2017, Vol. 47
USP2是泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin proteasome system, UPS)的重要负向调控蛋白去泛素化酶(Deubiquitylating enzymes, DUB)家族, 泛素特异性蛋白酶亚家族成员, 定位于11号染色体长臂(11q23.3)[1]。UPS主要通过影响被修饰蛋白的定位、功能和稳定性等在多种细胞进程中发挥重要的调节作用, 是真核细胞内重要的蛋白质监测系统, 也是蛋白质降解的一种重要方式[2]。DUB通过去泛素化作用将泛素标签从蛋白上切除掉, 从而使蛋白逃脱被降解的命运[3], 是泛素化的一个重要对立机制, 使得泛素修饰的调节具有平衡性。
研究表明USP2a参与了多个细胞进程与多种肿瘤的发生发展相关, 在多种肿瘤细胞株中, USP2a基因沉默能诱导细胞凋亡[4]。如在前列腺癌中超表达USP2a能够稳定脂肪酸合成酶(fatty acid synthase: FAS)[5]; USP2a能够促进乳腺癌细胞株的迁移和侵袭[6]; 在脂联素抑制乳腺上皮细胞(MCF-10A)增殖的研究中, 发现USP2a mRNA水平明显升高[7]; USP2a的异常表达能够使MDM2以剂量依赖形式聚集, 同时能促进MDM2介导的p53降解, 而抑制USP2a则诱导细胞的凋亡[8-9]。cyclin D1也是USP2a的底物之一[10], USP2a与细胞增殖和凋亡有关, 可能参与细胞周期调控[11-12], 另有研究证明, USP2a与炎症反应有关, 如USP2a参与了TNF-α诱导的NF-κB的激活[13]等。因此，认为USP2a可能具有癌基因的功能[14]。研究USP2a的催化机制, 开发抑制USP2a功能的新型抑制剂已成为当前研究的重要方向。
本研究根据USPs家族序列分析, 并结合USP2a晶体结构分析, 推测USP2a保守区域氨基酸残基Asn218，Cys223，His464和Asn482可能对酶活性具有重要的作用。因此，以质粒USP2a为模板进行点突变, 分别将这4个氨基酸残基进行失活突变, 通过研究突变后对USP2a的催化活性的影响, 分析它们在催化过程中的作用机制。同时，选取Ub-AMC和Di-Ub两个不同性质的底物, 分析USP2a的催化特异性, 通过以上的研究分析USP2a的催化机制。本研究将对肿瘤的诊断、治疗提供重要的理论与实验基础。
1 材料与方法 1.1 引物设计与合成以USP2a质粒为模板(pVL169.1加拿大国家研究理事会生物技术研究所赠), 根据文献USP2a晶体结构分析结果, 设计引物对推测的酶活关键部位进行失活突变, 突变位点与引物序列如表 1所示。
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表 1 USP2a突变位点及引物设计序列 Tab. 1 Site mutation primers of USP 2a |
以USP2a质粒为模板, 使用QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit突变试剂盒进行点突变PCR。PCR反应体系:dNTP(2.5mmol/Lol/L), 10×pfu buffer 2.5μL, 上、下游引物0.5μL, 模板0.5μL, pfu酶0.2μL, ddH2O 18.8μL; PCR反应条件:95℃预变性5min; 95℃，30s, 55℃，50s, 72℃，7min, 18个循环; 72℃，8min。PCR产物经1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测, DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
1.3 USP2a重组蛋白的表达与纯化转化USP2a-WT(野生型)和USP2a-Ms(突变体)重组质粒到BL21细胞中后, 在平板上挑取单个克隆菌落, 接种于3mL包含有100μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培养基中, 37℃，200r/min过夜培养。将菌液转移到含有相应的抗生素的100mL LB培养基中扩增培养, 待OD600值达到0.6~0.8时加入IPTG诱导蛋白表达。诱导表达3~4h后, 4℃，4 500r/min离心30min收集细胞, 超声裂解后, 12 000r/min, 离心5min, 上清转移至新的EP管中, 沉淀加入100μL PBS重悬, 取上清和沉淀各100μL, 分别加入100μL 2×SDS Loading buffer, 混匀, 煮沸10min, 进行SDS-PAGE电泳分析。蛋白的纯化使用组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(His-Bind Purification Kit), 依照组氨酸标签蛋白纯化试剂盒说明书进行蛋白纯化。
1.4 USP2a重组蛋白的酶活性分析使用SPEX Fluorolog-2 spectrofluorometer (excitation λ, 380 nmol/L; emission λ, 440 nmol/L)检测系统, 整个反应在室温25℃进行。将底物Ub-AMC稀释成100nmol/L~2 000nmol/L的浓度梯度, 与恒定浓度的酶USP2a-WT或USP2a-Ms进行反应, 测出每个Ub-AMC浓度梯度的反应初始速率(v)。根据米氏方程v=(vmax×Cs)/(Cs+Km)，式中：v为反应初始速率；vmax为反应最大速率；Cs为底物浓度；Km为米氏常数，以v对Cs作酶动力学曲线图。空白对照为只含反应缓冲液和底物，不含酶。
1.5 LC-MS/MS分析USP2a重组蛋白的酶活性将6μmol/L底物Di-Ub分别和50nmol/L USP2a-WT或USP2a-Ms加入到60μL的反应缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl (pH7.8)，200 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT和0.1 mg/mL ovalbumin)混匀, 立刻10μL每管进行分装、标记, 室温条件下反应。在反应时间0min，15min，30min，60min和120min时各加入10μL终止缓冲液φ(水):φ(乙腈):φ(乙酸):80:20:1终止反应, 15 000r/min离心3min, 将20μL的样品在Agilent 1 200 HPLC系统和Agilent QQQ6410质谱上检测[15], 数据处理软件为Mass Hunter workstation software。
1.6 SDS-PAGE分析USP2a重组蛋白的酶活性取2.04μL Di-Ub(母液1μg/μL)加入到反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)，200mmol/L NaCl)和2mmol/L DTT中, 终浓度为6μmol/L, 将USP2-WT和USP2-Ms稀释成500nmol/L, 分别取2μL加入到每一反应体系中, 总体积20μL, 终浓度为50nmol/L, 室温反应1h。最后加入5μL 5×SDS样品缓冲液终止反应。阴性对照只含有反应缓冲液和Di-Ub, 不加酶, 其他条件不变。将样品25μL全部上样电泳, 用考马斯亮蓝染色, 脱色后即可得到反应结果。
2 结果 2.1 USP2a的克隆以USP2a质粒为模板, 设计突变引物通过PCR扩增对USP2a进行点突变, 产物经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测, 在1 000bp左右处有特异性条带, 大小与预期相符。经酶切连接载体pET28a(+)以及DNA测序鉴定, 结果证实获得正确的点突变序列(突变测序结果见附录)。
2.2 USP2a重组蛋白的表达与纯化将测序正确的重组质粒pET28-USP2a-WT或pET28-USP2a-Ms按照材料与方法1.3所述表达与纯化。纯化后的USP 2a重组蛋白使用LC-MS/MS分析纯度和分子量。USP2a-WT重组蛋白SDS-PAGE电泳图和液相色谱质谱分析图见图 1。
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A 重组蛋白USP2a-WT蛋白诱导表达图 1 未诱导空白对照; 2 诱导后的全菌液; 3 超声裂解后的上清; 4 超声裂解后的沉淀; 5 蛋白Marker(kD) B 重组蛋白USP2a-WT蛋白纯化电泳图 1-4 洗涤穿出液; 5 Ni-NTA珠子; 6-7 纯化后的目的蛋白; 8 蛋白Marker(kD) C 重组蛋白USP2a-WT高效液相图 D 重组蛋白USP2a-WT质谱分析图分子量检测值41361.8Da; 理论分子量41362.1Da; 差值0.3Da 图 1 USP2a-WT重组蛋白分析图 Fig. 1 Recombination protein of USP2a-WT |
由此可知，重组蛋白USP2a-WT存在于裂解后的上清中, 证明为分泌型表达且纯化效果高。LC-MS分析得到单一的主峰, 同时MS检测的分子量大小为41 361.8Da, 理论值为41 362.1Da，误差0.3Da, 证明所表达纯化的蛋白正是USP2a-WT。其他USP2a-Ms突变体蛋白纯化后LC-MS/MS检测结果见表 2。
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表 2 LC-MS/MS分析纯化USP2a-Ms重组蛋白的分子量 Tab. 2 Molecular weights of USP2a-Ms by LC-MS/MS |
按照材料与方法1.4的步骤对重组蛋白USP2a-WT和USP2a-Ms进行酶动力学分析, 反应底物为Ub-AMC。根据米氏方程以反应的初速度v对底物浓度Cs作图, 计算重组蛋白USP2a-WT和USP2a-Ms催化分解Ub-AMC的最大反应速率vmax、米氏常数Km、催化常数Kcat以及催化效率Kcat/Km，详细参数见表 3。
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表 3 USP2a-WT和USP2a-Ms的酶动力学参数(底物:Ub-AMC) Tab. 3 Enzyme kinetics parameter of USP2a-WT and USP2a-Ms |
从表 3可知, 氨基酸残基C223与H464突变后, 酶显示无活性, 其余突变体的催化效率与野生型无显著区别。
2.4 LC-MS/MS分析USP2a重组蛋白分解底物Di-Ub的酶活性为了检测USP2a催化不同性质底物的特异性, 研究选取了双泛素Di-Ub(UbK48C-UbD77)作为反应底物, 检测USP2a关键位点突变后酶的催化活性状况。底物Di-Ub中两个泛素之间是由异肽键相连接, 为防止底物内部氨基酸之间的相互作用而环化, 分别对第1个泛素的第48位赖氨酸残基(K)突变成半胱氨酸(C), 第2个泛素的羧基末端突变增加了一个氨基酸颉氨酸(V)。按照材料与方法1.5的步骤进行实验, 结果如图 2。
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A LC-MS/MS分析重组蛋白USP2a-WT和USP2a-Ms分解Di-Ub反应进行图; B USP2a-WT和USP2a-Ms催化分解Di-Ub不同时间点底物的量随时间变化图; C 反应进行120min时USP2a-WT和USP2a-Ms催化分解Di-Ub量的柱形图 图 2 USP2a分解Di-Ub的活性分析图 Fig. 2 LC-MS/MS analyze USP2a hydrolyze Di-Ub |
由此可知，突变体USP2a-D482A和野生型USP2a-WT反应速率相近; 突变体USP2a-N218A的催化效率低, 约为WT反应速率的1/4, 两者与野生型均无显著差异。这两个位点的双突变体USP2s-N218A/D482A的活性非常低, 反应进行120min后底物消耗尚未达到20%。可以看出，双突变体USP2a-N218A/D482A与野生型USP2a-WT的活性具有显著差异。
2.5 SDS-PAGE分析USP2a重组蛋白分解底物Di-Ub的酶活性为验证LC-MS/MS的结果, 使用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白USP2a-WT和USP2a-Ms催化分解Di-Ub的结果，结果如图 3所示。突变体USP2a-N218A和USP2a-D482A均能催化分解底物Di-Ub, 其效果与野生型USP2a-WT一致; 而突变体USP2a-C223A，USP2a-H464A和双突变体USP2a-N218A/D482A则显示出无催化活性。这一结果与LC-MS/MS一致。
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图 3 SDS-PAGE分析重组蛋白USP2WT和USP 2m分解Di-Ub电泳图, 对照为只含有缓冲液和底物不含酶 Fig. 3 SDS-PAGE analyze USP2-WT and USP2-Ms hydrolize Di-Ub, control: only buffer and substrate no enzyme |
为了研究USP2a的催化机制, 本研究根据USPs家族序列分析并结合USP2a晶体分析, 选定了USP2a保守区域氨基酸残基Asn218，Cys223，His464和Asn482进行研究, 推测该保守区域可能对USP2a的酶活性具有重要的作用。因此，以质粒USP2a为模板进行点突变, 分别将这4个氨基酸残基突变成丙氨酸, 通过研究这些位点失去活性时对USP2a的活性的影响, 分析他们在USP2a催化过程中的反应机制。同时，选取Ub-AMC和Di-Ub两个不同性质的底物, 分析USP2a的催化特异性, 通过以上的研究分析USP2a的催化机制。
实验结果显示氨基酸残基Cys223和His464突变后酶完全失活, 证明这两个氨基酸直接参与到了酶的催化反应中。另两个氨基酸残基Asn218和Asp482分别突变成丙氨酸后对酶的活性没有显著的影响, 但将他们进行双突变后, 突变体USP2a-N218A/D482A则在催化分解底物Di-Ub活性显著降低, 说明这两个位点在酶的催化反应中是联合起作用的, 推测氨基酸残基Asn218和Asp482可能是形成了Asn218-Asp482电子对共同作用在催化过程中稳定了氨基酸残基His464。这一催化机制与去泛素化酶otubain-2相似[16]。在otubain-2中有2个氨基酸残基Asn226和Thr45共同作用稳定了His224, 当突变其中任何一个成丙氨酸时另一个仍然能够形成His-Asp对稳定组氨酸, 使得His464能够与Cys223形成thiolate-imidazolium电子对, 催化反应能够顺利进行。
本研究选取了Ub-AMC和Di-Ub两种底物, 其中Ub-AMC是去泛素化酶的通用底物, 泛素Ub与AMC之间以肽键连接, 去泛素化酶切割Ub与AMC之间的肽键释放出荧光因子AMC。在380nmol/L激发光下能够激发AMC发出荧光, 同时荧光在440nmol/L波长下被吸收, 通过对荧光的检测从而测定酶的活性。结果显示, 除了氨基酸残基Cys223和His464以外, 其他突变体催化分解Ub-AMC的活性并没有显著降低, 因此推测氨基酸残基Asn218和Asp482并没有参与, 或是没有直接参与到分解Ub-AMC的反应中。Di-Ub中两个泛素之间是由异肽键相连接, 实验结果显示突变体USP2a-N218A/D482A在催化分解底物Di-Ub时活性显著降低, LC-MS/MS与SDS-PAGE实验结果一致, 说明氨基酸残基Asn218和Asp482直接参与到了USP2a催化分解Di-Ub的反应中。结果说明, USP2a在分解底物Ub-AMC和Di-Ub时存在不同的催化机制。之后我们将对USP2a的底物特异性以及在细胞中的活性机制开展进一步的研究。
本结果将对今后USP2a催化机制的研究以及USP2a抑制剂的研究具有重要的理论和实验意义, 将对肿瘤的诊断、治疗和新药的开发具有重要的意义。
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