2. 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070;
3. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室，兰州 730070
2. Gansu Key Lab of Crop Genetic & Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070;
3. Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science, Lanzhou 730070
番茄（Solanum lycopersicuml）是一种重要的果蔬，是植物中的作物。目前番茄生产中最主要的问题是病害问题，尤其是病毒病，而双生病毒科的双生病毒引起了世界主要蔬菜作物的重大经济病害，其中番茄黄叶卷曲病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是引起番茄严重病害的重要因素[1]。这种病毒通过昆虫载体-烟粉虱传播，在地中海东部、非洲北部和中部以及东南亚的夏季和秋季感染番茄品种。作为第一个报道的由烟粉虱传播的病毒，其具有单一的基因组分子，基因组由2 787个核苷酸组成，编码6个开放阅读框[2-3]。作为一种至少由两种病毒[4-5]番茄黄叶卷曲撒丁岛病毒和番茄黄叶卷曲病毒引起的病害，其病毒成员之间的遗传重组产生了一系列新杂交基因组[6]，因此该病毒已成为当今世界急需解决的一大难题。
目前番茄的育种策略主要集中在从相关野生种质中导入抗性等位基因，并在遗传上具有一定的特征。研究较多的基因有Ty-1、Ty-2以及Ty-3。Ty-1是从辣椒品种LA1969中导入的，定位于番茄第6号染色体[7]。从辣椒种质LA1932/LA2779/LA1938中导入了另一个TYLCV抗性基因Ty-3，并定位于第6染色体[8]。后来，Ty-1和Ty-3被确定为等位基因，并编码一种RNA依赖的RNA聚合酶，该聚合酶通过增加病毒基因组中的胞嘧啶甲基化而产生耐药性。发现的第二个TYLCV抗性基因为Ty-2基因，该基因位于11号染色体上[9]，确定Ty-2是一个核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列（NB-LRR）基因[10-11]。随后从辣椒品种LA1932中鉴定到另一个TYLCV抗性基因Ty-4，并定位于第3染色体。与其他Ty基因相比，Ty-4对TYLCV的作用较弱[12]。Ty-5编码一个信使RNA监视因子Pelota，它参与了蛋白质合成的核糖体循环阶段[13]，其被定位于4号染色体上，属于隐性抗病基因[14-15]，目前国内外对Ty-1到Ty-5的研究比较透彻，然而对于抗病基因Ty-6的研究鲜有报道。
因此，在本研究中我们通过克隆Ty-6基因，利用生物信息学手段对其编码蛋白的氨基酸序列进行分析，采用荧光定量PCR技术研究番茄植株感染TYLCV后Ty-6基因在不同时期不同组织中的表达特性，从而初步了解该基因的抗病功能特性，为今后进一步研究Ty-6的功能以及在植物遭受病害后该基因的表达模式提供一定的参考信息，同时也为番茄抗病育种提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料试验所用番茄种植于甘肃农业大学生科院试验基地，在光照培养箱（12 h光照/12 h黑暗，25±1℃）中培养，取材源于自育番茄的叶片与茎，将长势均匀一致的番茄幼苗接种TYLCV后0、5、15、30 d分别采取番茄叶片与茎，液氮冷冻后，-80℃保存备用，每个处理最少3次重复，用于后续试验。
1.2 方法 1.2.1 番茄RNA提取以及cDNA的合成采用天根试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit）进行操作提取番茄染病后0、20、30及40 d的茎和叶的总RNA，并通过超微量紫外分光光度计（Q5000）检测其浓度与纯度，以便后续反转录合成cDNA顺利进行，其反转录体系参考天根试剂盒（FastKing RT Kit）。
1.2.2 Ty-6基因克隆在NCBI中下载Ty-6基因CDS序列，利用Primer Premier 5软件设计用来扩增Ty-6基因CDS序列的引物，以番茄未染病前的cDNA为模板，反应体系为：上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、模板cDNA 1 μL、高保真酶7 μL以及无菌水10 μL，进行PCR扩增以及在1%琼脂糖凝胶中进行PCR产物的电泳。克隆步骤如下：（1）PCR产物切胶回收：将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段，采用天根公司的Universal DNA Purification Kit胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检测纯度，并测量溶液DNA浓度。（2）目的片段与载体连接：胶回收产物与T载体连接，参照TaKaRa公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。（3）连接产物转化E.coil DH5α：①将5 μL连接产物加入到100 μL E.coil DH5α感受态细胞中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静止1 h；②42℃水浴热激转化90 s，立即放回冰上，放置3 min；③每管加入500 μL LB培养基，37℃，180 r/min震荡培养1 h，使菌体复苏并表达抗性基因；④在含有Amp（100 μg/mL）的选择性平板上加80 μL菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀后，用Parafilm膜封好；⑤倒置培养皿培养15 h。（4）转化子的筛选及鉴定：挑选单菌落在含Amp的液体培养基中，37℃，180 r/min震荡培养12 h后，以菌液为模板进行PCR鉴定，鉴定的阳性菌液送天启公司进行测序，测序正确序列用于后期生信分析。
利用NCBI-ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线软件查找Ty-6基因的阅读框，通过ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件预测该蛋白的一级结构；ExPASy-ProtScale（https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）分析该蛋白的亲水性、松散性、蛋白相对突变型以及极性等基本理化性质[16]；二级结构的预测[17]通过法国里昂CNRS的SOPMA软件（https://blog.csdn.net/wangliang_f/article/details/22859187）；信号肽以及二硫键分别通过SignalP4.1serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和Scratch Predict Protein在线软件预测[18]；其蛋白的跨膜结构域借助TMHMM Server v. 2.0平台（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析，利用在线软件PSORTb version3.0.2（https://www.psort.org/psortb/index.html）进行亚细胞的定位[19]；磷酸化位点与糖基化位点在使用NetPhos 3. 1平台（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK）以及NetOGlyc 4. 0在线软件分析。
1.2.4 q-PCR验证通过Primer Premier5进行荧光定量PCR引物的设计，以番茄Actin为内参基因，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，每个时期样本均为3次重复，qT-PCR总体系（20 μL）：模板cDNA为3 μL、EvaGreen2×qPCR Master Mix为10 μL、引物1为0.5 μL（10 μmol/L）、引物2为0.5 μL（10 μmol/L）以及ddH2O为6 μL。其扩增步骤：95℃预变性6 min，95℃变性10 s，60℃复性30 s，进行40个循环。
1.2.5 启动子分析通过Gramene datebase（http://www.gramene.org/）下载并截取Ty-6基因转录起点上游1 kb区域，通过PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线软件进行顺式作用原件的预测分析[20]。
1.2.6 三级结构及系统发育树分析通过NCBI的在线软件CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析该蛋白功能结构域，三级结构采用SWISSMODEL平台（https://swissmodel.expasy.org/interactive/NJSqC4/models/）分析预测，应用MEGAX软件里的Clustal W程序对鉴定的核苷酸序列进行多重序列比对，比对结果采取邻近法用于系统发育树的构建，使用Poisson模式，重复次数为1 000，其他参数默认[21]。
2 结果 2.1 Ty-6基因克隆对挑选出的阳性单克隆进行菌液PCR鉴定，在1%的琼脂糖进行凝胶电泳，其电泳结果如图 1所示，除3、5及6号点样孔外，其余各孔均扩增出包含CDS区（92-1 009 bp）的全长为1 079 bp的目的条带，与预期结果一致。对其目的片段进行胶回收纯化并序列测序，用于后续序列分析及构建系统发育树。
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| 图 1 Ty-6基因克隆片段 |
结果表明Ty-6基因全长1 286 bp，共含9个开放阅读框，其中编码区只有1个，且编码区长度为918 bp（92 bp-1 009 bp）共编码305个氨基酸（图 2）。对Ty-6基因编码蛋白进行预测表明，该编码蛋白分子量为33 446.85，化学式为C1442H2363N433O460S10，其理论等电点为9.74，属于碱性蛋白，带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）37个，正电荷氨基酸残基数53个，不稳定指数达56.64，亲水性平均值为-0.737。同时蛋白的相对突变预测表明该蛋白高突变区在93-115位氨基酸间，其高极性区在168-172位氨基酸间，高松散区在100 -113位氨基酸间。
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| ATG为起始密码子；TGA为终止密码子 图 2 Ty-6基因cDNA全长及编码区翻译的氨基酸序列 |
二级结构预测（图 3）表明该蛋白只含α-螺旋、无规则卷曲以及延伸链三种结构元件，其中无规则卷曲最多，共202个氨基酸，占比为66.32%，其次是延伸链，占比17.05%，最后为α-螺旋，占比17.05%，按照Skolnick等报道的二级结构分型，该蛋白二级结构属于混合型；SignalP4.1预测结果显示该蛋白不存在信号肽，TMHMM平台以及二硫键预测显示该蛋白不含跨膜结构域，而在存在的5个Cys中，预计形成2个二硫键，其位置分别在氨基酸24-57以及162-172位间，对Ty-6基因的表达产物进行亚细胞定位预测得其蛋白主要分布在细胞质膜上。
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| 图 3 Ty-6基因编码蛋白二级结构 |
蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸（包括苏氨酸）；另一种是酪氨酸。这两类酸磷酸化的酶不一样，功能也不一样，但也有少数双功能的酶可以同时作用于这两类氨基酸，如MEK（促丝裂原活化蛋白激酶Mitogen-activated proteinkinase kinase，MAPKK）。丝氨酸磷酸化的主要作用是变构蛋白质以激活蛋白质的活力，主要是指酶活力。而酪氨酸磷酸化除了能激活该蛋白活力之外，更重要的功能是给结合蛋白提供一个结构基因，以促进其和其他蛋白质相互作用而形成多蛋白复合体。蛋白复合体的形成再进一步促进蛋白质的磷酸化。周而复始，由最初蛋白质磷酸化所产生的信号就依次如此转下去。如果最初产生的是一个刺激细胞生长的信号，此信号将最终转入细胞核，导致DNA复制和细胞分裂。该基因编码蛋白磷酸化表明该编码蛋白共含有51个磷酸化位点，分别位于丝氨酸与苏氨酸残基上，其中38个丝氨酸磷酸化位点，13个苏氨酸磷酸化位点；因此多个丝氨酸磷酸化位点在激活蛋白活力方面有重要作用。其糖基化预测显示该蛋白具39个糖基化位点。
2.2.4 启动子序列分析为进一步研究Ty-6基因的结构与功能，选取Ty-6基因上游2 000 bp进行启动子分析，同时通过在线数据库PlantCARE进行顺势作用元件预测，该基因的启动子序列除具有真核生物特有的TATA-box与CAAT-box等核心启动子元件外，还具有许多响应元件，如茉莉酸、水杨酸以及脱落酸等植物激素响应元件，也含一些玉米醇溶蛋白代谢调节、干旱诱导及厌氧诱导相关的作用元件（表 2）。
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| 图 4 磷酸化位点预测结果 |
该编码蛋白不含任何超家族结构域，将Ty-6基因编码的氨基酸序列在SWISS-MODEL软件上以3lpf.1.D为模板进行同源建模，结果如图 5所示，其三级结构模型相对复杂，其主要结构由无规卷曲构成，与二级结构预测一致。利用MEGAX软件对番茄、马铃薯、烟草及葡萄的蛋白进行同源序列比对分析，构建系统发育进化树。结果（图 6）显示，番茄、马铃薯、辣椒以及烟草同在一个分支中，且马铃薯与番茄的亲缘关系最近，其同源性高达100%，辣椒与烟草和番茄的亲缘关系次之。
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| 图 5 三级结构预测 |
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| 图 6 系统发育进化树结果 |
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| 大写字母代表 0.01水平的极显著性差异，小写字母代表 0.05水平的方差显著性差异 图 7 不同时期茎与叶中Ty-6基因的表达分析 |
由下图可知，在番茄感染黄叶卷曲病前后Ty-6基因在茎与叶中均有表达，随着染病时间的增加，其在茎与叶中的总体表达趋势表现为先增后减，同时茎中Ty-6基因在染病后30 d时表达量达到最大且显著（P < 0.01）区别于其他3个时期；叶中Ty-6基因在各个时期的表达量均存在显著差异（P < 0.01），其表达量同样在染病后30 d达到最大值，然而番茄表型在感染黄叶卷曲病前后并无明显的特征变化。
3 讨论番茄作为世界上广泛种植的蔬菜水果作物，具有极高的营养价值，然而目前番茄生产上最突出的问题就是病虫危害，尤其是TYLCV，其严重影响了番茄产量与品质。因此培育具有TYLCV抗性的新品种是当前世界番茄育种的重要目标之一，且许多显性和隐性抗病基因已被很好地鉴定和应用于各种作物的育种。研究表明Ty-1与Ty-3作为抵御TYLCV的主要抗性基因，其抗性是基于其基因组的胞嘧啶甲基化水平增加[22-23]，且两基因叠加可增强其抗病性；同时Ji等[24]和Verlaan等[25]确定了第3染色体上的Ty-4抗性位点，对单独或与ty-4联合携带ty-3的育种材料进行抗多个二分体病毒的筛选表明，两个基因组合的抗性更强。但是，尚不清楚在育种材料中是否存在除ty-4以外的其他双抗性位点。目前，Scott等[26]在育种材料Fla. 8638B、Fla. 8624和Fla. 8680中发现了新的抗性位点并指定为Ty-6，并一直努力在番茄中绘制该位点图，将Ty-6定位到10号染色体的末端，且该位点已被证明对TYLCV与二分叶番茄斑驳病毒均有抑制作用，且其抗性是针对双生病毒，而非病毒载体[27]，而对于Ty-6基因与其他抗性基因互作的抗病功能还需进一步研究。
本研究克隆了番茄Ty-6基因，生物信息学分析表明其亚细胞定位于细胞质膜上，而Ty-6作为抗病基因，其编码蛋白可能是一种表面抗原蛋白，能够和特异的抗体结合，从而抵制TYLCV；启动子作为关键的调控基因表达的DNA序列，在转录起始时发挥着重要作用，同时启动子的多少直接影响下游基因转录的效率，而TATA-box作为关键的顺式作用元件，决定着转录起始位点及其起始频率，是大多数真核基因正确表达所必需的[28]，该基因启动子区具有63个TATA-box，且含多个光响应、茉莉酸、水杨酸以及脱落酸等诱导Ty-6基因表达的元件[29-30]，因此该基因存在强启动子区域；系统发育树结果显示其与马铃薯的亲缘关系最近，说明番茄与马铃薯的Ty-6基因可能源于共同的祖先基因，也可能因进化程度不同，其在各物种中的表达模式不同；Ty-6作为抗病基因，已被证明对二分叶番茄斑驳病毒具明显的抗性[31]，而在抵御TYLCV中的作用还有待进一步探究。而q-PCR结果显示番茄感染黄叶卷曲病毒后叶片中Ty-6的表达发生明显变化，说明该基因在抗病防御过程中发挥着关键的作用，而该基因在感染黄叶卷曲病后其在叶中的表达量明显高于茎中，可能该基因具有组织表达特异性，同时接种病毒前后感病症状基本无明显变化，这可能是该基因起主要作用，也可能是该基因与其它抗性基因相互作用从而抵御外界干扰，其与其它基因并无上位效应，而该基因在抵御病毒过程中与其它抗病基因相互独立作用的研究已有报道[32]，因此今后将多个抗病基因导入到同一番茄品种是个不错的切入点。
4 结论通过克隆得到番茄Ty-6基因，利用生物信息对该基因编码产物进行一级、二级、三级结构以及基本理化性质的分析，同时通过q-PCR技术研究Ty-6基因在番茄染病后不同时期的表达量。结果表明：Ty-6基因开放阅读框918 bp，共编码305个氨基酸，属于一种碱性蛋白；其二级结构以无规则卷曲为主，预测蛋白定位于细胞质膜上；且含有51个磷酸化位点与39个糖基化位点；启动子区主要以TATA-box为主，且含有多个诱导基因表达的元件；三级结构相对简单，其系统发育树得番茄与马铃薯的亲缘关系最近；q-PCR显示该基因在感染病毒后叶中的表达量明显高于对照，且具组织表达特异性，同时表型鉴定结果也显示在Ty-6基因表达高时其感病效果不明显，因此该基因研究不仅扩展了育种者可用的Ty基因工具包，也提供了一种抗病的可行思路。
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