猪瘟（Classical swine fever，CSF）是一种由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的高度接触性传染病，对全球范围内的养猪业造成巨大经济损失^[1-2]。《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中将其列为5种优先防治的动物疫病之一^[3]。当前CSF防治的主要手段是疫苗接种，其中中国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在中国乃至世界范围内CSF的防控起到了积极作用^[4]。CSFV基因组编码4个结构蛋白（N^pro、N^rns、E1和E2）和8个非结构蛋白（C、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）^[5-6]。E2是CSFV最重要的具有免疫原性的蛋白之一，诱导机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染，是研究新型基因工程疫苗和血清学抗体检测方法的首选靶蛋白^[7-10]。蔺辉星等^[11]以原核表达的E2蛋白建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，其敏感性、特异性和符合率分别为89.07%、77.59%和84.65%。肖丽等^[12]通过液相芯片新技术分别以原核表达CSFV E2蛋白和PCV2 Cap蛋白，与荧光微球偶联建立了一种同时检测CSFV、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）抗体的方法临床样品符合率分别是90.48%、60.32%。袁莉等^[13]利用重组抗原E2、N^rns和C蛋白建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法，可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点，从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。

本研究基于镧系元素Eu微球标记技术建立了一种CSFV抗体检测的免疫层析方法，结合荧光分析仪，可以快速方便的对猪场的血清样品进行检测，无需大型昂贵的仪器。解决了中小型养殖场实验室简陋问题，可广泛的应用于猪场中CSFV抗体的监测。

1 材料与方法 1.1 材料

CSFV E2抗原由中国兽医药品监察所表达纯化后提供；鼠IgG、羊抗鼠IgG购自于杭州隆基公司；Eu纳米微球购自于Bangs公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自于赛默飞世尔科技有限公司；活化缓冲液：50 mmol/L MES用NaOH调pH为6.0；偶联缓冲液：50 mmol/L HEPES用NaOH调pH为8.0；封闭液：用水溶解酪蛋白钠，终浓度为5%；样本处理液：0.1 mol/L Tris、0.1% Casein、0.1% Tween-20用盐酸调pH到7.4；P：CSFV抗体阳性猪血清；N：CSFV抗体阴性猪血清；猪瘟阳性血清国家参考品购自中国兽医药品监察所，细胞中和效价为1:（2 138±2）。猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒购自于北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。CSFV强阳性样本（CV1），CSFV中阳性样本（CV2），CSFV弱阳性样本（CV3）。

AFS-1000干式荧光分析仪（广州蓝勃公司）；XL-2120超声波清洗仪（北京协力共创公司）；D-37520osterode高速台式冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；XYZ30600128划膜仪（Biodot公司）；ZQ400斩切机（购自于上海金标公司）；硝酸纤维素膜（Sartorius公司）；玻璃纤维、吸水纸、PVC板（上海杰一生物有限公司）。

1.2 方法 1.2.1 试纸条的制备 1.2.1.1 微球标记

（1）用500 μL活化缓冲液洗涤10 μL（0.1 mg）微球溶液1次，离心，去上清；取出EDC放室温（要扭紧盖子）；（2）分别用250 μL活化缓冲液洗涤重悬颗粒，超声1 min，务必使微球充分悬浮；（3）分别加入250 μL含0.005 mg EDC的活化缓冲液，使终体积均为500 μL；（4）室温下（18-25℃）持续混匀反应25 min，离心；（5）分别用偶联缓冲液洗涤2次，离心，去上清；重悬于250 μL偶联缓冲液中，充分悬浮；（6）加入250 μL的抗原-偶联缓冲液，立即轻轻上下混匀；（7）室温下持续混匀反应3 h，离心，去上清；（8）分别加入500 μL封闭液，洗涤2次，沉淀用500 μL封闭液重悬，超声1 min，室温下持续混匀反应过夜，离心，去上清；加入500 μL保存液，洗涤2次，用500 μL保存液重悬，超声1 min；（9）保存在2-8℃冰箱备用。

1.2.1.2 NC膜制备

将划线抗原用含1%蔗糖，pH=8的5 mmol/L硼酸缓冲液稀释，羊抗鼠IgG抗体用含1%蔗糖，pH8的5 mmol/L硼酸缓冲液稀释为1.5 mg/mL。用喷膜仪以50 mm/s的速度、1 μL/cm的浓度，在室内环境中，分别将划线抗原、羊抗鼠IgG抗体喷在NC膜（2.5 cm×30 cm）的T线、C线位置，37℃烘箱中烘干2 h备用。

1.2.1.3 结合垫的制备

以聚脂纤维膜（1 cm×2.5 cm）作为结合垫材料，用结合垫处理缓冲液浸湿，37℃烘箱中烘干后将自制的荧光微球-标记抗原复合物溶液用喷膜仪以50 mm/s、6 μL/cm的浓度喷于结合垫上，37℃烘箱中烘干3 h备用。

1.2.1.4 样品垫的制备

以玻璃纤维素膜（1.5 cm×30 cm）作为样品垫材料，用样品处理缓冲液浸湿，37℃烘箱中烘干4 h备用。

1.2.1.5 吸水纸的剪切

剪好1.5 cm×30 cm的吸水纸，备用。

1.2.1.6 检测试纸的组装

组装环境要求：常温，湿度低于30%。根据上述步骤制备的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸依照图 1所示的重叠关系将其依次贴在带有粘合剂的PVC底板（8 cm×30 cm）上，具体为：将NC膜非点样面粘贴于PVC底板；荧光垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜1 mm；吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2 mm；样品垫粘贴在荧光垫的上方，覆盖荧光垫2 mm；在斩切机中将粘贴好的检测板剪切成4 mm宽的试纸条，装在试纸条外壳中，制成带有结果观察窗和加样口的检测卡。用AFS-1000荧光分析仪检测荧光信号，记录T/C读值（图 1）。

1.2.2 试纸条反应体系优化 1.2.2.1 结合垫复溶浓度的优化

按照1.2.1标记抗原，纳米微球标记好的抗原用结合垫处理液复溶，复溶浓度选择2、4、6、8、10倍复溶，喷膜仪以50 mm/s、6 μL/cm的浓度喷于结合垫上，37℃烘箱中烘干3 h备用。然后组装成试纸条检测临床样本，依据荧光信号值、P/N比值确定合适的复溶浓度。

1.2.2.2 包被浓度优化

包被抗原含量优化：将划线抗原用含1%蔗糖，pH=8的5 mmol/L硼酸缓冲液稀释为0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL，羊抗鼠IgG抗体用含1%蔗糖，pH=8的5 mmol/L硼酸缓冲液稀释为1 mg/mL。用喷膜仪以50 mm/s的速度、1 μL/cm的浓度，在室内湿度为45%-65%的条件下，分别将划线抗体、羊抗鼠IgG抗体喷在NC膜（2.5 cm×30 cm）的T线、C线位置，37℃烘箱中烘干2 h备用。

1.2.2.3 反应时间优化

加样后5 min、8 min、10 min、13 min、15 min、20 min、25 min、30 min读取数据，绘制时间曲线，以P/N、读数稳定且时间最短为优，确定加样反应时间。

1.2.3 性能评价 1.2.3.1 敏感性试验

对猪瘟阳性血清国家参考品按照1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256进行稀释，记录结果。

1.2.3.2 特异性试验

与猪繁殖与呼吸综合征病、猪I型疱疹病毒、猪口蹄疫病、猪圆环2型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等阳性血清进行交叉反应试验。

1.2.3.3 重复性试验

对CSFV抗体阳性样本P连续加样10次，计算试纸条变异系数（CV）。

1.2.3.4 临床评价

采用试纸条、猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒（Anheal-ELISA）以及荧光抗体中和试验（FVNT）同时检测131份猪血清，计算试纸条与Anheal-ELISA和FVNT符合率。

2 结果 2.1 试纸条反应体系的优化 2.1.1 结合垫复溶浓度的优化

从图 2中可以看出在复溶度稀释6倍的时候，T/C比值较高，P/N比值最大。因此选择复溶度为6倍时稀释度最佳。

2.1.2 包被浓度优化

从下图 3中可以看出，在T线浓度为0.1 mg/mL时，P/N比值最大。因此T线浓度选择0.1 mg/mL为最佳浓度。

2.1.3 反应时间优化

从图 4可以看出在15-20 min时，T/C比值变化不大，13 min以后P/N比值逐渐降低，综合考虑选择检测时间为15 min。

2.2 性能评价 2.2.1 敏感性

以T/C≥0.1时为阳性，将猪瘟阳性血清国家参考品按照倍比稀释到128倍仍为阳性，如图 5。

2.2.2 特异性

从图 6可以看出猪瘟阴性血清的测定值与猪繁殖与呼吸综合征病、猪I型疱疹病毒、猪口蹄疫病、猪圆环2型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等阳性血清测定值小于0.1。故本方法针对这7种动物疫病阳性血清无交叉反应。

2.2.3 重复性

从表 1中看出，CSFV抗体荧光试纸条批内和批间CV均小于10%。

2.2.4 临床评价

从表 2中可以看出试纸条与FVNT的阴性符合率为100%，阳性符合率为93%，总符合率为98.5%。从表 3中可得出试纸条与Aheal-ELISA的阴性符合为100%，阳性符合率为90%，总符合率为97.7%。

阳性符合率=26/（26+2）×100%=93%

阴性符合率=103/（103+0）×100%=100%

总符合率=（103+26）/131×100%=98.5%

阳性符合率=26/（26+3）×100%=90%

阴性符合率=102/（102+0）×100%=100%

总符合率=（102+26）/131×100%=97.7%

3 讨论

猪瘟是一种高度传染性疫病，是威胁养猪业的主要传染病之一^[14-15]。急性型猪瘟呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死；慢性型猪瘟呈纤维素性坏死性肠炎。目前主要通过扑杀与疫苗预防接种相结合等手段，北美、加拿大、新西兰等很多国家已成功实现猪瘟净化，但在中国猪瘟仍是严重危害养猪业的重大传染病之一，存在不间断流行^[16]。CSFV为有囊膜、直径40-60 nm、单股正链RNA病毒^[17]。目前已经定位的CSFV蛋白有5种，即N^pro、C、N^rns（E0）、E1和E2。它们均由CSFV的RNA-ORF 5'一端所编码。在结构蛋白中，最具有免疫研究价值的是N^rns和E^{[9, 18-19]}。E2蛋白是CSFV主要的抗原蛋白，可诱导猪机体产生病毒中和抗体，从而预防集落刺激因子（Colony stimulating factor，CSF）^[20]。

目前市场上猪瘟抗体的检测方法，以酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析技术的方法为主。商品化的猪瘟抗体酶联免疫吸附试验检测试剂主要厂家有IDEXX、Biocheck等，酶联免疫吸附试验的方法需要专业的设备，对人员的操作技能要求比较高，不利于在基层开展工作。商品化的猪瘟抗体胶体金检测试剂的厂家有北京世纪元亨、武汉科前等，胶体金的方法不可以准确的定量，且灵敏度不高，准确性差。而时间分辨荧光分析法是一种新型的非放射性微量分析技术^[21]。它是目前最灵敏的微量分析技术之一，其灵敏度高达10-12 g/mL，较胶体金法（Colloidal gold immunoassay，GIA）高出3个数量级^[22]。本技术利用镧系微球通过共价偶联标记抗原或抗体，相对物理偶联，化学偶联更加结实，不易脱落。用荧光分析仪测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。本技术除满足了高灵敏检测的需求，同时也不需要复杂的设备，操作简单方便，符合基层的工作情景。在市场上，并没有发现具有农业部备案的商品化猪瘟病毒抗体荧光检测试剂。因此本文建立的猪瘟抗体的荧光检测方法具有一定的技术优势。

冯春花等^[23]利用E2建立了一种猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法，该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪I型疱疹病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）阳性血清均无交叉反应；随机检测80份猪血清样品，与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%、阴性符合率为76.92%，总体符合率为80.25%。本研究的试纸条测定临床血清阳性符合为90%、阴性符合率为100%，总符合率为98%。本试纸研制采用双抗原夹心的方法，利用常用的Eu微球作为标记物，对E2抗原进行共价耦合连接标记，在NC膜上包被真核表达的猪瘟E2抗原，经优化最终确定包被浓度为0.1 mg/mL，复溶浓度为6倍稀释，检测时间为15 min。通过对试纸条的性能评价可以得出，猪瘟抗体荧光检测试纸条的敏感性为猪瘟阳性血清国家参考品稀释128倍仍可以检测到，对常见的猪繁殖与呼吸综合征病、猪I型疱疹病毒病、猪口蹄疫病、猪圆环、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等疾病抗体阳性血清无交叉反应，批内和批内的变异系数均小于10%，试纸条与Anheal-ELISA的阴性符合为100%，阳性符合率为90%，总符合率为97.7%。试纸条与FVNT的阴性符合率为100%，阳性符合率为93%，总符合率为98.5%。

4 结论

基于镧系元素Eu微球标记技术，经一系列反应体系的优化，建立了一种猪瘟病毒抗体检测的免疫层析方法，并经对试纸条灵敏度、特异性、重复性等性能指标的优化，结果满足试剂性能要求，表明可广泛的用于猪场中猪瘟病毒抗体的免疫评估，辅助进行疫苗免疫策略的调整，建立合理的免疫程序。