2. 河北省畜牧兽医研究所, 保定 071000
2. Hebei Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Baoding 071000, China
肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)，又称为GDF-8，为转化生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族成员之一，是能够在骨骼肌中特异表达的一类糖蛋白，负向调控肌肉的生长和发育。MSTN基因敲除的小鼠骨骼肌是野生型小鼠的3倍以上[1]。同样有研究发现，该基因自然突变可导致双肌表型的牛、人、绵羊及犬等[2-5]。有研究表明，MSTN基因在胎儿期及成年期都调控着骨骼肌的数量[6]，因此在畜牧生产中可以通过抑制MSTN基因的表达增加产肉量。
RNA干扰通过内源性或外源性双链RNA诱发同源mRNA高效特异性降解，从而阻断基因表达[7]。RNA干扰的有效性依赖于基因载体转移效率的制约，RNA干扰的长期性可以通过基因载体产生的shRNAs实现。已有研究报道利用shRNA质粒载体和慢病毒载体成功干扰绵羊、山羊、鸡、牛等多个物种的MSTN[8-13]，但质粒载体的转染效率会受到细胞类型的影响，而慢病毒载体会整合到宿主细胞基因组，并且有潜在的致病风险[14-15]。腺病毒载体无论是对体外培养的细胞还是直接进入活体动物体均具备很多优势，可以高效转染多种细胞类型，且不会引起宿主强烈的免疫反应。
本研究通过构建绵羊MSTN基因的shRNA干扰腺病毒载体，评估干扰MSTN效果，确定干扰绵羊MSTN基因对生肌调节因子(MRFs)即生肌决定因子(Myogenic factor 5, Myf5)、成肌分化因子(Myogenic Differentiation Antigen, MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin, MyoG)和Myf6即肌调节因子4 (Muscle regulatory factor 4, MRF4) 的影响，探讨绵羊成肌细胞中MSTN的调控机制；同时分析腺病毒载体感染成肌细胞后引起的副作用，检测了干扰素诱导基因2’, 5’-寡聚核酸酶(2’-5’-oligoadenylate synthetase1，OAS1) 和干扰素受体基因(Interferon gamma receptor 1, IFNGR1) 的表达情况，为探索通过腺病毒介导shRNA干扰绵羊MSTN基因提高产肉量提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料本实验室分离纯化的小尾寒羊成肌细胞[16]；293T细胞、工程菌株DH5α、质粒Pgenesil 13、pAd/PL-DESTTM Gateway® Vector腺病毒载体购自武汉淅玛生物技术有限公司。兔抗鼠MSTN、MyoD、MyoG、IFNGR1和OAS1多克隆抗体购自Eterlife公司；兔抗鼠Myf5、Myf6多克隆抗体购自Aviva公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗购自天德悦生物公司。
1.2 shRNA干扰质粒载体构建根据GenBank中绵羊MSTN基因的mRNA序列(NM_001009428)，利用武汉淅玛生物技术有限公司设计的基因序列分析软件设计shRNA靶位点，见表 1，1条位于MSTN编码区的511位点(表 1中MSTN-A和MSTN-C黑体所示序列)，另外1条参考文献[17]设计，位于编码区的218位点(表 1中MSTN-B和MSTN-D黑体所示序列)。另外设计无特异性序列作为非靶向的阴性对照(NC1：5′-AGTCGTAGTAGCGATGTGGTT-3′及NC2：5′-GACATTTCGAAGTACTCAGCG-3′)。按照文献[18]所示方法以pGenesil-13为底物进行重组PCR，第一组引物为A+B, 第二组引物为C+D。PCR产物纯化后用Bsa Ⅰ酶切，T4酶连接，分别构建单元干扰质粒载体ShR218、ShR511和双元干扰质粒载体ShR3+4及双元阴性对照质粒载体ShRNC。
|
表 1 ShR3+4引物序列 Table 1 Primer sequences of ShR3+4 |
转染前24 h，将状态良好，处于对数生长期的细胞，按照每孔5×105个细胞接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%~80%时进行转染，试验分为RNAi组(ShR218、ShR511、ShR3+4)，NC组(阴性对照)和NT组(空白对照)，每组3个重复。将7.5 μL Lipofectamine 3000加入到125 μL Opti-MEM培养基混匀，将2.5 μg质粒DNA加入到125 μL Opti-MEM培养基，然后加入5 μL P3000混匀(6孔板每孔用量)。将稀释的质粒加入到稀释的Lipofectamine 3000试剂中，室温孵育5 min后加入到细胞中。48 h后在荧光显微镜下观察并拍照，用流式细胞仪测定转染效率。通过qRT-PCR方法检测干扰质粒载体对MSTN基因的干扰效果[19]，干扰效率=基因表达量下调比值/转染效率。
1.4 包装重组腺病毒载体从质粒载体上通过LR体外同源重组将干扰效果好的质粒载体表达框转移至pAd/PL-DESTTM腺病毒表达载体上。提取质粒后利用酶切和测序鉴定阳性克隆。用PacⅠ酶切线性化重组腺病毒DNA转染HEK 293细胞放大培养重组腺病毒，利用TCID50法检测滴度。
1.5 重组腺病毒感染绵羊成肌细胞铺板前使成肌细胞的生长状态最佳，按1×106个·孔-1接种于6孔板，使转染时细胞密度达到80%左右。将腺病毒原液用不含抗生素的培养液稀释100倍，转染前将旧的培养基去除，每孔加入1 mL病毒稀释液。感染5 h后进行换液，24 h后在倒置荧光显微镜下观察细胞生长状况及绿色荧光蛋白表达情况。
1.6 qRT-PCR检测MSTN基因及相关基因表达感染48 h后，细胞弃培养液，每孔加入1 mL Trizol裂解细胞，按说明书进行总RNA抽提及逆转录，以GAPDH作为内参基因，利用SYBR Green法检测MSTN基因及生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG和Myf6，干扰素刺激基因OAS1和受体基因IFNGR1 mRNA的表达变化。定量PCR引物见表 2。
|
|
表 2 定量PCR引物参数 Table 2 Primer parameters for qRT-PCR |
PCR反应体系：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O补至20 μL。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s并收集荧光信号，共40个循环；熔解曲线分析：95 ℃ 15 s，60~95 ℃，0.3 ℃·s-1生成熔解曲线。以GAPDH为内参基因，2-ΔΔCt法进行相对定量计算，每个样品重复3次，取平均值。
1.7 Western blot检测MSTN及相关基因蛋白水平的表达感染72 h后，每孔加入100 μL RIPA Buffer裂解细胞，冰上孵育20 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min，取上清，用BCA法测定细胞蛋白质浓度。蛋白样品经12% SDS-PAGE分离后湿转硝酸纤维素膜(0.45 μm孔径)，3% BSA-TBST封闭，与一抗(稀释度1:1 000)4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次3 min，加入HRP酶标二抗(稀释度1:10 000) 室温孵育1 h，TBST洗膜3次，将ECL发光液滴加到膜上，反应3~5 min。在化学发光成像仪内进行检测。利用Image JTM图像分析软件对印迹蛋白进行灰度值统计分析，并用β-tubulin进行校准。
1.8 统计分析所有试验均重复进行3次，采用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以“平均值±标准差”表示，组间比较利用单因素方差分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 shRNA干扰质粒载体的构建与验证 2.1.1 shRNA干扰质粒载体的构建干扰质粒载体上只有1个PstⅠ酶切位点，PCR引物设计了1个PstⅠ酶切位点，而质粒能够被PstⅠ酶切出1条带约1 800 bp的条带，说明目的基因片段已经插入到载体。图 1证实本研究插入片段与载体相连，说明成功构建了质粒载体ShR218、ShR511、ShR3+4、ShRNC。
|
M.DL2000 marker; 1.ShR218; 2.ShR511; 3.ShR3+4; 4.ShRNC 图 1 重组质粒酶切鉴定图 Figure 1 The result of recombinant plasmid by digestion |
质粒转染成肌细胞48 h后，荧光显微镜下拍照，结果如图 2所示。转染效率经流式细胞仪测定为35.36%。荧光定量PCR检测结果显示，与空白对照组相比，ShR218对MSTN基因的干扰效率达到35%，ShR511干扰效率达到48%，双元干扰载体ShR3+4抑制效率最高达到85%，双元干扰效果更明显(图 3)。
|
A.荧光条件；B.明场条件 A. Fluorescence field; B. Bright field 图 2 质粒瞬时转染绵羊原代成肌细胞后荧光蛋白的表达(40×) Figure 2 The expression of fluorescent protein in sheep myoblasts after transfected with plasmids(40×) |
|
与对照组相比，**表示差异极显著(P＜0.01)。下同 Compared with the control group, ** indicate extremely significant difference (P < 0.01). The same as below 图 3 ShRNA质粒在绵羊成肌细胞中的干扰效果 Figure 3 Interfered effects in myoblasts by ShRNA plasmid |
用PacⅠ酶切重组腺病毒质粒，回收DNA大片段并转染HEK 293细胞。培养过程中可见明显的绿色荧光蛋白表达，收集病毒上清，经过滤、浓缩后，测定病毒滴度为1×109 pfu·mL-1。重组腺病毒感染绵羊成肌细胞24 h后，通过荧光显微镜可以观察到绿色荧光，感染48 h后荧光强度达到最高，经流式细胞仪测定感染效率可以达到90%以上(图 4)。
|
A.荧光条件；B.明场条件 A. Fluorescence field; B. Bright field 图 4 腺病毒载体感染绵羊原代成肌细胞后荧光蛋白的表达(40×) Figure 4 The expression of fluorescent protein in sheep myoblasts after transfected with adenovirus vector(40×) |
从定量结果柱形图(图 5)可以看出，MSTN基因的表达量与空白对照组(NT)相比，腺病毒载体Sh511干扰效率为53%(P＜0.01)，Sh3+4为76%(P＜0.01)，双元干扰效果更明显。空白组和阴性对照组间无显著差异。
|
图 5 重组腺病毒感染绵羊成肌细胞对MSTN基因相对表达量的影响 Figure 5 Expression of MSTN gene in myoblasts infected by recombinant adenovirus vector |
经Western blot检测，证实干扰组Sh511和Sh3+4的蛋白表达量相对于空白对照极显著降低(P < 0.01)，结果如图 6所示，干扰组Sh511和Sh3+4对蛋白的抑制率分别达到55%和64%。空白组和阴性对照组间无显著差异。
|
A.各组MSTN蛋白相对表达量；B. Western blot检测MSTN蛋白表达 A.The relative expressions of MSTN in different groups; B. Western blot analysis of MSTN protein expression 图 6 重组腺病毒感染绵羊成肌细胞对MSTN蛋白表达量的影响 Figure 6 Expression of MSTN protein in myoblasts infected by recombinant adenovirus vector |
MSTN基因被干扰后，4个生肌调节因子在干扰组中均呈下降趋势并且达到极显著水平(P < 0.01)。相对于空白对照组，在Sh511和Sh3+4干扰组中Myf5表达量分别降低了65%和79%，MyoD分别降低了79%和72%，MyoG分别降低了59%和70%，Myf6分别降低了60%和67%(图 7)。空白组和阴性对照组间无显著差异。
|
图 7 qRT-PCR检测MRFs基因的表达 Figure 7 qRT-PCR analysis of the expression of MRFs genes |
由图 8可见，Sh511、Sh3+4干扰MSTN后引起MyoG在蛋白表达水平上的极显著升高(P＜0.01)，分别增加了143%和153%，但未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白表达的显著性变化。空白组和阴性对照组间无显著差异。
|
A.各组MRFs蛋白相对表达量；B. Western blot检测MRFs蛋白表达 A.The relative expressions of MRFs protein in different groups; B. Western blot analysis of MRFs proteins expression 图 8 各组MRFs蛋白的表达 Figure 8 The expression of MRFs proteins in different groups |
腺病毒干扰载体感染成肌细胞引起的副作用，检测了干扰素刺激基因OAS1和受体基因IFNGR1的表达变化。发现未引起OAS1基因表达量的显著变化(图 9)，但引起IFNGR1基因表达量极显著升高(P＜0.01)，与空白对照相比阴性对照上调了1.2倍，Sh511上调了1.36倍，Sh3+4上调了0.56倍。
|
图 9 qRT-PCR检测干扰素相关基因的表达 Figure 9 qRT-PCR analysis of the expression of interferon related genes |
Western blot结果表明，腺病毒转染成肌细胞后未引起IFNGR1和OAS1在蛋白表达水平上的显著变化(图 10)。
|
A.各组OAS1和IFNGR1蛋白相对表达量；B. Western blot检测OAS1和IFNGR1蛋白表达 A.The relative expression of OAS1 and IFNGR1 proteins in different groups; B. Western blot analysis of IFNGR1 and OAS1 protein expressions 图 10 各组OAS1和IFNGR1蛋白的表达 Figure 10 The expression of OAS1 and IFNGR1 proteins in different groups |
RNAi是一种转录后水平的基因沉默，可以使特定基因低表达，通过载体表达shRNA可以长期抑制基因和蛋白表达。MSTN 基因负向调控肌肉的生长，因此可以利用RNAi抑制MSTN的功能，得到双肌表型的动物，增加肌肉产量。
本研究首先构建shRNA质粒干扰载体，通过常规转染试剂Lipofectamine TM 2000转染绵羊成肌细胞，发现转染效率特别低，不足2%，原代细胞本就转染率较低，成肌细胞可能更加难以转染。本研究发现，利用新型脂质体Lipofectamine 3000介导ShRNA质粒载体转染原代成肌细胞，转染效率能达到35%。Lipofectamine 3000是一种新型脂质体，其活性不受血清和双抗的影响并且对细胞毒性小。不过本研究中采用无血清无双抗培养基培养细胞，利用Opti-MEM培养基混匀脂质体和质粒得到的转染效率更高。为以后原代成肌细胞的质粒转染试剂的选择和方法提供了借鉴。
本研究发现，质粒介导的shRNA干扰效率不稳定，难以进行后续研究，但腺病毒作为基因载体有以下优势：可以感染分裂和非分裂的多种类型细胞，低致病性，低免疫原性，高转染效率以及高效表达外源基因。有报道表明，可以直接通过体内注射或血液注射质粒DNA，腺病毒相关载体(AAV)和腺病毒载体将外源基因导入到肌肉或心肌中[8, 20-21]。本研究首次利用腺病毒载体介导shRNA干扰体外成肌细胞MSTN基因表达，可为今后通过shRNA干扰绵羊MSTN基因提高其产肉量提供技术支持。
本研究发现，以质粒载体形式进行干扰试验，ShR218干扰效率达到35%左右，ShR511干扰效率达到48%，双元干扰载体ShR3+4对基因的抑制效率高达85%，但质粒干扰结果并不稳定，差异较大。将ShR511和ShR3+4重组包装为腺病毒后结果与质粒结果相似，腺病毒载体Sh511干扰效率达到53%，Sh3+4干扰效率达到76%，双元干扰载体效果更好，经Western blot检测结果类似，并且结果重复性高，稳定性强，可以进行后续研究。本研究构建验证了针对MSTN的双元干扰载体，为以后利用一个载体沉默2个不同的基因提供了方法参考。
本试验选定了4个与生肌相关的调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6，MSTN被干扰后影响了其mRNA的表达，Myf5下降的结果与J.Lu等[22-23]对绵羊和山羊成纤维细胞的研究结果一致，与A.K.Patel等[24]在山羊成肌细胞的研究结果类似，但与U.A.Patel等[25]在山羊成纤维细胞的研究结果不同。MyoD与MyoG降低的趋势与C.X.Liu等[13]对绵羊成肌细胞的研究结果一致，A.K.Patel等[24-25]在山羊成肌细胞及成纤维细胞的研究也得出类似的结果，而R.Kumar等[26]对山羊成肌细胞的研究结果为MyoG表达量是下降的，MyoD表达量是上升的。本研究中，Myf6基因的变化与U.A.Patel等[25]在山羊成纤维细胞的研究结果一致，与A.K.Patel等[24]在山羊成肌细胞的结果不同。出现结果不一致的原因可能是选择的羊品种不同以及细胞类型不同导致的。另外，本研究通过Western blot检测了MSTN基因被干扰后这4个生肌调节因子的表达变化，结果与qRT-PCR检测结果并不一致，并未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著性变化，而MyoG的蛋白水平极显著升高。出现差异的原因可能是真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔，而转录后又会有转录后加工，转录产物的降解、翻译、翻译后加工及修饰等多个环节，所以转录水平和翻译水平并不一定完全一致[27]。
shRNA介导的基因沉默的副作用之一是诱导干扰素反应，是宿主防御表达双链RNA的一种应答机制[28]。因此为了评价通过腺病毒介导shRNA干扰MSTN引起的干扰素反应，本研究检测了干扰素诱导基因OAS1和受体基因IFNGR1的表达情况。OAS是动物感染病毒后产生干扰素诱导生成的一种抗病毒蛋白，参与介导干扰素反应，在此过程中干扰素结合到受体发挥作用[29]。A.K.Tripathi等[30]研究发现，shRNA质粒载体瞬时转染鸡成纤维细胞抑制MSTN基因后引起OAS1和IFN-β基因表达量3.7~6.4倍的升高，N.K.Singh等[31]研究发现，干扰山羊成纤维细胞后引起OAS1基因1.64~6.83倍的升高，在A.K.Tripathi等[32]的研究中发现，利用shRNA质粒载体抑制山羊成肌细胞中的MSTN的表达，引起OAS1基因表达量5~11倍的升高。本研究发现，利用腺病毒干扰载体抑制绵羊成肌细胞中MSTN表达后，未引起OAS1基因mRNA表达的变化，但引起了IFNGR1基因mRNA表达的升高，暗示有干扰素反应发生，但不是由OAS1途径介导，具体介导途径需要进一步研究。同时研究发现，在蛋白水平上均未引起二者显著性变化，由此可见，此腺病毒载体介导shRNA引起细胞的干扰素反应较小。
4 结论本研究成功构建靶向MSTN的shRNA重组腺病毒载体，对成肌细胞的感染效率在90%以上，腺病毒介导的shRNA可以有效的降低成肌细胞内MSTN的表达。腺病毒介导shRNA干扰MSTN基因表达可下调4个生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6 mRNA水平的表达，上调MyoG蛋白的表达，但对Myf5、MyoD、Myf6蛋白表达水平影响不大；对OAS1基因mRNA表达水平无显著影响，但可引起IFNGR1基因mRNA表达水平的升高，对OAS1和IFNGR1基因蛋白表达水平均无显著影响。
| [1] | MCPHERRON A C, LAWLER A M, LEE S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-β superfamily member[J]. Nature, 1997, 387(6628): 83–90. DOI: 10.1038/387083a0 |
| [2] | ARTHUR P F. Double muscling in cattle: a review[J]. Aust J Agr Res, 1995, 46(8): 1493–1515. DOI: 10.1071/AR9951493 |
| [3] | WILLIAMS M S. Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child[J]. N Engl J Med, 2004, 351(10): 1030–1031. DOI: 10.1056/NEJM200409023511018 |
| [4] | CLOP A, MARCQ F, TAKEDA H, et al. A mutation creating a potential illegitimate microRNA target site in the myostatin gene affects muscularity in sheep[J]. Nat Genet, 2006, 38(7): 813–818. DOI: 10.1038/ng1810 |
| [5] | MOSHER D S, QUIGNON P, BUSTAMANTE C D, et al. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs[J]. PLoS Genet, 2007, 3(5): e79. DOI: 10.1371/journal.pgen.0030079 |
| [6] | WELLE S, BHATT K, PINKERT C A, et al. Muscle growth after postdevelopmental myostatin gene knockout[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 292(4): E985–E991. |
| [7] | UEDA R. RNAi: a new technology in the post-genomic sequencing era[J]. J Neurogenet, 2001, 15(3-4): 193–204. DOI: 10.3109/01677060109167376 |
| [8] | MAGEE T R, ARTAZA J N, FERRINI M G, et al. Myostatin short interfering hairpin RNA gene transfer increases skeletal muscle mass[J]. J Gene Med, 2006, 8(9): 1171–1181. DOI: 10.1002/(ISSN)1521-2254 |
| [9] | SATO F, KUROKAWA M, YAMAUCHI N, et al. Gene silencing of myostatin in differentiation of chicken embryonic myoblasts by small interfering RNA[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2006, 291(3): C538–C545. DOI: 10.1152/ajpcell.00543.2005 |
| [10] | JAIN H, SINGH S, KADAM M, et al. Knockdown of the myostatin gene by RNA interference in caprine fibroblast cells[J]. J Biotechnol, 2010, 145(2): 99–102. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2009.10.017 |
| [11] | TESSANNE K, GOLDING M C, LONG C R, et al. Production of transgenic calves expressing an shRNA targeting myostatin[J]. Mol Reprod Dev, 2012, 79(3): 176–185. DOI: 10.1002/mrd.v79.3 |
| [12] |
盛鹏程, 朱瑞良, 苗向阳. 绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定[J]. 中国兽医学报, 2012, 32(4): 628–632.
SHENG P C, ZHU R L, MIAO X Y. Construction and identification of lentivial RNA interference vector of sheep myostatin receptor gene[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2012, 32(4): 628–632. (in Chinese) |
| [13] | LIU C X, LI W R, ZHANG X M, et al. Knockdown of endogenous myostatin promotes sheep myoblast proliferation[J]. In vitro Cell Dev Biol Anim, 2014, 50(2): 94–102. DOI: 10.1007/s11626-013-9689-y |
| [14] | WALTHER W, STEIN U. Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases[J]. Drugs, 2000, 60(2): 249–271. DOI: 10.2165/00003495-200060020-00002 |
| [15] | THOMAS C E, EHRHARDT A, KAY M A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy[J]. Nat Rev Genet, 2003, 4(5): 346–358. DOI: 10.1038/nrg1066 |
| [16] |
王红娜, 张英杰, 刘月琴. 绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究[J]. 河北农业大学学报, 2016, 39(1): 94–98, 102.
WANG H N, ZHANG Y J, LIU Y Q. A study of purification, culture, identification and differentiation of sheep myoblast cells[J]. Journal of Agricultural University of Hebei, 2016, 39(1): 94–98, 102. (in Chinese) |
| [17] | LIU C X, LI W R, ZHANG X M, et al. The critical role of myostatin in differentiation of sheep myoblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 422(3): 381–386. DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.04.151 |
| [18] |
孔庆辉, 晁燕, 夏明哲, 等. 黄河裸裂尻鱼MSTN基因RNA干扰研究[J]. 中国实验动物学报, 2016, 24(4): 344–350.
KONG Q H, CHAO Y, XIA M Z, et al. Inhibitory effect of RNA interference of MSTN gene expression on the downstream genes in Schizopygopsis pylzovi[J]. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica, 2016, 24(4): 344–350. (in Chinese) |
| [19] |
刘建军, 张茂雷, 朱芳芳. 实时荧光定量PCR筛选有效RNA干扰方法的建立[J]. 检验医学与临床, 2010, 7(10): 903–905.
LIU J J, ZHANG M L, ZHU F F. Establishment of a method in detecting the effect of RAN interference on time flurogenic quantitative polymerase chain reaction[J]. Laboratory Medicine and Clinic, 2010, 7(10): 903–905. DOI: 10.3969/j.issn.1672-9455.2010.10.004 (in Chinese) |
| [20] | LOUBOUTIN J P, WANG L L, WILSON J M. Gene transfer into skeletal muscle using novel AAV serotypes[J]. J Gene Med, 2005, 7(4): 442–451. DOI: 10.1002/(ISSN)1521-2254 |
| [21] | MERENTIE M, LOTTONEN-RAIKASLEHTO L, PARVIAINEN V, et al. Efficacy and safety of myocardial gene transfer of adenovirus, adeno-associated virus and lentivirus vectors in the mouse heart[J]. Gene Ther, 2016, 23(3): 296–305. DOI: 10.1038/gt.2015.114 |
| [22] | LU J, REN H X, SHENG X H, et al. Transcript characteristic of myostatin in sheep fibroblasts[J]. J Cell Biochem, 2012, 113(8): 2652–2660. DOI: 10.1002/jcb.v113.8 |
| [23] | LU J, WEI C H, ZHANG X N, et al. The effect of myostatin silencing by lentiviral-mediated RNA interference on goat fetal fibroblasts[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(6): 4101–4108. DOI: 10.1007/s11033-013-2494-6 |
| [24] | PATEL A K, TRIPATHI A K, PATEL U A, et al. Myostatin knockdown and its effect on myogenic gene expression program in stably transfected goat myoblasts[J]. In vitro Cell Dev Biol Anim, 2014, 50(7): 587–596. DOI: 10.1007/s11626-014-9743-4 |
| [25] | PATEL U A, PATEL A K, JOSHI C G. Stable suppression of myostatin gene expression in goat fetal fibroblast cells by lentiviral vector-mediated RNAi[J]. Biotechnol Prog, 2015, 31(2): 452–459. DOI: 10.1002/btpr.v31.2 |
| [26] | KUMAR R, SINGH S P, KUMARI P, et al. Small interfering RNA (siRNA)-mediated knockdown of myostatin Influences the expression of myogenic regulatory factors in caprine foetal myoblasts[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 172(3): 1714–1724. DOI: 10.1007/s12010-013-0582-7 |
| [27] |
孙洪新, 王红娜, 张英杰, 等. BMPR-IB基因的克隆及其在绒山羊成纤维细胞中的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(6): 1124–1132.
SUN H X, WANG H N, ZHANG Y J, et al. Cloning and expression of BMPR-IB gene in cashmere goat fibroblast cells[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(6): 1124–1132. (in Chinese) |
| [28] | GANTIER M P, WILLIAMS B R G. The response of mammalian cells to double-stranded RNA[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2007, 18(5-6): 363–371. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2007.06.016 |
| [29] |
张义兵, 桂建芳. 鱼类干扰素反应及分子调控[J]. 生物工程学报, 2011, 27(5): 675–683.
ZHANG Y B, GUI J F. Fish interferon response and its molecular regulation: a review[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2011, 27(5): 675–683. (in Chinese) |
| [30] | TRIPATHI A K, APARNATHI M K, VYAVAHARE S S, et al. Myostatin gene silencing by RNA interference in chicken embryo fibroblast cells[J]. J Biotechnol, 2012, 160(3-4): 140–145. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2012.03.001 |
| [31] | SINGH N K, SINGH S, JAIN S K, et al. Evaluation of interferon response induced by anti-myostatin shRNA constructs in goat (Capra hircus) fetal fibroblasts by quantitative real time-polymerase chain reaction[J]. Anim Biotechnol, 2012, 23(3): 174–183. DOI: 10.1080/10495398.2012.664598 |
| [32] | TRIPATHI A K, RAMANI U V, PATEL A K, et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(2): 688–694. DOI: 10.1007/s12010-012-0021-1 |