本研究组在前期实验中，观察到了C57小鼠可用来稳定地构建氯胺酮相关性膀胱炎模型，长期吸食氯胺酮可引起膀胱组织慢性炎症改变及上皮细胞鳞状化生，尿液中钾离子升高，推测可能与尿路上皮屏障的破坏有关^[1]。紧密连接是维持黏膜上皮机械屏障和通透性的重要结构。紧密连接蛋白ZO-1(zonula occludens-1)是其重要组成蛋白之一，参与维持上皮极性，常被用来作为观察组织紧密接屏障功能和通透性的指标^[2]。为此我们对紧密连接及ZO-1蛋白的表达进行了研究。

SPF级雌性小鼠C57BL/6(动物生产许可证号为SCXK (鄂)2008-0004，动物质量合格证号为NO.4200593096、NO.4200500318，使用合格证：00068750)60只，体质量18-20 g，6-8周龄。将60只小鼠随机分为试验组和对照组，每组30只。各组根据注射药物时间长短组内分为4, 8, 12周组；每小组10只。所有动物处理获得武汉大学实验动物伦理委员会批准并遵循武汉大学实验动物管理相关条例。

试验组小鼠每天腹腔注射浓度为10 mg/ml的氯胺酮注射液(产品批号为110302，由武汉大学人民医院药剂科提供)100 mg/kg，持续时间为4、8、12周；对照组按同法腹腔注射生理盐水10 ml/(kg·d)，持续时间与试验组相同。

断颈法处死小鼠后，行腹壁正中切口取出膀胱组织，沿膀胱纵轴剪开，一半放入2.5%戊二醛中，用于电镜观察；另一半放入多聚甲醛中固定，用于石蜡包埋。

组织取材后迅速投入2.5%戊二醛中固定12 h，后用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min；1%锇酸固定1 h；0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min；依次按50%、70%、80%、95%、100%乙醇脱水，每个浓度2次，每次15 min。随后置于纯丙酮脱水2次，每次15 min。EPON812与丙酮按1:1浸润30 min，纯包埋液浸润1 h，37 ℃纯包埋液固化24 h，60 ℃纯包埋液固化48 h。瑞典BROMMA公司产LKB-V型超薄切片机切成70 nm。醋酸双氧铀，枸橼酸铅及50%乙醇饱和溶液染色15 min。日立透射电镜(Hitachi H-600)观察。

所取膀胱组织经4%多聚甲醛溶液固定后制成石蜡切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。修复液滴入组织并置于载玻片，微波修复。按SP法行免疫组织染色，具体步骤按试剂盒说明书(SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒由上海蓝基生物科技有限公司生产)。其后行复染、脱水、透明、封片。利用Axioplan 2 imaging显微图像分析系统进行分析。

正常ZO-1蛋白阳性表达呈棕黄色，呈线状定位于细胞膜，细胞连接部密度高。将完全或大部分定位于胞膜者为正常，将大部分定位于胞质少部分定位于胞膜者、完全定位于胞质者及没有表达者视为异常。按正常数量与异常数量进行计数资料处理。

应用SPSS (17.0 for Windows)软件处理实验数据，计数资料采用Fisher’s确切概率法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

正常膀胱伞状细胞管腔面有许多指状突起，细胞电子密度适中，由大量斑点状结晶，结晶中含有大量的胆固醇和神经鞘胺醇。上皮细胞之间靠近管腔面由紧密连接封闭，电子密度高，细胞大小约15-18 μm。细胞间距离极小(图 1A-D8周对照组小鼠)。氯胺酮组4周时便出现了指状突起减少，细胞电子密度减低，斑点状结晶减少，线粒体数量减少、水肿，紧密连接疏松(图 1E-1H)。8周时细胞管腔面几乎变平，指状突起消失，紧密连接间距离进一步增大，细胞间距离加大，细胞变小，约11-12 μm (图 1I-1K)。12周时，除上述变化外，紧密连接几乎被破坏，黏膜层出现断裂，黏膜下纤维化明显(图 1P)。同时在8周时，观察到了膀胱细动脉内皮细胞胞体皱缩，胞质密度增加，染色质浓缩，形成靠近核仁的新月形小体，这些特征与细胞凋亡极其类似(图 1L)。

图 1(Figure 1)

图 1 不同时间段膀胱组织上皮细胞及黏膜下层电镜图 A-D为对照组(8周)，E-H为氯胺酮组(4周)，I-L为氯胺酮组(8周)，M-P为氯胺酮组(12周)；其中箭头表示指状突起，▲为内皮细胞样凋亡

见表 1，图 2。正常ZO-1蛋白阳性表达呈棕黄色，呈线状定位于细胞膜，细胞连接部密度高，成巢蜂状。实验组从4周开始，出现ZO-1蛋白表达于细胞质中，部分呈斑块状表达，细胞膜中表达极少，部分标本中未见表达。12周时，异常表达程度进一步加重。对照组4、8、12周异常表达所占比例分别为0/10(0%)，1/10(10%)，1/10(10%)；实验组分别为7/10(70%)，7/10(70%)，9/10(90%)；Fisher确切概率法检验后P值分别为0.003、0.02、0.001，均有统计学意义(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 各组标本中ZO-1蛋白严格表达于细胞膜的标本数及相关百分比[n(%)] 表达结果 实验组 对照组 P 4周 0.003   正常 3(30) 10(100)   异常 7(70) 0(10) 8周 0.02   正常 3(10) 9(90)   异常 7(70) 1(10) 12周 0.001   正常 1(10) 9(90)   异常 9(90) 1(10)

表 1 各组标本中ZO-1蛋白严格表达于细胞膜的标本数及相关百分比[n(%)]

图 2(Figure 2)

图 2 ZO-1在膀胱组织中的表达(SP×200) A:对照组8周时膀胱组织；B:氯胺酮组8组时膀胱组织

膀胱为存尿器官，尿液在膀胱中停留时间长，尿液中代谢废物为血浆的数倍，膀胱上皮屏障在维持该化学梯度中起重要作用^[3]。膀胱上皮屏障由氨基葡聚糖(GAG)、上皮细胞之间的紧密连接以及特化的伞状细胞组成。我们通过电镜观察膀胱上皮超微结构，进一步证实了膀胱黏膜屏障受损。氯胺酮组4周时便出现了指状突起减少，细胞电子密度减低，斑点状结晶减少，线粒体数量减少、水肿，紧密连接疏松。随着氯胺酮的持续作用，上皮细胞管腔面逐渐变平，紧密连接被破坏，细胞间距加大，细胞大小约11-12 μm，较正常细胞小(15-18 μm)。12周时，除上述变化外，紧密连接被破坏，黏膜层断裂，黏膜下纤维化明显。膀胱黏膜屏障的受损，使得尿液中尿素、胺类、钾离子渗入膀胱间质内，导致深层组织发生炎症。有研究推测，氯胺酮及其代谢产物损害毛细血管的内皮细胞，导致血管壁硬化，产生微循环障碍^[4]。本研究亦观察到了毛细血管内皮细胞皱缩，染色质浓缩，形成新月形小体，出现了与细胞凋亡类似的情况(图 1L)。据此推测膀胱微循环障碍也参与了膀胱组织发生炎症的过程。

本研究从免疫组化上表明膀胱上皮屏障的破坏与上皮间紧密连接蛋白的改变相关。紧密连接具有维持上皮细胞极性和调节细胞间物质交换的功能。ZO-1蛋白一端为紧密连接组成的一部分，其另一端连接着细胞骨架-微管，其表达缺失能使上皮细胞紧密连接形成过程时，无法聚集到细胞连接处^[5]。本文中，4、8、12周实验组小鼠ZO-1蛋白表达异常，且随着用药时间的延长，异常表达进一步加重，有的甚至出现ZO-1蛋白的缺失。对ZO-1蛋白的表达调节，往往通过PKC通路进行^[6]。据此我们推测氯胺酮及代谢产物或许通过该通路，导致ZO-1蛋白的表达异常，进而影响微丝的运动，使得上皮细胞的管腔面变平，紧密连接破坏，上皮屏障被破坏。

本研究表明，氯胺酮相关性膀胱炎其损害机制与尿路上皮屏障通透性改变有关。其致病机制可能与氯胺酮通过某通路，引起ZO-1蛋白异常表达，继而影响微丝运动，紧密连接受损，膀胱尿路上皮屏障破坏有关。值得关注的是，实验中观察到了细小动脉内皮细胞类似凋亡的现象，提示膀胱缺血可能参与了形成慢性膀胱炎的过程，这将是我们下一步研究的方向。