2. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100193
, XU Ye-fen1
, NIU Jia-qiang1, WANG Hong-hui1, SUOLANG Si-zhu1, QIANGBA Yang-zong1, ZHANG De-cheng1, GUO Min2, CHENG Ling-hua2
2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)在哺乳动物体内有广泛作用，它经过细胞外信号途径广泛调控细胞的增殖、分化、凋亡等[1-5]，对雌性动物卵巢、卵母细胞生长、颗粒细胞增殖、激素分泌、卵泡生长等方面也均具有重要调控作用[1]，而Smads蛋白是将TGF-β信号传导至细胞核的介导蛋白，在TGF-β信号传导过程中起着关键性作用[6-7]。迄今为止，已经发现9种哺乳动物的Smads蛋白，分别为Smad 1~9，其中Smad 1~3、Smad 5、Smad 8、Smad 9是受体激活型Smad蛋白(Recepter Activated Smad，R-Smad)；Smad 6和Smad 7是抑制型Smad蛋白(Inhibitory Smads，I-Smads)[8]；Smad 4是通用调节型Smad蛋白(Common mediator Smads，Co-Smads)[9]，在TGF-β信号传导过程中，R-Smad首先被激活的受体磷酸化，然后与Smad 4结合形成异源性聚合体，进入细胞核，从而调控目的基因的表达[8]，故Smad 4在TGF-β信号传导过程中起着中枢性作用[3, 6, 10]。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类小的，内源性的非编码RNA，大小为18~24个核苷酸, 主要是通过转录后调控的方式实现对基因表达的调控[11]。miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶基因或者阻遏靶基因的翻译[12]。有研究表明，miRNA对卵泡和卵母细胞的生长、成熟有不可替代的作用[13]。miR-23a通过靶定X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)基因促进人的颗粒细胞的凋亡[14]。在小鼠的研究中发现，miR-383通过靶定RNA结合基序单链结合蛋白1(RNA binding motif, single stranded interacting protein 1, RBMS 1) 基因与miR-224通过靶定Smad 4基因均能促进颗粒细胞增殖、激素分泌以及芳香酶表达[15-17]，而miR-145通过靶定细胞周期素D2(CyclinB 1, Ccnd 2) 基因抑制颗粒细胞的增殖[18]。在猪的研究中发现，miR-26b通过靶定铵转运蛋白(Ammonium transporter, AMT)基因抑制芳香酶表达和激素分泌，并且促进颗粒细胞的凋亡[19]。但关于牦牛Smad 4基因与靶定其基因的miRNA未见报道，因此，本试验拟研究牦牛Smad 4基因mRNA组织表达谱并探索研究靶定Smad 4基因的miRNAs，从miRNAs角度探讨Smad信号通路新的调控方式，有助于阐明Smad信号通路调节牦牛卵泡功能的新机制，并为人工干预牦牛生殖过程提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试剂选取健康的2岁西藏江达母牦牛3头，屠宰后立即采集牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织，置于含Sample Protector for RNA溶液的冻存管内，-4 ℃过夜后，置于-80 ℃冰箱保存，用于总RNA提取。Trizol试剂购自于Invitrogen公司，mRNA反转录试剂盒购自Zomanbio公司，miRNA反转录试剂盒购自HaiGene公司，PCR Premix Taq、DEPC、DNA maker、Sample Protector for RNA均购自TaKaRa公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 总RNA提取用Trizol提取法提取各组织总RNA，具体操作参照试剂盒(Invitrogen公司)说明书进行，主要步骤：取50 mg组织样放置于无RNA酶的离心管中，加入1 mL Trizol，用Bullet Blender(美国Next Advance公司)进行组织匀浆后，将匀浆组织上清液转入新EP管中，在室温15~30 ℃下放置5 min，各加0.2 mL氯仿，用力震荡15 s，在室温下(15~30 ℃)放置2~3 min后，12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min；将上层水相置于新EP管中，各加0.5 mL异丙醇，在室温下(15~30 ℃)放置10 min后，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min；弃上清，各加1 mL 75%乙醇进行洗涤，7 500 r·min-1、4 ℃离心5 min，弃上清，让沉淀的RNA在室温下自然干燥5 min，用50 μL RNase-free water溶解RNA沉淀；然后用Thermo公司的NanoDrop 2000超微量分光光度计检测其RNA浓度和纯度(OD260 nm/OD280 nm=1.8~2.0)，-80 ℃保存。
1.3 反转录与RT-PCR检测 1.3.1 mRNA反转录和RT-PCR检测根据反转录试剂盒EX 5×RT Master MIX(Zomanbio公司)说明进行mRNA反转录，具体操作：反转录体系为20 μL，在冰上操作，在离心管中加入总RNA 2 μL、EX 5×RT Master MIX 2 μL、RNase-Free ddH2O 16 μL；反应条件为25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，RT产物-20 ℃保存备用。
从GenBank中检索到Smad 4和β-actin参考序列信息，用Primer premier 5.0软件设计β-actin引物，并参考张小辉[20]的引物设计Smad 4引物(表 1)，由上海赛百盛基因技术有限公司合成。PCR反应体系：Premix TaqTM 4 μL、上游和下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、RT产物0.4 μL、ddH2O 4.8 μL；PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下切取目的片段，用V-gene DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，纯化的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行克隆测序。组织表达谱RT-PCR检测产物用8%聚丙烯酰胺凝胶(Acr：Bis=29：1) 电泳分离，银染后用凝胶成像系统(美国Bio-Rad)照相，利用Quantity One V4.52软件对Smad 4及内参基因β-actin的目的条带进行灰度体积分析，目的基因/内参基因得到Smad 4 mRNA在各种组织中的相对表达量。
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表 1 PCR引物参数 Table 1 Primer parameters of PCR |
运用加PloyA尾法设计Ploy(T)引物序列5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T)12V(A\G\C) N-3′，再根据HaiGene公司反转录试剂盒One Step miRNA cDNA Synthesis Kit说明进行，具体操作：反转录体系为20 μL，在冰上操作，在离心管中加入总RNA(800 ng·μL-1) 1 μL、4×One step miRNA RT solution 5 μL、Ploy(T)2 μL、RNase-Free ddH2O 12 μL；反应条件为37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，RT产物-20 ℃保存备用。
设计各miRNA特异引物(表 1)，由上海赛百盛基因技术有限公司合成。PCR反应体系：TaKaRa Primer TaqTM 4 μL、正反引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、反转录产物0.4 μL、ddH2O 4.8 μL；PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，利用Quantity One V4.52软件对目的miRNA及内参5.8S的目的条带进行灰度体积分析，目的miRNA/内参5.8S得到各miRNA在各种组织中的相对表达量。
1.4 靶定牦牛Smad 4基因的miRNA预测利用Targetscan(http://www.targetscan.org)在线预测软件，以Smad 4基因作为靶基因，系统默认参数，预测靶定此基因的miRNA，并联合miRBase(http://www.mirbase.org)数据库，在多个miRNAs中挑选可能与Smad 4基因相关的miRNA。
1.5 数据分析Smad 4基因mRNA和miRNA相对表达量在各组织中的差异用SPSS 19.0软件包中One-way ANOVA进行分析，结果均为“平均值±标准误(x±SD)”。
2 结果 2.1 牦牛Smad 4基因mRNA的组织表达谱以牦牛组织总RNA混合物为模板，用所设计的Smad 4和β-actin基因引物分别进行RT-PCR扩增，结果见图 1。进一步测序发现Smad 4的扩增产物为209 bp，β-actin基因的扩增产物为148 bp, 与预期片段大小一致，与引物设计源序列同源性均为100%，结果表明，PCR扩增片段为牦牛的Smad 4和β-actin基因cDNA特异片段。利用RT-PCR对牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫12种组织中Smad 4和内参基因β-actin片段进行RT-PCR扩增，其产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图 2)。由图 2可知，牦牛Smad 4基因是一个表达谱很广的基因，在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织均有mRNA表达。然后利用Quantity One V4.52软件对3头牦牛目的条带进行灰度体积分析获得Smad 4基因mRNA相对表达量(图 3)，结果表明，在牦牛的肝组织表达水平显著高于肾组织(P＜0.05)，极显著高于其他组织(P＜0.01)；在下丘脑组织表达水平极显著低于其他组织(P＜0.01)；在牦牛生殖系统的卵巢、输卵管、子宫组织中也广泛表达，而且在卵巢组织的表达量与下丘脑、垂体、肝、肾、输卵管组织差异极显著(P＜0.01)。
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M. DNA相对分子质量标准；1.牦牛Smad 4基因扩增片段；2.牦牛β-actin基因扩增片段 M. DL2000 DNA marker; 1.Fragments amplified of Smad 4 gene in yak; 2.Fragments amplified of β-actin gene in yak 图 1 牦牛Smad 4和β-actin基因的RT-PCR电泳图 Figure 1 RT-PCR electrophoresis of Smad 4 and β-actin genes in yak |
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M. DNA相对分子质量标准；1.下丘脑；2垂体；3.肝；4.心；5.脾；6.肺；7.肾；8.肌肉；9.淋巴结；10.卵巢；11.输卵管；12.子宫。图 3~5同 M.DL2000 DNA marker; 1.Hypothalamus; 2.Pituitary; 3.Liver; 4.Heart; 5.Spleen; 6.Lung; 7.Kidney; 8. Muscle; 9. Lymph node; 10. Ovary; 11.Oviduct; 12.Uterus.The same as figure 3-5 图 2 牦牛Smad 4基因的mRNA组织表达谱 Figure 2 The mRNA expression profile of Smad 4 gene in yak |
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不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。下同 Different superscript lowercase and capital letters indicate significant difference(P < 0.05) and extremely significant difference(P < 0.01). The same as below 图 3 牦牛Smad 4基因mRNA在不同组织的相对表达量 Figure 3 The relative expression levels of Smad 4 mRNA in various tissues of yak |
TargetScan(http://www.targetscan.org)是常用的miRNA靶基因预测软件之一。在Targetscan软件计算机算法中，miRNA的5′端第2~8位碱基与miRNA的3′-UTR要完全互补，这些互补序列被称作“miRNA种子序列”，这一区域在其他物种中具有同源保守性，然后种子序列向两端伸展直到碱基配对出现错误为止，但是伸展期间允许G:U配对[22]。TargetScan是目前预测miRNA靶基因阳性率和预测准确度较高、数据库更新较快的软件[23]。由于目前TargetScan和miRBase两个大数据库里，属种只有人、鼠、牛，没有关于牦牛的miRNA，因此选择在牛miRNA数据库中进行牦牛Smad 4基因靶标miRNA预测。本研究运用TargentScan和miRBase在线预测软件对牦牛靶基因Smad 4进行miRNA预测，共预测到20个miRNA，筛选其中6个miRNAs用于本试验研究，分别是bta-miR-106a、bta-miR-146a、bta-miR-212、bta-miR-224、bta-miR-377和bta-miR-1434-5p。对筛选的6个miRNAs采用RT-PCR技术在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫等12种组织分别进行组织表达谱分析，以5.8S基因为内参，PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图 4)，再利用Quantity One V4.52软件对筛选的6个miRNA进行灰度体积分析获得相对表达量(图 5)。由图 4、图 5可知，bta-miR-106a和bta-miR-377在各组织中均有表达，而且bta-miR-106a在卵巢组织中表达水平极显著高于心、肌肉、输卵管组织(P＜0.01)；bta-miR-146a、bta-miR-224和bta-miR-1434-5p除输卵管外，在其他组织均有表达，其中bta-miR-1434-5p在卵巢组织中表达水平较高，极显著高于心、肺、肾、肌肉、淋巴结、子宫组织(P＜0.05)；bta-miR-212只在卵巢组织中有表达。
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图 4 牦牛miRNAs组织表达谱 Figure 4 The miRNAs expression profiles in yak |
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A.bta-miR-106a; B.bta-miR-146a; C.bta-miR-224; D.bta-miR-377; E.bta-miR-1434-5p; F.bta-miR-212 图 5 牦牛miRNAs组织表达水平 Figure 5 The relative miRNAs expression level in various tissues of yak |
在哺乳动物，Smads蛋白是将TGF-β信号传导至细胞核的介导蛋白，在TGF-β信号传导过程中起着关键性作用，而在哺乳动物中Smad 4是唯一一种Co-smad，在TGF-β超家族信号转导中起核心作用[1-3, 6, 8-10]。当Smad 4缺失时会阻断信号传导通路，使上游信号分子所携带的信息无法传递进入细胞核。本文研究发现牦牛Smad 4基因在下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫等组织均有表达，这与张小辉在黄牛上的研究结果基本是一致的[20, 24]，也与猪、鼠、鸡和羊等其他物种的研究结果是一致的[25-28]，说明Smad 4基因在牦牛各组织中可能发挥重要作用。而且现研究也已证明，Smad 4基因在小鼠多种组织中发挥着重要作用，例如，I.P.Moskowitz等[29]敲除小鼠心内膜中Smad 4基因会导致上皮细胞向间充质细胞转化功能激活受阻、心内膜细胞增殖停止、心室心内膜结构异型，从而影响心正常生长；X.Mao等[30]敲除小鼠胚胎平滑肌细胞Smad 4基因影响平滑肌细胞分化、增殖、迁移等，从而导致胚胎心血管机能不全，造成14.5 d胚胎出现死亡；L.L.Yang等[31]敲除小鼠表皮Smad 4基因会使毛囊干细胞持续性激活消耗，从而导致皮肤肿瘤形成。本研究检测到Smad 4基因在牦牛生殖系统的卵巢、输卵管、子宫组织中广泛表达，尤其发现在牦牛卵巢组织中Smad 4基因mRNA表达量与下丘脑、垂体、肝、肺、肾、输卵管组织差异极显著(P＜0.01)，表明Smad 4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中可能也发挥作用，而小鼠上的研究已发现Smad 4基因在卵巢中表达广泛，其中在卵泡中表达更加明显，而且随着卵巢的成熟，表达量逐渐上升[26]。当特异性敲除Smad 4基因后小鼠排卵数、产仔数等生殖能力随时间而逐渐下降，并且有腔卵泡明显减少，闭锁卵泡大大增加，表明Smad 4基因在小鼠卵巢卵泡发育过程中确实发挥着关键性作用[32-33]，但是在牦牛卵巢卵泡发育过程中Smad 4基因是否具有相同作用，还有待于人们的进一步探索和研究。
微小RNA (micro RNA, miRNA)是一类小的，内源性的非编码RNA，大小为18~24个核苷酸，主要是通过转录后调控的方式实现对基因表达的调控。本研究预测靶定Smad 4基因miRNA，并利用RT-PCR分析发现bta-miR-106a和bta-miR-377在各组织中均有表达；bta-miR-146a、bta-miR-224、bta-miR-1434-5p除了在输卵管中没有表达外，在其他组织均有表达，说明它们可能在牦牛各组织中发挥调节作用。现研究已经表明，小鼠miR-224通过靶定Smad4能促进颗粒细胞增殖[34-35]、激素分泌以及芳香酶表达[15-16]，延迟卵丘卵母细胞成熟[36]；J.M.Huszar等[37]发现miR-146主要是经过视黄酸信号途径调控小鼠精原细胞分化；B.Feng等[38]发现miRNA-106a在结直肠癌中影响直肠癌细胞的迁移和入侵；M.Zhu等[39-40]发现沉默miRNA-106a在胃癌细胞中表达会抑制其细胞增殖、迁移、入侵等细胞功能；F.Meng等[41]研究发现，miRNA-377高表达会通过星形胶质细胞上调基因-1途径抑制肺癌细胞生长、增殖、迁移、入侵等细胞功能。此外，本研究还发现bta-miR-212只在牦牛卵巢中有表达，提示它可能仅在牦牛卵巢组织发挥作用，但是在牦牛上是否具有相同生物学效应及是否也通过靶定基因Smad 4发挥作用，有待于下一步深入研究证实。
4 结论牦牛Smad 4基因mRNA的组织表达谱研究显示，此基因在所检测的牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、股二头肌、下颌淋巴结、卵巢、输卵管、子宫12种组织中均有表达，说明Smad 4基因在牦牛各组织中可能发挥重要作用。预测到靶定牦牛Smad 4基因的miRNA有20个，从中选择6个进行组织表达分析发现：bta-miR-106a和bta-miR-377在检测的12种组织中均有表达；bta-miR-146a、bta-miR-224、bta-miR-1434-5p除在输卵管外，在其他组织均有表达；bta-miR-212只在卵巢组织中有表达，提示其可能在牦牛卵巢组织中发挥重要的靶基因调节作用，需要进一步加以深入研究。
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