2017, Vol. 47
胶原作为人体中含量最丰富的蛋白, 以其低免疫原性和相容性等特点被人们所青睐。传统的胶原获得方式是从动物骨头及牛皮中提取, 这种方式存在一定的安全风险[1]。高效、低成本的重组表达胶原蛋白的方式成为一种趋势。为了提高重组表达胶原的热稳定性, 需要对其进行修饰, 其中包括将脯氨酸(Pro)羟基化为羟脯氨酸(Hyp)[2]。在一些真核表达体系如毕赤酵母中, 尽管具有翻译后修饰的功能, 但因缺少羟脯氨酸酶(P4H)而无法实现胶原的羟基化。很多研究证实可以通过胶原与P4H共表达的方式获得羟基化的胶原[3]。在人类和其他脊椎动物中, 羟脯氨酸酶P4H是一个α2β2异源四聚体[4]。在这个多聚酶复合物中, 59 kDa的α亚基是催化亚基, 拥有催化的活性位点和底物结合位点[5-6]; 55 kDa的β亚基又称为二硫键异构酶PDI, 作为P4H的一个亚基, 它的功能是维持α亚基以一个有催化活性的, 非聚集的结构的状态存在[7]。P4H的活性发挥依赖于一些辅因子如α-酮戊二酸、O2、二价铁离子等。在反应过程中, α-酮戊二酸被氧化发生脱羧反应生成CO2和琥珀酸[8]。
动物的P4H由于复杂的结构和低活性限制了其应用[9], 植物和病毒的P4H大多为单体多肽, 而且能催化富含脯氨酸的多肽链。然而, 植物的P4H主要以多聚的L-脯氨酸或者类似的序列为底物, 而非类似人胶原中的Gly-X-Y重复单元[10]。有研究报道, 微生物的P4H具有羟基化胶原的能力。Pozzolini M等成功利用海绵的P4H催化前胶原的羟基化, 羟脯胺酸含量达到36.3% [11]; Eriksson M等研究发现来源于藻类病毒PBCV-1的P4H被证实其与动物P4H的α亚基存在序列相似性, 能催化多种底物[12]。
因此, 本研究选用微生物的P4H催化前胶原的羟基化。Rutschmann C研究报道了在大肠杆菌中将拟病毒的P4H(L593)与38 kDa的胶原链共表达, 获得羟基化的胶原蛋白, 其羟基化率较高[9]。本研究将人Ⅲ型胶原全长α链(COL3A1)与L593在毕赤酵母中共表达, 探索毕赤酵母中病毒P4H(L593)催化人Ⅲ型胶原全长α链的可行性, 并对共表达的蛋白进行鉴定以及确定脯氨酸羟基化的位点。期待寻找到更简便、更有利于放大生产的胶原羟基化途径。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种及细胞株感受态大肠杆菌DH5α购于天根公司; pPIC9K, pPICZB质粒及GS115购于Invitrogen公司; pUC19-L593质粒由上海生工提供; pBV220-COL3A1质粒本实验室已成功构建。
1.1.2 主要试剂胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于Solarbio公司; 限制性内切酶EcoR I, Not I, Kpn I, Sal I, Sac I购于New England Biolabs公司; T4 DNA连接酶和其他DNA操作酶购于TaKaRa公司; RNA提取试剂盒、与实时定量PCR相关的试剂盒购于TaKaRa公司; 与Western Blots分析相关的试剂均购于天根公司。
1.2 方法 1.2.1 重组质粒的构建为了构建pPIC9K-COL3A1和pPICZB-L593重组质粒, 不含N端和C端多肽的人Ⅲ胶原全长α链(Gene Bank:BC028178.1)与18-743拟病毒的P4H L593(NCBI Reference Sequence:NC_014649.1)通过PCR扩增。用于扩增COL3A1的引物为5′-CGCGAGAATTCAAGCTCAGTATG-3′(上游引物)和5′-TTAAGCGGCCGCATTTCGTGGT-3′(下游引物)。PCR得到的产物与pPIC9K质粒均用EcoR I-Not I双酶切再连接得到重组质粒pPIC9K-COL3A1。用于扩增L593的引物为5′-CCCGGTACCATGAAAACTGTGACT-3′(上游引物)和5′-CAAGCGGCCGCGGAAAATTTTCGTT-3′(下游引物)。类似地, PCR产物与pPICZB均用Kpn I和Not I双酶切再连接得到质粒pPICZB-L593。将这两种质粒均转入E.coli DH5α中进行扩增。重组质粒构建如图 1所示。
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图 1 重组质粒构建图 Fig. 1 The schematic map of recombinant vectors |
第一步电转:利用电转仪ECM 630(BTX, USA)将10 μL Sal I线性化的重组质粒pPIC9K-COL3A1转入100 μL感受态酵母细胞GS115中, 电转条件为1.5 kV, 50 μF, 200 Ω。电转结束后立即加入1 mL冰浴的1.0 mol/L山梨醇, 在30℃条件下孵育1 h; 然后移取50 μL上清液涂于MD平板(1.34%(质量分数)YNB, 2%(质量分数)葡萄糖, 4×10-5%(质量分数)生物素), 将MD平板上的克隆子分别复制到含有1.0, 2.0和4.0 mg/mL G418的YPD平板上, 29℃条件下培养3天后筛选高拷贝数的阳性转化株。第二步电转:筛选的高拷贝菌株为感受态细胞, Sac I线性化的质粒pPICZB-L593按照之前的方式进行电转, 分别在0.5, 1, 2 mg/mL博莱霉素的YPDs平板上筛选不同拷贝数的阳性菌株。
1.2.3 蛋白的表达与实时定量PCR分析挑取编号为1#, 2#, 3#, 4# (1#不含有pPICZB-L593质粒)的单克隆菌株于5 mL YPD培养基中, 220r/min, 30℃培养12 h; 取1 mL培养液离心, 去除上清, 将菌体转移至25 mL BMGY培养基中, 30℃, 220r/min培养至细胞OD600达到2~8时, 收集菌体, 将菌体重悬稀释至OD600为1.0并转移至BMMY培养基中诱导蛋白表达; 每隔24 h取样并向BMMY培养液中加入0.1%(体积分数)甲醇及0.5 mmol的L-抗坏血酸, 1 mmol的FeSO4·7H2O。
为了实时检测基因在mRNA水平的表达, 利用TRNzol试剂盒从各个菌株中提取RNA, 并用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit将其逆转录为cDNA。qPCR反应在CFX96实时定量PCR检测系统中的96孔板中(Bio-Rad)进行, 每个孔中加入7.5 μL Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, 0.5 μL引物, 1.2 μL cDNA(稀释过的)和5.8 μL去离子水。热循环过程为:95℃ 10 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 循环40圈后95℃ 10 s, 65℃ 30 s结束。溶解曲线分析按照CFX96系统生成的程序进行, 获得CT值后用2-ΔΔCT法(参照文献[13])计算基因的相对表达水平, 在酵母中稳定表达的His3基因作为计算时的内参比基因。
1.2.4 SDS-PAGE与Western-Blot分析以分离胶浓度为12%(体积分数)的SDS-PAGE检测样品, SDS-PAGE胶上的蛋白分子量大小通过对比Marker(PageRulerTM Unstained Protein Ladder, Thermo Scientific)确定。蛋白纯度由Quantity One software分析。将SDS-PAGE胶转到PVDF膜上, 封闭过夜后加入His抗体, 37℃孵育5 h; 用PBST洗膜后加入辣根过氧化酶标记的二抗, 37℃孵育2 h, 洗膜后进行显色反应(注意避光)。
1.2.5 氨基酸组成分析按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》方法测定, 所用仪器为日本日立公司生产的L-8900型氨基酸自动分析仪。样品处理过程:称取样品200 mg于消化管中, 加入10 mL 6 mol/L盐酸(优级纯), 超声2 min, 氮气吹扫2 min, 封口, 称取消化管重量m1; 将消化管置于110℃烘箱22 h, 冷却后取出, 称重得m2, 若m2小于m1, 则用6 mol/L盐酸补差重。混匀后, 用0.45 μm无机滤膜过滤, 取滤液200 μL于小试管中, 氮气60℃吹干, 加入5 mL 0.02 mol/L盐酸复溶, 溶液再用0.45 μm无机滤膜过滤即可。
1.2.6 LC-MS/MS质谱检测将SDS-PAGE胶上110 kDa的蛋白条带切下并送至北京华大蛋白质研发中心进行LC-MS/MS质谱检测。
2 结果与分析 2.1 重组质粒的构建与转化图 2A和图 2B分别对应重组质粒pPICZB-L593与pPIC9K-COL3A1的质粒大提后的琼脂糖凝胶电泳图。pPICZB-L593的理论大小约为4.0 kb, 图中的电泳条带与DNA Marker Ⅳ对比发现符合其理论值。COL3A1的基因大小约为3069 bp, 插入到pPIC9K上后重组质粒大小约为12.3 kb。图 2B中的电泳条带远大于7000 bp, 是pPIC9K-COL3A1重组质粒条带。以上结果表明两种重组质粒构建成功。
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图 2 两种重组质粒的琼脂糖凝胶电泳分析 Fig. 2 The agarose gel electrophoresis analysis of two recombinant plasmids |
实时定量PCR结果可以反映目的基因在mRNA水平的表达。来自于4种菌株的L593与COL3A1基因的平均CT值列于表 1中。CT值与酵母基因组中整合的DNA拷贝数有关, 拷贝数越高, CT值越低[14]。在以2-ΔΔCT计算时, 将不含P4H的1 #菌株基因表达量设定为1。表 1的数据显示这4种菌株均能够表达外源蛋白, 而且随着基因拷贝数的增加, 2#, 3#, 4#菌株中L593蛋白的表达量依次增加, 这是由于多拷贝的重组子有助于提高目标蛋白的表达水平。同时, 这4种菌中COL3A1的表达水平差异不大, 这可能是由于它们含有接近的COL3A1基因拷贝数。
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表 1 4种菌中L593与COL3A1基因的平均表达水平 Tab. 1 Average CT values of L593 and COL3A1 from four different strains |
不同菌株培养72 h后提取的胞内蛋白的电泳结果如图 3所示。从图 3可观察到COL3A1的表观分子量大约为110 kDa, 由2#, 3#, 4#菌株表达的L593蛋白约是27 kDa, 与Western Blot(WB)的结果相符合。同时, 随着基因拷贝数的增加L593蛋白的表达量也在增加(这与实时定量PCR分析结果一致), 且4#菌株中蛋白的降解明显低于2#和3#菌株(目标条带下方大部分为其降解产物), 这可能是由于高的羟基化率可以减弱蛋白肽链的降解。
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图 3 COL3A1与L593蛋白的SDS-PAGE及Western-Blot分析 Fig. 3 The SDS-PAGE and Western-Blot analysis of COL3A1and L593 protein |
将来源于4#菌株的COL3A1蛋白水解并进行氨基酸组成分析, 根据保留时间的不同可以分别检测出羟脯氨酸与脯氨酸。图 4表示由4#菌株表达的COL3A1的氨基酸分析图。从图 4及表 2中可以看到Hyp的保留时间是4.927min (箭头所指), 而脯氨酸是9.087min。按照Hyp与Pro峰高的比值计算出本研究表达的COL3A1羟基化率为35%。结果表明通过将胶原与拟病毒的P4H(L593)共表达可以获得羟基化的胶原, 这也证明L593在酵母中也能以可溶的、有活性的状态存在。这种羟基化的实现可能是由于L593的催化部位与动物P4H的α亚基的活性部位具有相似性。
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图 4 COL3AI蛋白的氨基酸组成分析 Fig. 4 The amino acid composition analysis of COL3A1 |
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表 2 通道2的检测结果 Tab. 2 VIS 2 Results |
通过对比UniProt(P02461, COL3A1)数据库, 63%的序列覆盖率(图未示出)证实该蛋白为COL3A1蛋白, 而且质谱结果进一步证实了Hyp的存在。表 3中列出了两条序列相同、分别来自于未羟基化的COL3A1(A肽链)和本研究表达的羟基化的COL3A1(B肽链), 这两条肽链的分子量分别2055.094632 Da和2087.082612 Da。
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表 3 A, B肽链的氨基酸组成及分子量 Tab. 3 The amino acid compositions and molecular weights of two tryptic peptides A, B |
由于在分子量上羟脯氨酸正好比脯氨酸大16 Da[15], 而这两条肽链刚好相差32 Da, 这说明B肽链的两个脯氨酸位点被羟基化。在表 3分子量发生变化的位点已被灰体标出, 从表中可以看到GSPGAQGP*P*GAPGPLGIAGITGAR序列中y16和y17号的脯氨酸发生羟基化, 并且与人源的P4H不同的是, L593对G-X-Y重复三联体中的X或Y位置的脯氨酸没有偏好性。
3 讨论本研究成功将来源于拟病毒的羟脯氨酸酶L593与人Ⅲ型胶原全长α链基因在毕赤酵母中共表达。实时定量PCR分析结果显示两种基因均在mRNA水平表达; SDS-PAGE和Western Blot结果进一步证实两种蛋白在毕赤酵母GS115中的成功表达; 氨基酸组成分析和LC-MS/MS质谱分析结果表明共表达的胶原中含有羟脯氨酸, 胶原蛋白成功被羟基化, 并且羟基化率达到35%。
一般地, 理论上动物的P4H为胶原羟基化最适的酶, 但它的形成比较复杂, 活性易受外界环境的影响, 不适合应用于大规模生产羟基化的重组胶原。而病毒的P4H结构简单、活性稳定, 并且与动物P4H存在序列相似性, 其可以成为一种较理想的选择。本研究证实了人Ⅲ胶原全长α链与病毒的P4H在毕赤酵母中共表达可以实现胶原蛋白的羟基化。这为胶原蛋白的羟基化提供了新的途径方法, 也为羟基化重组胶原的放大生产奠定了理论基础。后续工作还可以通过基因优化、启动子优化以及培养条件优化进一步提高胶原的羟基化率以接近人源P4H的羟基化水平。
| [1] |
LI X, MA X, FAN D, et al. New suitable for tissue reconstruction injectable chitosan/collagen-based hydrogels[J]. Soft Matter, 2012, 8(8): 3781-3790. |
| [2] |
SHOULDERS M D, RAINES R T. Collagen structure and stability[J]. Biochemistry, 2009, 78(78): 929-958. |
| [3] |
TOMAN P D, CHISHOLM G, MCMULLIN H, et al. Production of recombinant human type Ⅰ procollagen trimers using a four-gene expression system in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(30): 23303-23309. DOI:10.1074/jbc.M002284200 |
| [4] |
PROCKOP D J, JUVA K. Synthesis of hydroxyproline in vitro by the hydroxylation of proline in a precursor of collagen[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1965, 53(3): 661. DOI:10.1073/pnas.53.3.661 |
| [5] |
HUTTON J J, UDENFRIEND S. Soluble collagen proline hydroxylase and its substrates in several animal tissues[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1966, 56(1): 198-202. DOI:10.1073/pnas.56.1.198 |
| [6] |
HELAAKOSKIi T, VUORI K, MYLLYLÄ R, et al. Molecular cloning of the alpha-subunit of human prolyl 4-hydroxylase:the complete cDNA-derived amino acid sequence and evidence for alternative splicing of RNA transcripts[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1989, 86(12): 4392-4396. DOI:10.1073/pnas.86.12.4392 |
| [7] |
JOHN D C, GRANT M E, BULLEID N J. Cell-free synthesis and assembly of prolyl 4-hydroxylase:the role of the beta-subunit (PDI) in preventing misfolding and aggregation of the alpha-subunit[J]. Embo Journal, 1993, 12(4): 1587-1595. DOI:10.1002/embj.1993.12.issue-4 |
| [8] |
GORRES K L, RAINES R T. Prolyl 4-hydroxylase[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 45(2): 106-124. DOI:10.3109/10409231003627991 |
| [9] |
RUTSCHMANN C, BAUMANN S, CABALZAR J, et al. Recombinant expression of hydroxylated human collagen in Escherichia coli[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(10): 4445-4455. DOI:10.1007/s00253-013-5447-z |
| [10] |
GORRES K L, RAINES R T. Prolyl 4-hydroxylase[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 45(2): 106-124. DOI:10.3109/10409231003627991 |
| [11] |
POZZOLINI M, SCARFI S, MUSSINO F, et al. Pichia pastoris production of a prolyl 4-hydroxylase derived from Chondrosia reniformis sponge:A new biotechnological tool for the recombinant production of marine collagen[J]. Journal of Biotechnology, 2015, 208: 28-36. DOI:10.1016/j.jbiotec.2015.05.007 |
| [12] |
ERIKSSON M, MYLLYHARJU J, TU H, et al. Evidence for 4-Hydroxyproline in viral proteins[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(32): 22131-22134. DOI:10.1074/jbc.274.32.22131 |
| [13] |
LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108. DOI:10.1038/nprot.2008.73 |
| [14] |
付春华, 陈孝平, 余龙江. 实时荧光定量PCR的应用和进展[J]. 激光生物学报, 2005, 14(6): 466-471. DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2005.06.015 |
| [15] |
MERRIWEATHER A, GUENZLER V, BREENER M, et al. Characterization and expression of enzymatically active recombinant filarial prolyl 4-hydroxylase[J]. Molecular & Biochemical Parasitology, 2001, 116(2): 185-197. |