我国是地方猪种质资源最丰富的国家，1986版《中国猪品种志》中详细介绍了48个中国地方猪种，并按自然地理分布将它们划分为华北型、华中型、华南型、江海型、西南型和高原型^[1]。随着时间推移，我国发现的地方猪种数量不断增加。2007年，联合国粮农组织调查结果显示，我国地方猪品种已达114个，占全球猪种资源的30%^[2]。与国外高产猪种相比，我国地方猪种在粗饲料耐受、繁殖力、肉质和适应力等方面更加优秀，但由于其出生体重小、精饲料转化力差、瘦肉率和屠宰率低、饲养周期长等特点，地方猪种在市场经济条件下极度缺乏生产效率和经济效益优势^[3]。由于多年来片面追求高瘦肉率和生长速度，我国大量引进外来育成品种，对地方猪种进行杂交改良，使种猪和商品猪的规模生产基本被外来猪种垄断^[4]，致使部分地方猪种濒危或灭绝，如项城猪（Sus scrofa domesticus Xiangcheng）、深县猪（Sus scrofa domesticus Shenxian）、豪杆嘴型内江猪（Sus scrofa domesticus Neijiang）和大普吉猪（Sus scrofa domesticus Puji）已被证实彻底灭绝^[5]。地方猪种遗传资源多样性正遭受严重破坏，各种优质基因不断流失。遗传资源丢失会使品种内遗传变异减少，对我国生猪生产的可持续性产生严重影响，目前地方猪种遗传多样性的保护已迫在眉睫^[6]。现阶段除原位保存、精液和胚胎冷冻保存、DNA文库保种等方法外，体细胞库保种也是保留种质资源的有效手段^[7]。目前，牛^[8]、羊^[9]和鸡^[10]等家畜家禽的体细胞库已建立，但由于体细胞高度分化的特性及培养技术的限制，其目前只能通过体细胞核移植方式取得扩群效果^[11]。相较于体细胞，干细胞具有向各种细胞分化的潜能，其多能性更强^[12]，不仅可提高核移植的效率，得到更多健康仔猪^[13]，还可分化成生殖细胞样细胞^[14]，使未来有望通过有性生殖的方式扩大濒危猪种的种群数量。无论是从现有扩群途径还是未来发展前景看，干细胞都比体细胞更具优势。因此建立地方猪种干细胞库可以更加全面、更加有效的保护我国的地方猪种质资源。

1 现有地方猪种种质资源保护措施

原位保存法是以前最常用的活体保种法，即在地方猪种原产地建造良种基地，组建200头以上且各代群体规模基本一致的保种群，每隔2.5年增加一代，以防止群体近交系数过大^[15]。原位保存法以最直接的方式保留种质资源，但由于所需的保种维持费用较高导致无法在全国推广实施。其次，该方法需占用较大场地、组织管理工作复杂、受自然环境影响较大、优秀群体和个体生理利用年限短等缺点也是该保种方式受限的原因^[16]。而DNA文库保种、精液冷冻保存、胚胎冷冻保存和体细胞冷冻保存等非活体保种技术也有其各自不足之处^[17]。DNA文库保种是将畜禽细胞内的DNA片段通过连接质粒、转化入菌的方法进行扩增保存。建立DNA文库虽说可以有目的地保存控制优良性状的DNA片段，长久保存优质基因及遗传资源，但却无法复原原有动物种群，仅能简单保存基因的DNA片段。其次，由于DNA保存过程中易降解的特性，动物大片段DNA文库保存技术还需不断提升^[18]。精液和胚胎冷冻保存是将精液和胚胎在冷冻保护剂保护下，以最适降温速率冻到-196℃的液氮或-269℃的液氦中。如有需要，便可借助人工授精或胚胎移植技术快速扩大种群，进行种质创新，加快育种进度。然而，家猪的精液和胚胎冷冻保存与牛、马等家畜相比一直存在技术差距。在精液冷冻方面，猪一次射精量大，约有200-300 mL，因此精液对外界温度非常敏感，极其不耐冻。其次，猪是多胎动物，需要20-50亿精子才能满足1次配种，大剂量的猪精液冷冻保存给这项技术增加了困难^[19]。在胚胎冷冻方面，由于猪胚胎的脂质含量较高，冷冻保存难度大，使其胚胎冷冻保存技术相较于牛、羊等发展较为缓慢。不同发育阶段的胚胎需使用不同的玻璃化冷冻条件，如何界定胚胎状态并选出最佳冷冻条件也是其难点之一，且冷冻液选择和去脂操作都有待进一步改善^[20]。体细胞冷冻保存与精子胚胎冷冻技术相似，是将动物体细胞冷冻保存后，再通过体细胞核移植技术生产后代，由于体细胞比精子和胚胎更易从数量稀少的濒危物种上收集，因此体细胞冷冻保存被认为是最有潜力保护濒危物种的方法^[21]。然而，目前生殖性克隆成功率低，尤其在猪上，只有1%-5%移植到代孕母猪的重构胚胎能产生活的后代^[22]，且大部分仔猪出生后表现异常^[23]，使核移植效率进一步降低，极大限制该技术在保护种质资源中的实际应用。

2 干细胞技术概述

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的细胞，它不仅能分化成不同类型的细胞，以构成机体各种复杂的组织器官，还可通过细胞分裂维持自身群体稳定。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（Adult stem cells，ASCs）^[24]。1981年，Evans等首次分离小鼠胚胎内细胞团（Inner cell mass，ICM），并通过体外培养获得稳定的胚胎干细胞系^[25]。诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）和胚胎干细胞有一定相似性，是由已分化的体细胞诱导重编程而来，具有多能性且能自我更新^[26]。2006年，山中伸弥等将OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC（OSKM）4个转录因子通过病毒载体转到小鼠体细胞内，首次得到类似胚胎干细胞的全新多能细胞^[27]。2009年，周琪课题组和高绍荣课题组分别使用四倍体囊胚注射法获得iPSCs来源小鼠，再次证明iPSCs具有与ESCs相似的多潜能特性^[28-29]。此外，ASCs向生殖细胞分化也一直处于干细胞研究热点中。ASCs在哺乳动物体内大量存在，多能性相对ESCs较低，但大量研究证明ASCs具有转分化为生殖细胞的能力，如骨髓干细胞、脂肪间充质干细胞、皮肤干细胞和胰腺干细胞等均被证实可在体外转分化为生殖细胞样细胞^[30]。

3 干细胞技术在地方猪种质资源保护中的应用前景及可行性

人和小鼠的干细胞在体外已得到广泛研究。猪作为人类较早驯化的动物之一，其主要脏器大小和生理结构功能与人类非常相似^[31]，所以猪干细胞研究一直是干细胞领域研究热点，在小鼠干细胞大量前瞻性研究成果指引下，猪干细胞研究正逐步取得突破^[32]。从大量已知报道中可知^[33-36]，由于干细胞的全能性特质，其在种质资源保护中有广泛的应用前景。

3.1 胚胎干细胞及诱导多能干细胞技术的应用

分化培养ESCs并获得后代一直被全球科学家们所热衷，在小鼠上已重复大量实验，技术手段不断完善。2012年，日本九州大学Hayashi等^[37]成功将小鼠ESCs诱导成原始生殖细胞，而后将这些原始生殖细胞移植入成年小鼠体内获得正常卵母细胞。2016年，Hayashi等完全在体外实现ESCs分化为卵细胞，分化的卵细胞受精后可产生正常后代，这样就摆脱需要成年个体的限制，且整个技术流程极为精简^[38]。猪ESCs系始建于1990年，Evans等^[39]以猪植入前胚胎作为原始材料，发现当胚胎在小鼠成纤维细胞饲养层上生长时，可以无限期地保持在未分化状态，并在达到高密度时自发分化成上皮、肌肉和神经等各类细胞，他们依据这些现象初步描述了猪ESCs的特征。2016年，刘忠华课题组成功从体外培养5.5 d的囊胚中取出猪ESCs^[40]。两年内，该细胞被传代超过75次，克隆团的形态与人胚胎干细胞极为相似，且表达OCT4、SOX2和NANOG等经典多能标志物。2019年，该课题组又通过KOLF培养体系获得可在体外稳定培养40代以上且具有扁平形态和正常核型的猪ESCs，这些细胞不仅表达碱性磷酸酶活性，还表达OCT4、SOX2和NANOG等多能性标志物，并可在体内形成含有三胚层的畸胎瘤，说明该细胞在体外和体内都具有分化能力^[41]。目前体外培养的猪ESCs和小鼠ESCs初始态（Naïve）不同，传代能力和多能性状态不理想，更接近小鼠ESCs的始发态（Primed），且其仍无法嵌合到生殖系，只能被称为“猪类胚胎干细胞” ^[42]。因此，猪ESCs的研究暂时告一段落，随着iPSCs技术出现，猪iPSCs又继续向前发展。

2009年，由iPSCs培养产生的成年小鼠在Boland实验室中产生^[43]。这让研究者们看到这项技术的光明前景，iPSCs技术从此受到广泛关注，并在几年内迅速发展^[44]。在保护濒危野生动物方面，由于取材方便、数量多且易于保存等优点，iPSCs技术已被动物保护学家视为最有前景的技术^[36]。自2009年起，科学家根据小鼠和人iPSCs的诱导系统及培养体系，开始尝试建立猪iPSCs系。2009年，Ezashi等^[45]使用慢病毒载体向胎猪成纤维细胞中导入hOCT4、hSOX2、hKLF4和hC-MYC四个转录因子，在小鼠胚胎成纤维细胞上培养22 d后得到猪iPSCs，该iPSCs具有正常核型，表达猪OCT4、NANOG和SOX2等多能标志物，有较高端粒酶活性，且在体内外均有分化成三胚层的能力。2010年，West等^[46]将6种人转录因子（POU5F1、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28和C-MYC）导入猪间充质细胞中，使其重编程为iPSCs。利用该iPSCs得到的嵌合体猪，80%都能嵌合到3个胚层的多种组织类型，嵌合率高。2012年，Fujishiro等^[13]同样将4个转录因子（OSKM）导入猪胚胎成纤维细胞中，通过在培养基中加入pLIF和forskolin两种细胞因子，第一次培养出类似于小鼠ESCs初始态的猪iPSCs。2013年，赖良学课题组^[47]通过让猪iPSCs自发分化和加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法，提高猪iPSCs作为供体细胞的核移植发育到囊胚的概率，且将这些iPSCs重构胚胎移植到代孕母猪中，成功获得健康克隆猪。2017年，韩建永课题组发现猪iPSCs向生殖细胞样细胞诱导分化的方法，所得到的细胞不仅表达DAZL和VASA等生殖细胞标志基因，还可继续分化成精原干细胞样细胞^[14]。现阶段，猪iPSCs的研究水平和深度已远超猪ESCs，且猪成体细胞不像ESCs那样稀少，取材更加便利，因此猪iPSCs比猪ESCs更适合应用到地方猪种质资源的保护中。利用濒危地方猪种成体细胞诱导出的iPSCs可分化成配子，放入地方猪种配子库中继续保存，又可结合核移植技术获得新生仔猪，扩大濒危地方猪种的种群数量。相比于其他保种方法，诱导多能干细胞技术在地方猪种质资源保护方面可发挥更大用处。

3.2 多能干细胞作供体细胞的核移植技术的应用

猪体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）已被广泛应用于转基因猪生产中，但该方法效率仍然很低。2009年，Oback等^[48]发现利用早期细胞会导致SCNT后胚胎发育率增加，因此推测，多能干细胞可能会增加SCNT的效率。2012年，刘忠华课题组分别利用小鼠ESCs和胚胎成纤维细胞诱导而来的iPSCs作为供核细胞，发现供核细胞的细胞周期对核移植后胚胎发育过程有重要影响，把供核细胞阻滞在M期能大幅提高克隆胚胎发育率，最终得到克隆小鼠并能产生后代^[49]。此类实验在猪上也有涉及。2017年，Secher等^[50]发现用猪多能干细胞代替体细胞进行核移植，胚胎发育到囊胚的个数增加，更有利于提高核移植效率，最终得到克隆猪的数量和质量都有所增加。由此可见，将干细胞作为核移植的供体细胞，会比普通体细胞核移植产生更好的效果，因为干细胞比体细胞更接近囊胚中的表观遗传状态，所需的重编程更少^[50]。干细胞作为供体细胞的核移植有望成为拯救濒危地方猪种最有效的方法，利用该技术可以得到更多优质仔猪，使地方猪种种群数量进一步扩大，遗传资源得到保存。

3.3 成体干细胞诱导分化技术的应用

ASCs中，骨髓干细胞、皮肤干细胞、胰腺干细胞以及人的羊水干细胞都已被证实可向配子分化^[51]。由于皮肤干细胞数量丰富，取材便利，因此皮肤干细胞向配子分化的研究备受关注。2001年，Toma等^[52]将小鼠皮肤分离培养后得到一种具有多向分化能力的ASCs，其在体外条件下能向神经细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞等分化。2004年，Dyce等^[53]第一次从胎猪上分离出皮肤来源干细胞，该细胞表达神经祖细胞标记基因Nestin，以及多能性相关基因OCT4和STAT3，并能诱导分化成神经元、星形胶质细胞和脂肪细胞样细胞，2006年，Dyce等^[54]又使用猪卵泡液成功诱导胎猪皮肤干细胞分化为具有透明带样结构的卵母细胞，诱导形成的卵母细胞表达DAZL和VASA等生殖细胞标记基因，且能分泌卵巢类固醇激素，并可孤雌激活形成囊胚。2011年，沈伟与Dyce分析由胎猪皮肤干细胞分化的卵母细胞样细胞时发现，一部分细胞处于减数分裂I期，且在H19基因5'端的DMR1区域与体内卵母细胞有相似的甲基化模式^[55]。同年，Song等^[56]从胎猪皮肤和脂肪中分离出ASCs，并用猪卵泡液诱导其分化成卵母细胞样细胞，该细胞在形态、碱性磷酸酶活性、细胞周期状态和各种细胞表面标记物的表达方面均与体内卵母细胞有相似的特征。由以上研究看出，猪皮肤来源干细胞向原始生殖细胞和卵母细胞分化是可行的。精原干细胞（Spermatogonia stemcells，SSCs）作为雄性体内唯一可将遗传物质传递给后代的细胞，也是一种ASCs^[57]。2011年，Sato等^[58]将小鼠SSCs在离体的培养条件下分化为可育精子。2018年，卢克焕课题组在基础培养基中加入敲除血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）和诱导因子，将猪SSCs在体外条件下培养至减数分裂后期，并表达STRA8和SCP3等减数分裂标志物，距离得到成熟精子仅一步之遥^[59]。在地方猪种干细胞库中，如能收集濒危地方猪种的ASCs，即可通过分化获得大量配子，进而达到拯救濒危地方猪种的目的。同时，配子发生过程中的减数分裂遗传重组可丰富物种进化过程中的遗传多样性，相较于体细胞核移植产生的单一基因型后代，由配子受精产生的仔猪更有利于濒危种群的繁衍。

4 总结与展望

猪ESCs、iPSCs和ASCs向配子分化技术及核移植技术已处于可应用阶段，我国学者已证实，通过干细胞与核移植技术相结合得到健康仔猪。虽然目前猪干细胞分化得到的配子样细胞还不具备受精发育成新个体的能力，但干细胞技术作为地方猪种质资源保护的新手段，为更好地保留我国濒临灭绝的地方猪种的优质生物资源提供了新思路。现阶段，须加快建立地方猪种质资源干细胞库，丰富对地方猪种遗传资源的保护手段。干细胞库可与配子库、胚胎库、基因库等一起，形成多层次、多角度，全方位的遗传资源保存体系。