TNFRSF1A基因是肿瘤坏死因子受体家族中的一员，是肿瘤坏死因子-a(TNFα)的受体，该基因可以激活NF-kappaB，介导细胞凋亡[1]。TNFRSF1A基因中的一些突变与周期性发热综合征[2]、autoinflammatory综合症[1]和多发性硬化[3-4]有关。TNFRSF1A基因也与猪的免疫反应紧密相关，C.K.Tuggle等[5]利用鼠伤寒沙门菌或猪霍乱沙门菌对猪群进行刺激，免疫前后的肠系膜淋巴液中TNFRSF1A基因等22个靶向NF-kappaB基因表达上调。本课题组前期对聚肌胞(Poly Ⅰ:C)免疫刺激前后仔猪T淋巴细胞亚群指标进行全基因组关联分析，在5号染色体上发现一个1.05 Mb的影响免疫调节的重要区域，该区域包含的TNFRSF1A基因被认为是影响仔猪免疫的候选基因[6]。
DNA甲基化是一种DNA的天然修饰方式，是表观遗传学领域研究的重点之一。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达[7-8]。DNA甲基化作为当今表观遗传学的研究热点，可以为免疫调控相关研究提供新思路。研究发现，免疫相关基因甲基化水平与机体免疫水平高低存在相关性[9]。例如，H3K9二甲基化作用可抑制IFN及干扰素刺激基因的表达，从而减弱Ⅰ型干扰素抗病毒反应[10]；活化的CD8记忆T细胞中，IFNG和IL12基因启动子发生快速去甲基化并伴随其蛋白表达水平升高[11]；儿童血液DNA中PRF1基因的甲基化状态与婴儿时期呼吸道合胞体病毒引起的急性下呼吸道感染存在相关性[12]。目前，对于TNFRSF1A基因的研究多集中在核苷酸多态性的发掘及其表达差异分析方面[13-14]，而对其甲基化水平、甲基化与免疫细胞的关系等方面研究较少。
大蒲莲猪是中国著名的华北型地方猪种，具有抗病耐粗饲、高繁殖、肉质好等优良特性，尤其在抗病性和免疫力方面明显优于长白猪等国外猪种[15]，然而目前对其抗病力差异的遗传与免疫机理研究较少。大蒲莲猪和商业猪种长白猪群体间在血常规、T淋巴细胞亚群性状及许多细胞因子的表达水平等方面都存在显著差异[16-17]，笔者推测，在大蒲莲猪和长白猪群体间TNFRSF1A基因甲基化水平可能存在差异，这种差异可能通过影响基因表达，进而影响反映机体细胞免疫功能的T淋巴细胞亚群等指标。
本研究以华北黑猪大蒲莲猪和抗病力相对较弱的长白仔猪的血液样品为研究对象，以探求2个群体间仔猪免疫候选基因TNFRSF1A CpG岛甲基化水平差异，及其与基因表达和T淋巴细胞亚群性状的相关性。本研究为了解大蒲莲地方猪较商业猪种高抗病力机制提供新的思路，并为地方猪的种质特性和猪抗病品种的选育奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物本研究以175头长白仔猪和105头大蒲莲仔猪为试验动物，这些仔猪分别来自于济宁市原种猪场和济宁东三大蒲莲原种场的26头长白母猪所生的28窝仔猪及11头大蒲莲母猪所生的13窝仔猪。仔猪达35日龄时，从每窝中随机选取6~9头健康仔猪，公母约各半，将前腔静脉获得的血液样本加入EDTAK2抗凝管中，混匀后提取血液DNA和RNA，并将其中的171头长白仔猪和104头大蒲莲仔猪样本进行T淋巴细胞亚群指标检测。
1.2 方法 1.2.1 TNFRSF1A基因上游CpG岛甲基化分析 1.2.1.1TNFRSF1A基因上游CpG岛的搜寻：在NCBI数据库中对TNFRSF1A基因进行搜寻，选取基因起始位置上游1 000 bp的序列、第一外显子(共40 bp)及1 960 bp第一内含子(共7 936 bp)进行CpG岛搜寻，所用软件为The Li Lab MethPrimer(http://www.urogene.org/methprimer/)，参数设置为Island size>100 bp，GC percent>50.0%，Obs/Exp>0.6。
1.2.1.2DNA的提取及重亚硫酸盐处理：将抗凝外周血液通过酚氯仿法提取血液样品DNA，利用Nanodrop 2000微量分光光度计测定DNA浓度与质量。从中选取DNA质量较好的45头大蒲莲猪和48头长白猪血液样本DNA 1 μg，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH)试剂盒的使用说明，将基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，其中未甲基化的胞嘧啶核苷酸(C)转化成尿嘧啶核苷酸(U)。转化后DNA用Nanodrop 2000微量分光光度计检测其260 nm吸收光下的DNA浓度与质量。
1.2.1.3BSP引物设计及CpG岛PCR扩增：BSP引物设计采用常规引物设计方法，先将TNFRSF1A基因2个CpG岛及上下游500 bp的DNA序列中的C替代为T核苷酸(胸腺嘧啶)，而后将序列输入Primer Premier 5.0软件，设计跨2个CpG岛的引物，引物序列见表 1。利用TaKaRa EpiTaq HS(TaKaRa)对亚硫酸氢盐修饰后模板DNA进行扩增。反应体系为50 μL：1×EpiTaq PCR Buffer (Mg2+ free)，2.5 mmol·L-1 MgCl2，0.3 mmol·L-1 dNTP，0.4 μmol·L-1前后引物，TaKaRa EpiTaq HS 1.25 U，亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA 100 ng。反应条件：98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环40次。
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表 1 CpG岛扩增及表达引物 Table 1 Primers used for CpG island amplification and expression detection |
CpG岛目的条带的克隆测序：将扩增的CpG岛PCR产物连接于Peasy-T5 Zero Cloning Kit(全式金)以进行阳性克隆筛选。连接体系为Peasy-T5 Zero Cloning Vector 1 μL，PCR产物1 μL，水3 μL；反应条件为25 ℃ 5 min。将连接后的PCR产物于50 μL Trans1-T1感受态细胞(全式金)中冰浴20 min，而后42 ℃热击30 s，冰上放置2 min，加入250 μL LB液体培养基，150 r·min-1、37 ℃培养1 h，最后取200 μL菌液涂板培养过夜。因该载体可通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子，故涂板后长出的菌落即为阳性菌落。挑取阳性菌落10 ~ 15个于700 μL LB液体培养基中，180 r·min-1、37 ℃培养4 h。将菌液送往山东省农业科学院生物技术研究中心进行测序反应。测序结果通过SeqMan软件进行序列比对和甲基化位点搜寻。
1.2.2 猪种间TNFRSF1A基因表达差异性分析根据ENSMBL数据库中搜寻的TNFRSF1A序列，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，保证上下游引物跨至少1个内含子，且引物间不能形成引物二聚体。内参基因的引物序列参考文献报道，选取外周血样品中稳定性最好的内参基因B2M作为内参基因[17]。扩增TNFRSF1A及内参基因的引物序列如表 1所示。
利用RNAiso Plus(TaKaRa)试剂进行血液总RNA的提取。提取的RNA通过Nanodrop 2000微量分光光度计进行浓度与纯度的检测，以0.8%琼脂糖电泳测定RNA的完整性。利用PrimerScript RT reagent with gDNA Eraser(TaKaRa)将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板通过LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒于Roche lightcycler 480荧光定量PCR仪中进行表达分析。每个样品分别扩增目的基因TNFRSF1A和内参基因B2M，每个基因重复3次。荧光定量PCR反应采用20 μL体系：1×SYBR Green I Master，0.5 μmol·L-1正、反向引物(表 1)，cDNA 1 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循环40次；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min。
TNFRSF1A基因的相对表达结果用ΔCt=Ct(TNFRSF1A) -Ct(B2M)表示，通过R语言绘制箱线图，并对品种和母猪窝效应进行方差分析。
1.2.3 T淋巴细胞亚群性状检测血液采集后注入EDTAK2抗凝管中，颠倒混合均匀，送往济南艾迪康医院进行T淋巴细胞亚群的检测，仪器为流式细胞仪(FACSCalibur，美国Becton Dickinson)。根据T淋巴细胞检测流程，血液样品经FITC、RPE和SPRD三色荧光标记后，可以把T淋巴细胞分为CD4-CD8-CD3-、CD4+CD8-CD3-、CD4-CD8+CD3-、CD4+CD8+CD3-、CD4-CD8-CD3+、CD4+CD8-CD3+、CD4-CD8+CD3+、CD4+CD8+CD3+。在此基础上，将CD4-CD8-CD3+、CD4+CD8-CD3+、CD4-CD8+CD3+、CD4+CD8+CD3+之和记为CD3+，将CD4+CD8-CD3+/CD4-CD8+CD3+记为CD4+/CD8+。
1.2.4 相关性分析每个甲基化位点的甲基化频率(%)=该位点发生甲基化的单克隆数/挑取的总克隆数×100%。在大蒲莲仔猪和长白仔猪群体及合并后的群体中，通过R语言Hmisc软件包计算甲基化位点甲基化频率与基因表达ΔCt值及T淋巴细胞亚群性状的相关性。
2 结果 2.1 TNFRSF1A基因甲基化分析 2.1.1 TNFRSF1A基因CpG岛搜寻通过The Li Lab MethPrimer软件分析，在基因起始位置附近区域内共预测到2处CpG岛。以基因起始位置为+1，Island 1位于－133~－29 bp位置，大小为105 bp；Island 2位于+108~+229 bp的内含子1中，大小为122 bp(图 1)。
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红色箭头代表TNFRSF1A基因起始位置；FP/RP为TNFRSF1A基因BSP引物TNFRSF1A-BSP-FP/RP位置 Red arrow represents start site of TNFRSF1A gene; FP and RP represent the position of TNFRSF1A-BSP-FP/RP primers used for BSP 图 1 TNFRSF1A基因起始位置附近CpG岛预测 Figure 1 CpG islands prediction around the transcription start site of TNFRSF1A gene |
在2个CpG岛及其中间序列共存在25个CpG位点，其中Island 1中有9个CpG位点；Island 2中有9个CpG位点；其余位于Island 1和Island 2间。除位于Island 1和Island 2间的CpG_10和Island 2中的CpG_23位点在2个群体中没有发生甲基化外(图 2中“×”表示)，其他所有CpG位点的甲基化频率均较低(8%~31%)。由BIG Analyzer软件显示的2个群体中随机的4个个体的甲基化状态(图 2)也可以看出，TNFRSF1A基因甲基化频率处于较低水平。
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A. 4头大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因CpG岛甲基化状态；B. 4头长白仔猪TNFRSF1A基因CpG岛甲基化状态。黑色圆圈代表甲基化的CpG位点；白色圆圈代表未甲基化的CpG位点；×表示在2个群体中均未发生甲基化的位点。每行代表一个单克隆。DP代表大蒲莲猪；L代表长白猪，下同 A. CpG islands methylation status of TNFRSF1A gene in 4 Dapulian piglets; B. CpG islands methylation status of TNFRSF1A gene in 4 Landrace piglets. Black circles correspond to the methylated CpGs; White circles correspond to unmethylated CpGs; ×show the sites unmethylated in the 2 populations. Each line represents an independent clone. DP represents Dapulian; L represents Landrace, the same as below 图 2 大蒲莲和长白仔猪部分个体TNFRSF1A基因CpG岛甲基化状态 Figure 2 CpG island methylation status of TNFRSF1A gene in parts of individuals of Dapulian and Landrace piglets |
在每个群体内，某个CpG位点的群体甲基化频率用该位点的甲基化频率的平均数表示，绘制的TNFRSF1A基因的群体甲基化情况柱形图如图 3所示。在Island 1中，大蒲莲仔猪群体CG二碱基中C平均甲基化程度为1.11%，长白仔猪平均甲基化程度为1.23%，差异不显著(P>0.05)。在Island 2中，大蒲莲仔猪CG二碱基中C平均甲基化程度为1.68%，长白仔猪平均甲基化程度为0.56%，差异显著(P < 0.05)。同时，在Island 2存在的CpG位点中除+221位点外，其他甲基化位点大蒲莲仔猪的甲基化水平均高于长白仔猪(图 3)。
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纵坐标为群体内不同CpG甲基化胞嘧啶百分数的平均数 Y coordinate is the average percentage of methylated cytosines (mean±S.E.) for the different CpG dinucleotides in each population 图 3 大蒲莲和长白仔猪群体TNFRSF1A基因CpG岛甲基化频率 Figure 3 CpG island methylation frequencies of TNFRSF1A gene in Dapulian and Landrace populations |
大蒲莲仔猪和长白仔猪TNFRSF1A基因的相对表达量结果箱线图(图 4)显示，在175头长白猪中，50%个体TNFRSF1A基因表达ΔCt值位于5.64~6.22之间，最大值7.80与最小值4.54为离群值；在105头大蒲莲猪中，50%个体TNFRSF1A基因表达ΔCt值位于5.73~6.27之间，最大值7.39与最小值4.55、4.85为离群值。大蒲莲猪TNFRSF1A基因平均ΔCt值(6.01±0.36) 显著高于长白猪(5.92±0.46)，变异系数也高于长白猪(7.75 vs 5.92)，品种间差异显著(P < 0.05)，窝效应差异不显著(P>0.05)。说明大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因的表达量显著低于长白仔猪(P < 0.05)。在甲基化研究中，大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因Island 2的甲基化水平显著高于长白仔猪(P < 0.05)，Island 2可能是影响TNFRSF1A基因表达的关键CpG岛。
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图 4 大蒲莲与长白仔猪TNFRSF1A基因相对表达箱线图 Figure 4 Box-plot of TNFRSF1A gene relative expression levels in Dapulian and Landrace piglets |
将大蒲莲猪和长白仔猪2个CpG岛的各甲基化位点的甲基化频率与基因表达ΔCt值进行相关性分析。在两群体合并分析时，Island 1中只有－51位点甲基化频率与ΔCt值成正相关，其他均为负相关，Island 1中甲基化位点的平均甲基化频率与ΔCt值成负相关，相关性均未达到显著水平(P>0.05)，证明了Island 1的甲基化并未抑制基因表达；在Island 2中+126、+128、+159、+162和+164位点甲基化频率均与ΔCt值成正相关，且所有位点的平均甲基化频率与ΔCt值成正相关，但相关性也未达到显著水平(P>0.05)。大蒲莲与长白仔猪群单独分析时，甲基化频率与基因表达ΔCt值的相关性趋势与2个群体间的趋势基本相同。在群体内及群体间，Island 2中甲基化频率均与ΔCt值成正相关，即甲基化频率与基因表达量成负相关，证明了大蒲莲仔猪较长白仔猪Island 2的高甲基化导致大蒲莲猪TNFRSF1A基因低表达，其中+126、+128、+159、+162和+164是重要的甲基化位点。
2.3 TNFRSF1A基因甲基化与T淋巴细胞亚群的关系将大蒲莲和长白仔猪2个CpG岛甲基化位点的甲基化频率与T淋巴细胞亚群指标进行相关性分析。2个群体合并分析时，Island 1中只有-60位点与CD3+性状显著负相关(P < 0.05)；Island 2中+159和+164位点都与CD4+CD8+CD3+性状显著正相关(P < 0.05)(表 2)。因此，Island 2中，+159和+164位点可能是导致TNFRSF1A基因表达差异的重要甲基化位点，并且这2个位点又与T淋巴细胞亚群指标显著相关，笔者推测大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因+159和+164位点的甲基化水平增加，可能导致TNFRSF1A基因表达量下降，影响T淋巴细胞亚群性状，从而影响机体的免疫水平。
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表 2 大蒲莲和大白猪仔猪群体TNFRSF1A基因甲基化频率与T淋巴细胞亚群性状显著相关性的甲基化位点 Table 2 Methylation sites significantly correlated with T-lymphocyte subpopulation traits in Dapulian and Landrace piglets |
分别对大蒲莲猪和长白仔猪各甲基化位点的甲基化频率与T淋巴细胞亚群性状进行相关性分析时，在大蒲莲仔猪群体内，只有位于Island 1内的-51位点与CD4+CD8+CD3-极显著正相关(P < 0.01)(表 2)，在长白仔猪群体内，只有Island 2中的+162位点与CD4-CD8-CD3-显著正相关(P < 0.05)(表 2)。这2个位点可以作为2个群体内部高抗病育种的甲基化分子标记。
3 讨论DNA甲基化是一种可稳定遗传的表观遗传学修饰，DNA的甲基化主要发生在CpG岛上，它通过影响染色质结构[7-18]、DNA构象[19-20]、转录因子与DNA的结合[8-21]等调控基因的表达。90%的DNA甲基化发生在CpG序列，未甲基化的CpG二核苷酸以较高的密度分布，构成了CpG岛[22]。CpG甲基化导致的基因沉默或低表达是最重要和广泛的表观遗传调控机制[23]。CpG岛多位于基因的启动子区和第一外显子区，在基因的第一内含子中也可见影响基因表达的CpG岛[24-25]。本研究在搜寻TNFRSF1A基因的CpG岛时，选取了基因5′端上游序列、第一外显子和部分第一内含子区域，在基因5′端上游序列和第一内含子区域中各发现1个CpG岛，且这2个CpG岛中所有甲基化位点都处于低甲基化水平(图 2、3)，后续相关性研究推测Island 2中甲基化位点的甲基化水平影响该基因的表达，和前人研究发现的第一内含子中的低甲基化水平CpG岛可影响基因表达的结果相符。
TNFRSF1A基因是重要的免疫相关基因，其甲基化状态可以影响基因的表达。在低级别星形细胞瘤中，J.N.Jeyapalan等[26]研究发现，TNFRSF1A基因甲基化模式发生改变，导致该基因表达下调，增加了肿瘤细胞的化学抗性。然而，并未见猪种中TNFRSF1A基因CpG岛甲基化与表达关系的研究。本试验选用在抗病力上存在差异的2个仔猪群体开展TNFRSF1A基因CpG岛甲基化研究，并探讨甲基化水平与表达的关系。在2个群体间，TNFRSF1A基因的mRNA表达水平差异显著(P < 0.05，图 4)，而在该基因的启动子区域未发现在群体间存在基因型分离的突变(结果未展示)，所以该基因在2个群体中甲基化水平的差异是导致mRNA水平表达差异的原因。但可能由于猪血液中TNFRSF1A基因甲基化水平较低，2个群体中Island 2甲基化频率和表达水平虽均达到显著差异水平，但甲基化水平与表达量未达到显著负相关。
T细胞是重要的淋巴细胞，T淋巴细胞亚群指标可反映机体正常的免疫水平，可辅助监测、指导临床疾病，对疾病的诊断、发病机理的研究、病程监测等都有重要作用[27]。中国地方猪种在抗病性方面较商业猪种存在优势，在T淋巴细胞亚群指标上表现出差异。大蒲莲和长白仔猪的T淋巴细胞亚群性状中，除CD4+CD8-CD3-、CD4+CD8+CD3-和CD3+外，本研究涉及的其他7个性状的差异均达到显著(P < 0.05) 或极显著水平(P < 0.01)[16]。在猪上对TNFRSF1A基因的研究较少，现有的研究发现该基因与猪的免疫相关，且该基因是影响仔猪免疫的候选基因[5-6]。本研究将免疫候选基因TNFRSF1A的甲基化位点与T淋巴细胞亚群性状进行相关性分析，位于Island 2中的+159和+164甲基化位点均与CD4+CD8+CD3+性状显著正相关(P < 0.05，表 2)。且前期研究发现，CD4+CD8+CD3+性状上大蒲莲猪极显著高于长白仔猪[16]。CD4+CD8+CD3+型T淋巴细胞为双阳性细胞，是成熟的记忆细胞，具有典型CD4+和CD8+T细胞的功能[28]，尤其对于病毒具有病毒特异性Th记忆细胞功能。动物试验表明，CD4+CD8+CD3+型双阳性细胞能够产生疫苗诱导的记忆免疫应答[29-30]。可以推测，Island 2中的+159和+164位点的甲基化频率影响CD4+CD8+CD3+型双阳性细胞数目，从而影响机体免疫水平。
甲基化可能影响转录因子与DNA的结合，通过ALGGEN PROMO在线软件[31-32]对Island 2中+159~+164甲基化位点附近的序列进行转录因子预测，此处可能结合的转录因子有E2F-1、Sp1、NF-E4。+159和+164位点的甲基化可能影响转录因子的结合，使得大蒲莲仔猪TNFRSF1A基因表达下调，较长白仔猪外周血液中含有更高数目的双阳性T细胞，从而影响机体的免疫水平。本研究后续将通过免疫共沉淀等方法进一步筛选转录因子，并印证转录因子与+159~+164位点的结合情况，从而解析TNFRSF1A基因对大蒲莲猪高抗病力的分子机制。
4 结论本研究对大蒲莲和长白仔猪血液样品中的TNFRSF1A基因进行CpG岛甲基化分析，并对CpG位点的甲基化频率与TNFRSF1A基因表达和T淋巴细胞亚群性状开展相关性分析，结果发现，位于TNFRSF1A基因CpG Island 2中的+159和+164位点是重要的甲基化位点，该位点的甲基化可能影响基因表达和T淋巴细胞亚群性状，从而使大蒲莲猪表现出高抗病性。本研究为解析大蒲莲猪高抗病力提供科学依据，为抗病品种的选育奠定基础。
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