2. 南京农业大学农学院，南京 210095
2. College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095
多胺（Polyamines，PAs）是一类广泛存在于生物体内的具有较强生物活性的小分子脂肪族含氮碱，常见的多胺种类有腐胺（Putrescine，Put）、亚精胺（Spermidine，Spd）、精胺（Spermine，Spm）和尸胺（Cadaverine，Cad）等。此外，高亚精胺（Homospermidine，Hspd）、高精胺（Homospermine，Hspm）、降亚精胺（Norspermidine，Nspd）和降精胺（Norspermine，Nspm）等稀有多胺也陆续被发现。已有许多研究表明，多胺在植物正常生长、发育、逆境应答等众多生理过程中发挥重要作用[1-6]。在生理pH环境下，多胺极易与核酸和酸性蛋白质相结合，参与转录、翻译和物质的跨膜转运过程的调控[4, 7-10]。多胺的积累往往与植物抵抗逆境的能力成正相关。逆境胁迫下，植物多胺的含量和多胺合成酶的活性显著上升，抗逆性增强。因此，在农业生产中常通过外源施加多胺来提高植物对干旱、高盐、低温等逆境的抵抗能力[11-13]。此外，多胺在植物体内还起着类似于cAMP“第二信使”的作用，通过与NO、γ-氨基丁酸、脯氨酸和植物激素等物质相互作用来促进植物生长、发育，增强逆境适应能力[14-16]。
在生物体内，多胺的合成起始于腐胺的生物合成，因此腐胺的合成对生物体内源多胺的合成至关重要。根据合成起始物的不同，腐胺的生物合成途径分为鸟氨酸途径和精氨酸途径[17]。鸟氨酸途径是一个单反应过程，前体鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）的作用下脱羧直接生成腐胺；精氨酸途径则以精氨酸为前体在精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）的作用下脱羧生成鲱精胺（Agmatine，AGM），AGM相继经鲱精胺亚胺水解酶（Agmatine iminohydrolase，AIH）和N-氨甲酰腐胺-酰胺水解酶（N-carbamoylputrescine amidohydrolase，CPA）作用最终生成Put。已发现有些植物（如拟南芥、小立碗藓）由于ODC基因的缺失使得精氨酸途径成为其腐胺合成的唯一途径[18]。作为精氨酸途径中3个酶之一，AIH基因或蛋白已在玉米、小麦、大豆和拟南芥等植物中克隆或纯化，关于该酶结构特征的研究也部分报道[19-22]。
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属于大戟科乔木，是目前唯一大面积商业化种植用于生产天然橡胶的产胶植物。在生产中，通过割胶切断树皮中次生乳管从而使胶乳流出获得天然橡胶的原始材料。巴西橡胶树胶乳中主要含有Put、Spd和Spm三种多胺，且以Put为主；割面上的Put和PAs总含量高于非割面，割面上离割口越近Put含量越高，其生物合成越活跃，而非割面上的Put及其它多胺垂直变化不大[23]。这些结果说明Put可能是橡胶树胶乳中的重要多胺，对调节橡胶树橡胶生物合成和胶乳再生具有重要作用。巴西橡胶树中多个多胺合成途径基因已相继报道，但对AIH基因了解甚少[24-25]。本研究克隆了巴西橡胶树AIH基因并对其进行生物信息学及表达特性分析，旨在为进一步丰富和完善多胺在巴西橡胶树中的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料本文试验材料为巴西橡胶树品系热研-73397，叶、茎尖、雄花、雌花、健康及死皮橡胶树胶乳和树皮等组织样品均采自中国热带农业科学院试验农场开割橡胶树，叶片不同发育阶段样品采自国家橡胶树种质资源圃。每样品取3个生物学重复，每重复选3株橡胶树。样品采集后用液氮速冻，-80℃保存。
低温、干旱、高盐等非生物胁迫处理材料为移栽培养6个月的热研-73397组培苗。低温处理在4℃人工气候箱中进行；干旱和高盐胁迫处理参照刘辉等[26]方法，分别用30% PEG 6000和1 mol/L NaCl溶液模拟干旱和高盐环境。各处理于设定时间点采集第2和3片叶，以未处理正常植株作对照。以上各处理每时间点均设3次生物学重复，每重复5株组培苗。样品采集后液氮速冻，-80℃保存，用于RNA提取。
过氧化氢（H2O2）、乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）等处理材料为达到开割标准的未开割橡胶树品系热研-73397。H2O2处理分别参照Tang等[27]和Zhu等[28]方法，乙烯利和MeJA处理参照Hao等[29]方法，以不作任何处理的未开割树为对照。每处理每时间点均设3个生物学重复，每重复5棵树。各处理于设定时间点采集胶乳，液氮冻存，用于RNA提取。
1.2 方法 1.2.1 RNA提取及cDNA合成用植物通用总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）说明书提取橡胶树RNA，采用DNase Ⅰ（Fermentas）去除RNA中的DNA。利用PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）反转录合成第一链cDNA。
1.2.2 HbAIH的克隆3'-RACE（rapid amplification of cDNA ends）采用SMARTerTM RACE cDNA Ampli-fication Kit（Clontech，USA）试剂盒进行。3'-RACE所用引物为5'- CACCAAACACAAGACTTGCTG-3'和5'-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3'。按照试剂盒说明用3'-RACE CDS Primer A对1 μg各组织混合RNA进行反转录，以获得的cDNA为模板用PrimeSTAR Max Premix（TaKaRa，Dalian，China）进行3'端序列的扩增。将获得的3'端序列与转录组中获得的unigene序列进行拼接，并设计全长cDNA扩增引物，进行PCR扩增验证。
1.2.3 HbAIH生物信息学分析利用ORF finder预测开放阅读框；用在线程序Smart（http://smart.emblheidelb erg.de/）和InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）对蛋白保守结构域进行分析；用Expasy网站的ProtParam程序（http://web.expasy.or g/protparam/）分析蛋白质分子量、等电点、氨基酸组成等理化性质；用NCBI中的BLAST和DNASTAR软件进行同源性分析；信号肽预测用SignalP 4.1 Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），采用程序TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk- /services/ TMHMM/）预测跨膜结构域。用ClustalX和MEGA6.0进行多序列比对和Neighbor-Joining进化树的构建，多序列比对显色用ESPript工具完成[30]。
1.2.4 实时荧光定量PCR分析根据测序结果设计HbAIH基因实时荧光定量PCR引物，正、反向引物序列分别为5'-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3'和5'-GCTCTAGACCAAGCTACTAG-3'。选择巴西橡胶树HbUBC4作为内参基因，正、反向引物序列分别为5'- TCACCCTGAACCTGATAGCC-3'和5'- TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3'。根据SYBR Green Ⅰ Master Mix试剂盒说明书qPCR反应体系如下：SYBR® Premix Ex TaqTM（2×）（TaKaRa）10 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL，补ddH2O至20 μL。每样品设置3次重复。qPCR在Bio-Rad CFX96 qPCR仪进行，程序设置为：95℃预变性5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环后进行熔解曲线分析，以确定引物的特异性。基因相对表达量采用公式2-ΔΔCt计算。
2 结果 2.1 HbAIH的克隆及序列特征通过对巴西橡胶树转录组测序结果分析，获得了一条与植物AIH基因序列高度同源的unigenes。利用RT-PCR和3'-RACE技术获得了该序列完整开放阅读框（ORF，open reading frame）和全部3'端序列（图 1）。序列分析结果表明，扩增获得的基因全长1 462 bp，ORF长为1 137 bp，编码378个氨基酸。同源序列比对结果表明，该蛋白与木薯、蓖麻、麻风树、毛果杨等AIH蛋白序列一致性较高，故将该基因命名为HbAIH。
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| 图 1 HbAIH cDNA序列及其推导的氨基酸序列 |
预测HbAIH分子量为42.28 kD，理论等电点为5.09。不稳定系数为39.09，为稳定蛋白。信号肽预测结果表明，HbAIH不含有信号肽，为胞内蛋白。疏水性分析表明，该蛋白亲水性氨基酸为152个，占40.21%；疏水性氨基酸为167个，占44.18%，平均疏水系数为-0.411，为亲水性蛋白。氨基酸组成中带有负电荷的氨基酸（Asp+Glu）共有51个，占13.49%；带有正电荷的氨基酸（Arg+Lys）共有35个，占9.26%。跨膜结构域预测结果表明，HbAIH不含跨膜结构域，为非膜蛋白。
2.2 HbAIH基因结构分析将HbAIH cDNA序列在橡胶树热研-73397基因组数据中进行比对，获得HbAIH基因组序列，序列全长8 446 bp。编码区含有10个外显子和9个内含子（图 2），外显子长度介于56-233 bp，内含子长度介于95-1 799 bp之间。所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。利用GSDS 2.0在线工具分析了橡胶树、木薯、麻风树、蓖麻、可可、拟南芥和玉米等的AIH基因结构，结果表明这些植物AIH具有相同的外显子/内含子组织形式，都由10个外显子和9个内含子组成（图 2）。
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| 图 2 HbAIH及其他植物AIH基因结构示意图 |
将HbAIH与其它物种AIH基因的氨基酸序列进行同源序列比对，结果（图 3）表明HbAIH与木薯MeAIH氨基酸序列一致性最高，达90.74%。其次是大戟科的蓖麻RcAIH和麻风树JcAIH，一致性分别是87.57%和85.57%。与原核生物粪链球菌EfAIH和变形链球菌SmAIH氨基酸序列一致性最低，分别为43.57%和45.34%。利用在线程序SOPMA对HbAIH进行二级结构预测。结果表明HbAIH二级结构以无规则卷曲为主要构成元件，占42.86%；其次是α-螺旋和被β片层结构，占比例分别为26.19%和22.75%；β-转角结构最少，仅占8%。
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| 图 3 HbAIH与其它AIH多序列比对及二级结构预测 |
在橡胶树与与其他物种AIH氨基酸同源比对分析的基础上，利用NJ法进行了分子进化树聚类分析。如图 4所示，巴西橡胶树HbAIH与木薯MeAIH、麻风树JcAIH位于同一进化分枝，亲缘关系最近，而其它植物AIHs亲缘关系较远；细菌AIHs单独聚类为一大枝。
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| 图 4 HbAIH与其它物种AIHs蛋白序列聚类分析 |
组织表达谱分析结果表明，HbAIH在巴西橡胶树茎尖、胶乳、叶、树皮、雌花、雄花等各组织中均有表达，其中，在雌花中表达量最高，雄花中表达量最低（图 5-A）。比较健康和死皮橡胶树中表达差异发现，HbAIH基因在胶乳中的表达量高于树皮，且在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量均高于健康树（图 5-B）。在叶片不同发育阶段，HbAIH基因的表达也存在差异，其中，在淡绿期表达量最高，接下来依次是变色期、衰老期、古铜期，稳定期表达量最低（图 5-C）。
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| 图 5 HbAIH在巴西橡胶树不同组织（A）、健康及死皮橡胶树胶乳和树皮（B）及叶片不同发育时期（C）表达模式 |
胶乳中HbAIH表达受H2O2、乙烯利和MeJA调控。H2O2处理抑制HbAIH表达，处理6 h HbAIH表达水平显著低于处理前，24 h达到最低，48 h略有升高但仍低于处理前水平（图 6-A）。乙烯利处理前8 h，HbAIH表达水平持续下降，处理24、48和72 h该基因表达水平基本一致但仍低于处理前（图 6-B）。MeJA处理下，胶乳中HbAIH的表达呈下降-上升-下降波浪式变化，处理4 h该基因表达量最低，24 h该基因的相对表达量达到最高（为处理前1.5倍），此后该基因的表达量开始下降，至48 h恢复到处理前水平（图 6-C）。
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| 图 6 不同处理条件下HbAIH的表达模式 |
叶片中HbAIH的表达也受低温、干旱和高盐的影响。低温胁迫下，HbAIH的表达呈现出波浪形变化，处理3 h该基因相对表达量降低，然后开始升高，处理24 h该基因相对表达量达到最高值，为处理前的1.4倍，然后又开始下降，处理48 h基本恢复处理前水平（图 6-D）。PEG模拟干旱胁迫3 h，叶片中HbAIH表达量高于处理前，为处理前的1.3倍；此后，该基因表达开始下降，处理48 h恢复处理前水平（图 6-E）。高盐胁迫3 h，叶片中HbAIH表达基本没有变化；随后，HbAIH的表达快速升高，胁迫48 h时该基因的表达量达到最高，为处理前的3倍（图 6-F）。
3 讨论真核生物中仅植物能够通过精氨酸途径合成腐胺，AIH是该途径中的第二个酶。根据结构分类，AIH属于戊烷超家族中的卟啉单胞菌型肽基精氨酸脱氨酶家族成员，具有该家族特有的以5个αββαβ重复单元组成的螺旋桨式结构特征[31-32]。研究表明，AIH是一个同源二聚体蛋白，且参与2个亚基间氢键形成的氨基酸高度保守[20, 22, 33]。本研究克隆获得了巴西橡胶树AIH基因HbAIH，该基因序列全长1 462 bp，ORF序列长1 137 bp，编码378个氨基酸。生物信息学分析表明，HbAIH为亲水性蛋白，不含跨膜结构域和信号肽。蛋白序列比对分析结果表明，酶活性位点形成和参与底物结合的11个氨基酸在HbAIH及其他植物AIH氨基酸高度保守。氨基酸相似性分析及系统进化分析结果表明HbAIH与大戟科木薯MeAIH和麻风树JcAIH等的相似性最高，预示着它们亲缘关系较近，这与植物学传统分类一致。
组织表达谱表明HbAIH表达无组织特异性，在本研究所检测的橡胶树6个组织中均有表达但表达量具有差异。HbAIH在雌花中表达量最高而在雄花中表达量最低，推测HbAIH可能与橡胶树雌花发育有关。此外，不同发育阶段叶片中HbAIH的表达也存在一定差异。死皮和健康橡胶树胶乳和树皮表达结果表明，HbAIH在死皮橡胶树胶乳和树皮中表达均有上调。橡胶树死皮是割面部分或全部不排胶的现象，这暗示HbAIH可能参与橡胶树死皮发生和胶乳再生的分子调控过程。乙烯利（Ethephon，ET）在天然橡胶生产中常用于刺激胶乳合成和排胶，具有明显的增产效果[34]；茉莉酸是乳管分化和发育的重要调节因子，可以诱导橡胶树乳管分化，调节橡胶生物合成[29, 35-36]。本研究发现，乙烯利和茉莉酸甲酯处理后HbAIH表达存在波动，但整体呈下调趋势，暗示其可能负向调控橡胶树ET反应和产排胶过程。
我国属于非传统植胶区，橡胶树生长周期内经常遭受季节性干旱、低温、台风等逆境的影响，这些逆境因子严重制约着巴西橡胶树的胶乳产量和质量。本研究发现低温、干旱、高盐等逆境胁迫下，HbAIH的表达有不同程度上调，表明该基因可能参与了巴西橡胶树逆境响应过程。过氧化氢诱导的氧化胁迫下，HbAIH的表达明显下调，表明该基因可能负向调控巴西橡胶树氧化胁迫应答。
4 结论从巴西橡胶树中克隆获得HbAIH，其开放阅读框1 137bp，编码378个氨基酸，预测其是一个亲水性蛋白。HbAIH表达无组织特异性，在检测的组织中均有表达。HbAIH可能参与巴西橡胶树叶片生长发育、逆境应答等过程，并可能参与橡胶树死皮发生和胶乳再生的调控。
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