, XIE Zhi-xun
, XIE Zhi-qin, XIE Li-ji, HUANG Li, HUANG Jiao-ling, ZHANG Yan-fang, ZENG Ting-ting, WANG Sheng, LUO Si-si, DENG Xian-wen, LIU Jia-bo, PANG Yao-shan
目前我国现有牛存栏数1.38亿头，牛肉产量达到675.9万t，是世界第四大牛肉生产国[1-2]。随着养牛业的发展，牛传染病的发病率也在逐年升高，已经成为制约养牛业发展的一大重要因素。具体表现为：老病仍在流行，新病陆续出现，病原出现了新的血清型或变异株，给牛病的防控带来困难[3]。每年因疾病死亡造成了严重的经济损失，据统计2015年全年国内肉牛因传染病全程死亡率高达5%，导致的直接经济损失高达90亿~150亿元[4]。口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus，FMDV)、蓝舌病病毒(bluetongue virus，BTV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheal virus，BVDV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus，BRV)、产肠毒大肠杆菌(enterotoxigenic E. coli，ETEC)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV，又名bovine herpesvirus 1) 和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)是严重危害养牛业的8种主要传染病病原，这些病原的存在，时时刻刻危害着养牛业的发展。FMDV、VSV和BTV是牛的高度急性传染病，一般呈暴发性流行，临床上在口腔、蹄部及乳房出现病变，症状十分相似，难以区分，死亡率高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的传染病[5-8]。BVDV、BRV和ETEC是引起牛腹泻的主要病原体。BVDV以持续性感染无症状形式存在，牛群中相当一部分牛是BVDV携带者，BVDV降低机体抵抗力，常伴随着其他疾病暴发，症状为急性水样腹泻，急速消瘦[9-11]。IBR属于免疫抑制性疾病，病毒感染机体后还可继发细菌感染，据调查不仅各品种的牛均有感染的报道，而且感染地区遍布全国各省市，感染率居高[12]。PPR是近年来出现的外来新病，OIE将其列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病[13]。这些疾病是养牛业的巨大潜患，一旦暴发，将会造成巨大的经济损失。因此开展牛传染病快速检测技术的研究势在必行。
快速准确地检测诊断传染病是进行有效防控的前提和基础[14]。目前用于鉴别诊断这些牛传染病的检测方法有很多种，如病毒分离、荧光抗体染色技术、ELISA方法、PCR方法、荧光PCR和LAMP等。但这些方法在临床实际应用中仍然存在着不足之处:病毒分离培养技术特异性强，但是其耗时长，敏感性不高；荧光抗体检测技术检测速度快，但对病料的新鲜度和抗体的特异性要求较高；ELISA方法特异性好，但只能检测单一病毒；PCR、荧光PCR和LAMP，特异性好，但只能对单一或2~4种病原体进行检测，无法实现真正意义上的同时对多种病原体实行高通量检测。
GeXP多基因表达分析系统是一种新型的高通量的基因检测技术，将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效地结合起来，采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5′端连接通用引物)相结合从而引发多重PCR体系的扩增，可同时对多达30个目的基因进行有效检测分析，实现真正意义上的高通量检测鉴别多种病原体的目的[15-19]。因此针对以上问题，本研究旨在建立一种同时鉴别FMDV、BTV、VSV、BVDV、BRV、ETEC、IBRV和PPRV的GeXP高通量检测方法。开展这种高通量检测和新型快速检测技术的研究，为8种牛常见病原体的检测提供技术支撑，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障养牛业的健康发展。
1 材料与方法 1.1 试剂和仪器Genome Lab GeXP Starter试剂盒、DNA size standard kit-400 Base Pairs、分离缓冲液、分离胶、液体石蜡、上样板和毛细管购自美国贝克曼公司，JumpStart Taq DNA聚合酶，Mg2+购自美国SIGMA公司，pEASY-T1载体、DNA/RNA共提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，反转录、premixTaq PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，MidiPlasmidkid质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，T7体外转录试剂盒购自Fermentas公司。PCR仪购自美国Thermo公司，NanoDrop ND-2000紫外分光光度计购自美国NanoDrop公司，GeXP多基因表达分析系统购自美国贝克曼公司。
1.2 样品的准备O型、A型、AsiaⅠ型口蹄疫灭活疫苗购自兰州兽医研究所，O型、A型、AsiaⅠ型口蹄疫灭活病毒，新泽西型(NJ型)和印第安型(IND型)水疱性口炎灭活病毒，蓝舌病灭活病毒(4型、8型、9型、15型、17型、18型)，小反刍兽疫灭活病毒由云南出入境检验检疫局惠赠。3株牛病毒性腹泻病毒参考毒株，2株牛轮状病毒参考毒株，1株牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株购自中国兽医药品监察所，14株BVDV广西分离株，8株BRV广西分离株和3株ETEC由本实验室分离、保存。参照全式金RNA/DNA共提试剂盒说明书，抽提毒株的RNA/DNA，RNA病毒需反转录成cDNA，将cDNA和DNA模板于-20 ℃保存，备用。
1.3 引物的设计从GenBank数据库中下载8种病原体的基因序列，将序列经过MegAlign软件进行比对分析，选择保守和特异的区域，用Primer premier 5.0软件设计特异性引物。分别在各对特异性引物的正、反向5′端加通用引物标签：Tag-F：5′-AGGTGACACTATAGAATA和Tag-R：5′-GTACGACTCACTATAGGGA，构成8对特异性嵌合引物，引物由北京华大公司合成，PAGE纯化，引物信息见表 1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer Sequences |
反应体系为20 μL：cDNA/DNA模板1 μL(含cDNA/DNA 106~10 ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5× buffer 4 μL(buffer内含通用引物，工作浓度为0.25 μmol·L-1), MgCl2(25 μmol·L-1) 4 μL，嵌合引物混合物1 μL(各引物浓度见表 1)，Thermo-Start DNA polymerase 10 U，超纯水补足体积。
反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，10个循环；72 ℃延伸5 min，结束反应。
毛细管电泳检测结果：取3 μL PCR产物和36.75 μL样品缓冲液，0.25 μL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡振荡混匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入4/5的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件：90 ℃ 120 s，变性；2.0 kV 30 s，吸入样品；6.0 kV 35 min，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软件Express Profiler software分析结果，横坐标表示片段大小，纵坐标表示荧光信号强度，即PCR产物的含量。
1.5 质粒标准品的准备用特异性引物扩增各毒株的目的片段，与pEASY-T1载体连接后构建GeXP各目的片段的重组质粒(pEASY-T1-BTV、pEASY-T1-FMDV、pEASY-T1-IBRV、pEASY-T1-BRV、pEASY-T1-ETEC、pEASY-T1-VSV、pEASY-T1-BVDV和pEASY-T1-PPRV)，提取阳性克隆质粒。用NanoDrop紫外分光光度计测定pEASY-T1-IBRV和pEASY-T1-ETEC质粒浓度。参照T7体外转录试剂盒说明书将提取的阳性克隆质粒(pEASY-T1-BTV、pEASY-T1-FMDV、pEASY-T1-BRV、pEASY-T1-VSV、pEASY-T1-BVDV和pEASY-T1--PPRV)体外转录为RNA，用NanoDrop测定RNA浓度，根据相对分子质量及浓度计算各质粒拷贝数为拷贝数制备标准品，将各质粒浓度稀释到108~1拷贝·μL-1，-70 ℃保存备用。
1.6 特异性试验将8对特异嵌合引物参照表 1浓度混合，配制成GeXP多重PCR反应的引物工作液，参照“1.4”的反应体系和程序，进行多引物单一模板和多引物多模板的试验，验证GeXP多重PCR体系中引物的特异性。多引物单一模板：在8对引物同时存在的多重反应体系中，逐一与每个病原体核酸模板反应；多引物多模板：在8对引物同时存在的多重反应体系中，将8种牛传染病cDNA/DNA全部混合作为模板，进行GeXP多重PCR特异性分析。
1.7 敏感性试验将8种质粒等量混合，保证每种质粒浓度为108、107、106、105、104、103、102、10、1拷贝·μL-1，将所制备的标准样品参照“1.4”的反应体系和程序，进行GeXP多重PCR灵敏性分析。
1.8 模拟混合感染干扰性试验为了测试不同模板之间浓度差异较大时，高浓度模板是否抑制低浓度模板的扩增，是否仍能敏感的检测到低浓度的模板，使用不同浓度的核酸组合为模板进行GeXP多重PCR。制备2组不同模板浓度的模拟混合感染样品(最高模板浓度至少是最低模板浓度的104倍)，样品A：BTV(108拷贝·μL-1)+FMDV(104拷贝·μL-1)+IBRV(104拷贝·μL-1)+BRV(104拷贝·μL-1)+ETEC(106拷贝·μL-1)，样品B：IBRV(103拷贝·μL-1)+BRV(105拷贝·μL-1)+ETEC(105拷贝·μL-1)+BVDV(105拷贝·μL-1)+PPRV(107拷贝·μL-1)，进行GeXP多重PCR干扰性分析。
1.9 临床样品的检测305份临床样品包括：156份粪便拭子，30份眼拭子，30份鼻黏液拭子，70份抗凝血，2份OP液(食道-咽部分泌物)，2份水疱液，15份组织样品(10份直肠黏膜，2份水疱皮，3份淋巴结)。临床样品2012-2014采集于年广西各地，263份样品来源于各地奶牛场无症状奶牛，28份样品来源于具有腹泻、消瘦、流鼻涕等临床症状的牛，14份样品来源于具有“精神不撅，吞咽困难，发烧，口腔糜烂出现水疱，口鼻白沫”等症状的牛。拭子样品用1 mL PBS洗脱，离心取上清抽提总RNA/DNA；组织样品混合匀浆后抽提总RNA/DNA，按照建立的GeXP多重PCR方法进行检测，同时以本研究设计的特异性引物进行SYBR Green Ⅰ荧光PCR，并将阳性PCR产物克隆至pEASY-T1载体，送深圳华大公司测序，以验证阳性样品结果。
2 结果 2.1 引物验证GeXP多重PCR多引物单模板扩增毛细管电泳结果显示，8种牛病原体目的基因的扩增片段大小分别如下，BTV:135~137 bp，FMDV：165~167 bp，IBRV：187~189 bp，BRV：211~214 bp，ETEC：252~254 bp，VSV：278~281 bp，BVDV:308~310 bp，PPRV：342~345 bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片段大小与理论值存在±2 bp偏差，属于正确结果，与试验相符。
2.2 特异性试验分析经过体系优化，最终嵌合引物的比例和浓度见表 1。应用建立的GeXP多重PCR方法，以表 2中所列毒株为模板进行多引物单一模板特异性试验，每个反应只出现特异性单峰，无其他信号峰，且片段大小与引物设计预期相符：BTV、FMDV、IBRV、BRV、ETEC、VSV、BVDV和PPRV分别出现136.72、165.03、188.21、211.71、252.24、278.04、309.58和344.20 bp特异性单峰。阴性对照均无扩增，无目的信号峰值，仅有DNA标准的信号峰，结果见图 1。
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表 2 毒株和菌株来源 Table 2 Sources of Pathogens |
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图 1 GeXP多重PCR多引物单一模板多引物结果 Figure 1 Specificity results of the GeXP-mono PCR assay |
进行多引物多模板特异性试验，8种病原混合模板检测，可同时检出8个目的信号峰。136.17、166.39、187.25、213.71、253.23、280.40、309.59、342.16 bp分别为BTV、FMDV、IBRV、BRV、ETEC、VSV、BVDV和PPRV的信号峰，无其他杂峰，表明样品中同时含有8种牛病原体，与试验设计符合，结果见图 2。
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图 2 GeXP多重PCR多引物多模板结果 Figure 2 Specificity results of the GeXP-multiplex PCR assay with mixed template of 8 cattle infectious pathogens |
在8对引物同时存在的GeXP多重体系中，检测10倍梯度稀释的混合模板标准品，结果显示(图 3)，均可在100拷贝·μL-1反应信号水平上同时特异性检测出8种牛病原体，可见该方法灵敏性高。
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图 3 GeXP多重PCR敏感性试验结果 Figure 3 Sensitivity results of GeXP-multiplex PCR assay |
将2组不同模板浓度组合的模拟混合感染样品用建立的GeXP多重PCR方法进行检测，得到与预期相符合特异性峰。图 4所示为不同模板浓度组合的模拟混合感染样品的毛细管电泳结果。结果显示，当起始模板的浓度悬殊较大时，仍能准确敏感地检测出低浓度的模板，干扰性小，如图 4所示。
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样品A. BTV (108拷贝·μL-1)+FMDV (104拷贝·μL-1)+IBRV (104拷贝·μL-1)+BRV (104拷贝·μL-1)+ETEC (106拷贝·μL-1)；样品B. IBRV (103拷贝·μL-1)+BRV (105拷贝·μL-1)+ETEC (105拷贝·μL-1)+BVDV (105拷贝·μL-1)+PPRV (107拷贝·μL-1) Sample A. BTV (108 copies·μL-1)+FMDV (104 copies·μL-1)+IBRV (104 copies·μL-1)+BRV (104 copies·μL-1)+ETEC (106 copies·μL-1); Sample B. IBRV (103 copies·μL-1)+BRV (105 copies·μL-1)+ETEC (105 copies·μL-1)+BVDV (105 copies·μL-1)+PPRV (107 copies·μL-1) 图 4 GeXP多重PCR敏感性试验结果 Figure 4 Interference results of GeXP-multiplex PCR assay |
305份临床样品的检测结果见表 3。结果显示，应用建立的GeXP多重PCR结果与荧光PCR结果相符，并且测序结果显示阳性结果均为对应的病原体，无非特异性扩增的假阳性。305份样品中，146份检测结果为阳性，其中单重感染为90份(29.5%)，混合感染28份(9.2%)，混合感染样品中，BVDV+ETEC混合感染23份(7.5%)，BRV+ETEC混合感染5份(1.6%)。
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表 3 GeXP多重PCR对305份临床样品的检测结果 Table 3 Clinical detection results of 305 samples |
FMDV、BTV、VSV、BVDV、BRV、ETEC、IBRV和PPRV是养牛业常见的8种传染病病原，相关疾病感染率高，广泛地存在全国各地，一旦暴发流行，将造成巨大的经济损失。准确地诊断监测是传染病防控的有效手段，目前中国动物疾病预防控制中心每年需对全国各地FMDV、PPRV和BTV进行流行病学监测。因此，有必要建立一种特异、敏感、高通量的检测诊断方法，为牛传染病的防控提供技术支持。
GeXP多基因表达分析系统是目前最方便、快速的高通量检测技术。目前最常见多种病原体的检测技术是常规多重PCR和荧光多重PCR，但它们检测目的基因数量有限，常规多重PCR受PCR产物条带的大小和琼脂糖凝胶电泳的限制最多只能检测到4重，荧光多重PCR受激发光和吸收光的限制最多检测3重，都达不到真正的高通量、快速检测和分析多种病原的目的。本研究借助的GeXP多基因表达分析系统是一种新型高通量的基因检测技术，将多重PCR技术和毛细管电泳技术有效地结合起来，荧光基团标记的PCR产物最终通过毛细管电泳进行区分，可区分相差大于7 bp以上的PCR产物。引物合成时，在基因特异性引物5′端加上通用引物序列，形成特异性嵌合引物。PCR扩增时，目的基因与特异性嵌合引物相结合进行第一次扩增，随后荧光标记通用引物和特异性嵌合引物相结合进行第二次扩增，因此把多对引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，使各模板的扩增效率趋于一致，而大大减少各引物间的干扰抑制作用，从而达到真正的高通量检测鉴别多个病原体的目的。设计引物时，每对引物扩增的PCR产物之间至少相差7 bp即可区分，通过毛细管电泳辨认扩增片段大小从而判定检测结果。这项技术目前已经应用于多种动物疾病的诊断：如9种鸡呼吸道病，11种鸭病，8种猪呼吸道和繁殖障碍病原体，8种鸡免疫抑制病，H5亚型禽流感等[20-24]。目前常见的另一种高通量检测技术是基因芯片，朱晓光等应用基因芯片技术检测6种麻疹病毒属病毒，史茜等建立了牛新孢子虫基因芯片检测方法[25-26]。基因芯片技术虽然灵敏度和特异性均好，但芯片影响因素较多，标签确认困难，结果不能直接读取，一次需检测多个样品，成本高。GeXP多基因表达分析系统低成本，操作简便，可直接读取结果，可灵活选择检测样品数量，适用于临床样品的检测。
临床检测结果中，BVDV与ETEC，BRV与ETEC混合感染率高，分别是7.5%和1.6%，没有检出BVDV和BRV混合感染结果。我们推测BVDV感染牛时，引起机体免疫力下降，使其他病原体容易入侵机体，因此常伴有ETEC的共感染。BRV主要感染1月龄内的犊牛，虽然有些轮状病毒感染犊牛没有特征性临床症状表现，但仍能从其粪便中检测到BRV的病毒粒子，BR急性腹泻通常是由于BRV与ETEC混合感染造成的，破坏绒毛肠细胞，使肠绒毛吸收功能失去平衡，分泌强于吸收而导致腹泄。由于感染BVDV和BRV的牛发病年龄有相差，因此很少见BVDV与BRV共感染。这些混合感染的样品均采集自腹泻重症表现的牛，这些牛吸吮反应下降，水样腹泻带血，部分粪伴有黏膜脱落，脱水严重，犊牛同时伴有右下腹部鼓胀，小肠积水。由这些临床症状看来，混合感染加剧了疾病的发生，非常严重。在临床样品的检测中，没有检测到VSV。有263份样品采集自没有任何症状的牛，但仍能检测到病原，其中以BVDV感染最多，再次证明了这些病毒在牛群中间广泛存在，是养牛业的安全隐患，必须准确检测并淘汰才能保障养牛业的健康发展。
在实际操作中，由于每种疾病病原富集的部位不同，所以需采集不同的样品进行检测。可从同一机体采集不同样品，进行混合，对混合样品统一处理后抽提RNA/DNA进行检测。除ETEC和IBRV外，其他都是RNA病毒，故使用RNA/DNA共提试剂盒进行核酸抽提，再进行反转录，使用的反转录试剂盒对核酸中的DNA成分无影响，全程只需一次抽提，一次PCR，一次电泳，即可得到8种牛病的检测结果。一次GeXP最多可检测96份样品, 其高通量的优势非常适合大规模检测或流行病学调查。
4 结论成功建立同时监测8种牛常见病原体的GeXP多重PCR方法，能够特异、敏感、高通量地鉴别检测8种牛常见传染病，可以成为临床鉴别诊断和流行病学调查的有用工具。
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