX株制备的灭活疫苗来加强免疫，就可产生针对HNX株的中和抗体。再次感染伪狂犬病时，体液免疫是细胞免疫产生的重要辅助因素。当前，伪狂犬病毒变异毒株之间的基因组同源性高于传统疫苗与变异毒株的同源性，因此，笔者认为，活疫苗加上新毒株灭活疫苗组合，可能是应对伪狂犬病变异毒株感染的免疫方式。
目前，相较于其他常见方法而言，如IFN-γ-ELISA，ELISpot法一方面具有病原特异性和更高的敏感性；另一方面，该方法是在单细胞水平上进行的检测，能够排除代谢等因素的干扰，更加准确的反映出机体针对某种特异病原的细胞免疫状态。当然，作为世界公认灵敏性最高的体外检测抗原特异性T细胞的技术，其结果易受到多种因素，如包被板材质、细胞状态和刺激物类别等的影响。因此为保证该方法的可信度，需要对所建立的ELISpot检测法进行标准化以及更多临床数据的检测。
4 结论通过对最佳刺激原浓度、外周血单核细胞(PBMC)浓度和培养时间条件的摸索，建立了有效的PRV特异性IFN-γ的ELISpot检测方法；并利用所建立方法，结合常规体液免疫检测方法和攻毒保护试验，评价了三种免疫程序的体液和细胞免疫，证明了弱毒疫苗与灭活疫苗组合免疫动物，能产生较高水平的体液免疫和细胞免疫水平，可提供最强的保护力。
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