细胞内稳定的pH微环境可以保证植物在生物和非生物胁迫下进行正常的生命活动和生长发育^[1]。植物正常生长发育细胞内精准的pH调控不仅调节酶活性和细胞代谢活动，还调节细胞生长、DNA复制、RNA和蛋白合成等生理活动^[2-4]。植物根毛的形成与细胞内pH变化密切相关，根毛形成过程中，首先根毛起始发生部位细胞壁酸化，当酸化过程停止，根毛起始过程结束，顶端开始生长，且细胞壁酸化的同时，胞质pH发生改变^[5-6]。拟南芥中研究成果表明，生长素是通过质外体pH调节促进根细胞扩张^[7]。另外，气孔的开闭过程中，保卫细胞内的pH存在相应的变化，气孔打开过程中保卫细胞胞质pH降低，气孔关闭过程中保卫细胞胞质pH升高^{[2, 8]}。研究发现细胞内pH调控系统是植物在长期进化过程中获得的抗逆机制，强化细胞pH调控能力可提高植物抗性^[9-11]。在环境科学研究中，可以通过测定树叶汁液的pH来研究树种抗毒气污染能力，从而进行绿化树种的选择^[12-13]。如植物抗氟能力是由叶片细胞的pH值和等电点的差值，即“耐酸力”决定的^[14]。越来越多的证据表明，pH的变化在植物细胞中扮演者第二信使或信号的角色^[15-17]。

细胞内的囊泡运输既是生命活动的基本过程，又是一个极其复杂的动态生物学过程，伴随整个生长发育阶段。囊泡运输包含出芽、运输、锚定和融合等过程，涉及到多种调控因子和蛋白质。研究表明，动物细胞内的囊泡运输出现障碍会导致细胞功能紊乱和许多重大疾病的发生^[18]。植物细胞膜上的各种功能蛋白、细胞壁合成所需的各种酶类及元件、细胞外分泌蛋白及物质都由细胞内囊泡运输完成。植物细胞囊泡运输在植物营养、应对环境胁迫、光响应、激素转运及信号响应和特异性防御响应等过程中发挥重要作用^[19-20]。植物内有多条囊泡运输途径，很多结构蛋白和调控蛋白参与到这些途径中，通过影响囊泡运输调控植物生长发育^[21-26]。

Na⁺，K⁺/H⁺反向转运体（NHX）属于一价阳离子/H⁺反向转运体（Cation/proton antiporter，CPA）基因家族中的CPA1亚家族，它们广泛存在于植物、动物、酵母和细菌等生物体内。植物NHX常以多基因家族形式存在，并在细胞内广泛分布。根据亚细胞分布，植物NHX基因家族成员分为质膜NHX（Plasma membrane NHX），液胞NHX（Vacuolar NHX）和内膜NHX（Endosomal NHX）3类。植物NHX最先由Ratner从大麦质膜上发现，此后在甜菜贮藏组织中检测到液胞NHX活性^[27-28]，但第一个被克隆到的植物NHX成员是拟南芥AtNHX1^[29]，后续大量植物NHX基因被鉴定、克隆。植物NHX的离子转运驱动力由质膜H⁺-ATPase（P-ATPase）、液胞膜H⁺-ATPase（V-ATPase）和H⁺-PPiase产生的H⁺电化学势梯度提供^[30-32]。大量研究表明，维持细胞内pH、离子稳态及胞内正常的囊泡运输对细胞活动及功能至关重要，而植物NHX是植物体内重要跨膜反向转运蛋白，对维持pH、离子平衡及囊泡运输具有重要作用，并在细胞各种生理生化过程中担当重要角色，包括渗透调节、逆境响应及细胞生长等生理生化过程^[33-39]。本文综述了植物NHX在pH平衡、囊泡运输方面的研究进展。

1 植物NHX调节胞内pH平衡

真核生物细胞被生物膜区分为很多区室，各区室的pH并不是均一的，而是存在差异。pHluorin作为一类pH敏感的荧光蛋白，在不同的pH条件下，其激发光谱和发射光谱将会发生变化，可以反映其所在区域的H⁺浓度，将pHluorin与特异定位的蛋白融合并进行表达，就能对不同亚细胞结构内的pH进行测定^[40]。对植物细胞器和膜微囊的pH测定表明，膜微囊运输的分泌途径中各细胞器区室内的pH存在差异，总体上从内质网（ER）到液胞表现为一个逐渐酸化的体系，但也有大量报道称反面高尔基体管网状状结构（TGN）内的pH比液胞前体（PVC）的低^{[33, 41-45]}，这些进展为NHX在pH调节中的作用研究奠定了基础。

植物NHX家族成员分布在质膜、液胞膜和内膜系统上，且介导Na⁺，K⁺与H⁺的跨膜反向转运，那么NHX在介导离子转运过程中对胞内各区室的pH稳定有怎样的作用呢？酿酒酵母中ScNHX1基因缺失后液胞和胞质的pH明显降低，突变体菌株对酸性pH的耐受性减弱^[46-47]。拟南芥中质膜AtNHX7/SOS1缺失将导致胞质和液胞的pH降低，影响pH动态平衡^[48-50]。植物液胞NHXs也与胞内pH动态平衡有密切关系。牵牛花的花色变化是由液胞内pH的改变实现的，牵牛花液胞pH为6.5时花为红色，液胞pH为7.5时花为蓝色，而InNHX1基因突变后花色改变受阻，进一步研究发现，引起牵牛花花色改变的pH变化是由增强InNHX1、V-ATPase和H⁺-ATPase的表达和活性实现的^[51-53]。拟南芥nhx1 nhx2双突变体的研究发现AtNHX1和AtNHX2基因缺失将导致根伸长区、成熟区细胞和胚轴细胞液胞pH显著降低，对根尖细胞液胞pH没影响^[45]。进一步对拟南芥其它液胞NHXs研究发现，单独敲除AtNHX1或AtNHX2基因不能改变根细胞液胞的pH，即使敲除AtNHX1或AtNHX2基因的同时再敲除AtNHX3和AtNHX4基因，也不能明显改变根细胞液胞pH^[54]，这些结果表明，AtNHX1和AtNHX2有功能冗余，这在氨基酸序列上也得到了体现，它们的相似度达到87.5%，同时证实在拟南芥液胞NHXs成员中，主要调节pH的为AtNHX1和AtNHX2，并不是所有成员都具有显著作用。Andres等^[8]发现，AtNHX1和AtNHX2调节气孔开闭过程中，可以有效地调控液胞pH。另外有报道显示，烟草HbNHX1基因过表达可以使叶片表皮液胞pH升高，沉默使pH降低，表明其对维持pH平衡具有调节作用^[55]。这些研究表明，在植物中质膜和部分液胞NHXs参与胞内各区室的pH调节，从而使pH微环境向植物生长有利方面改变。

内膜NHXs定位在ER、高尔基（Golgi）、TGN和PVC等内膜系统的膜结构上，其功能研究相对滞后。Martinier等^[41]将拟南芥内膜NHXs转入烟草细胞发现，转基因烟草细胞的液泡分选受体（Vacuolar sorting receptor，VSR）、TGN及PVC等的pH升高，证明了内膜NHXs参与调节内膜系统内各区室的pH稳态。Reguera等^[39]构建了nhx5 nhx6双突变材料，并利用pHluorin与特异定位的蛋白对VSR、Golgi、TGN和LPVC内的pH进行了测定，结果发现nhx5 nhx6双突变植株内这些区室的pH与野生型相比都显著降低。同时，Wang（王立光）等^[35]利用微电极法和pH敏感的荧光探针BCEFF测定了nhx5 nhx6双突变植株叶片细胞液和根细胞液胞的pH，也得到了相似结果，即nhx5 nhx6双突变植株叶片细胞液和根细胞液胞的pH低于野生型植株。Fan（樊立刚）等^[37]在证实ANHX5和AtNHX6也存在于ER上的同时，发现nhx5 nhx6双突变植株细胞内ER的pH显著低于野生型，从而证明内膜AtNHX5和AtNHX6具有调节ER内pH的功能。这些研究成果虽然证明植物内膜NHXs调节pH的区室不同，但使植物内膜NHXs具有调节细胞各区室pH的功能得到了证实，也使内膜NHXs行使调节pH功能的区室部位得到完善。同时，这些研究都表明内膜NHXs的缺失导致这些区室pH降低，这也说明在正常生长条件下区室酸化将不利于植株生长发育，植物要进行正常的生理活动，各区室需维持一定的pH。

以上研究结果表明，NHX调节机制在维持各个区室pH稳态的过程中发挥重要作用。P-ATPase和V-ATPase等建立pH梯度，NHX作为质子渗漏机制，从而对各区室的pH进行调节，当加入P-ATPase、V-ATPase或NHX的抑制剂，将改变这些区室的pH平衡，相似的结论在动物细胞内也得到验证^{[43, 56-58]}。植物NHX在高盐和钾营养胁迫等条件下，可以通过其离子反向转运功能，使离子外排或者区室化，从而减轻毒害。而与此同时，细胞内一些区室H⁺的变化也伴随发生，这表明此时H⁺的转运也是利于植物减弱胁迫的反应。同时，各区室的pH改变应该也利于植物抵抗胁迫。但这种pH的改变会持续多久，是否有其它的作用机制对pH再次进行调节目前还未知，这很可能是植物NHX增强其抗逆性的另一个潜在调节机制。另外，从已有的研究结果预示NHX对外界环境pH的适应调节也可能发挥重要作用，尤其是在增强碱性或酸性土壤环境植物生存能力方面，但目前相关研究还未见报道。

2 植物NHX影响囊泡运输

植物有着复杂的内膜系统，使蛋白的合成、加工和运输有着多元化的途径，这些过程需要经由囊泡运输途经多个区室完成^[21-22]。对植物NHX的亚细胞定位及功能研究表明，NHX主要存在于分隔区室的膜上，并调节囊泡运输，从而影响蛋白转运和存贮。NHX对囊泡运输的影响最早在scnhx1酵母突变体内得到证实，发现突变体内Pep12p、Vps10p和Vph1p蛋白在液胞旁的类“class E”间隔内积累，并且部分Vma2p蛋白也聚集在此处，并未完全进入液胞，说明其囊泡运输过程被部分阻断^[59]。Bowers等^[59]将酵母ScNHX1与植物、动物及细菌的NHX蛋白序列比对分析发现，它们的跨膜区域存在4个保守的酸性氨基酸残基（D201、E225、D230和E355），在酵母中将这4个氨基酸残基分别突变变为不带电荷的极性氨基酸残基（D201N、E225Q、D230N和E355Q），其中D201N、E225Q和D230N 3个氨基酸残基中的任何一个突变都会导致酵母表现出scnhx1突变菌株表型，说明这3个保守的酸性氨基酸序列对ScNHX1功能及其对囊泡运输具有决定性作用。同时，Qiu（邱全胜）等^[60]报道酵母ScNHX1缺失导致液胞融合活力降低，但不影响可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factorattachment protein receptor，SNARE）复合体的形成，ScNHX1参与从次级内体（Late endosomes）到液胞的囊泡运输过程和液胞融合的起始过程。Mitsui等^[47]发现ScNHX1通过将Vps27p招募到内膜上，从而促进多泡体（MVB）形成。而Kallay等^[61]研究结果表明，ScNHX1参与囊泡运输是在内体（endosome）或MVB形成后到液胞的过程，并独立于ESCRT途径。这些结果虽然对ScNHX1参与囊泡运输的过程有不同的解析，但都表明了酵母ScNHX1参与囊泡运输，影响蛋白转运、融合和存贮。另外，在动物内RNAi沉默NHE6和NHE8也会导致内体运输和再循环中断^[62-63]，证实其参与囊泡运输。既然在酵母、动物中NHX具有这些功能，那么在植物中的是否具有相似功能呢？这些研究方法和成果为植物NHX的研究奠定了基础。

植物中关于质膜NHX在囊泡运输中作用的研究还未见报道，但液胞NHX参与囊泡运输的作用已有报道。Sottosanto等^[64-65]发现拟南芥atnhx1突变体内多个与囊泡运输相关基因的转录水平受到影响。Hamaji等^[66]证实盐胁迫下植株内AtNHX1会定位在胞质内的膜微囊上，这表明在盐胁迫条件下，AtNHX1很可能参与了囊泡运输。内膜NHX的研究直接证实植物NHX参与囊泡运输。Bassil等^[67]发现与野生型植株相比，内膜NHX缺失双突变体nhx5 nhx6内FM4-64被运输到液胞的时间变长，进一步通过用GFP标记的CPY（carboxypeptidase）瞬时表达发现，突变植株不能像野生型植株内那样使其进入液胞，而是聚集到质外体。转录分析发现，在nhx5 nhx6内VTI12、VSR1、VPS35、RABF2a和ARFa1e等与囊泡运输相关蛋白的转录水平都发生了改变^[67]。Reguera等^[39]通过透射电镜发现，双突变体nhx5 nhx6的种子内PSV（Protein storage vacuoles）的数目增多，而体积变小，种子贮藏蛋白2S和12S主要分布在质外体，并非PSV内，同时，种子内存在大量p2S和p12S贮藏蛋白的前体蛋白，这表明缺失突变体内囊泡运输中的蛋白转运和液胞融合过程受到影响。进一步分析发现拟南芥内膜NHX的缺失导致液胞分选受体2；1（Vacuolar sorting receptors2；1，VSR2；1）与运输物（Cargoes）间结合作用降低，从而导致囊泡运输受到影响^[39]。Ashnest等^[68]在双突变体nhx5 nhx6种子内也发现PSV具有相同的形态且p2S和p12S贮藏蛋白的前体蛋白也较多，同时双突变体nhx5 nhx6胚中液泡加工酶（Vacuolar processing enzyme，VPE）会被错误的运输到质外体。Ashnest等^[68]研究表明AtNHX6的C端与细胞分选复合体（Sorting machinery）的组分SNX1（Sorting nexin 1）具有相互作用，从而影响VSR从TGN回送ER，调节囊泡运输。Wu（武学霞）等^[36]发现人工贮藏蛋白GFP-CT24在双突变体nhx5 nhx6内不能像野生型中被运输到PSV中，而是被运输到质外体，同样，甘薯液胞贮藏蛋白与绿色荧光蛋白的融合蛋白Spo：GFP（Sporamin：green fluorescent protein）在双突变体nhx5 nhx6的原生质体细胞内70%表现为非液胞表达模式，远远高于野生型原生质体细胞内29%的非液胞表达模式，同时在双突变体nhx5 nhx6种子内存在大量2S白蛋白和12S球蛋白的前体蛋白，且这些前体蛋白主要分布在质外体。他们还发现AtNHX5中的D164、E188、D193和AtNHX6的D165、E189、D194中的任何一个保守氨基酸残基突变，都将影响种子贮藏蛋白的运输。另外，双突变体nhx5 nhx6内SNARE的SYP22和VAMP727在PVC中的亚细胞定位受到影响，致使它们被滞留在Golgi和TGN内，从而阻扰SNARE调控PVC和液胞间融合的过程，对囊泡运输途径产生不利影响^[36]。Dragwidge等^[38]证明双突变体nhx5 nhx6细胞内的内膜运动降低，Golgi和TGN/EE（Early endosomal）内蛋白回收受阻，说明内膜NHX对于功能性Golgi和TGN/EE活力、TGN/EE蛋白质回收是必须的。

虽然目前报道出多个内膜NHX调节蛋白运输和存贮的分子机制，但都表明拟南芥内膜NHXs参与调节囊泡运输过程，且内膜NHX所存在的ER、Golgi、TGN和MVB/PVC等特殊位置，是很多蛋白合成和运输的必经部位，很可能影响一些与囊泡运输相关关键蛋白的运输或后期修饰加工，从而进一步调节其它囊泡运输途径，这也可能是出现多个调解机制的原因，后续研究中或许将发现更多的调节机制。

3 总结和展望

随着研究的深入，植物NHX的功能逐渐从质膜NHX、液胞NHX到内膜NHX得证实，为全面深入了解植物NHX提供了依据^[69-70]。在植物体内，pH稳态的决定因素还不确定，已知H⁺-ATPase和H⁺-PPiase可以建立H⁺电化学势梯度，为NHX、CHX和KEA等离子反向转运体提供驱动力^[32]，表明细胞内pH的动态平衡，需要H⁺泵建立pH梯度，同时需要阳离子/质子（H⁺）反向转运体作为质子渗漏机制，微调细胞内各区室的pH。研究表明NHX缺失导致pH改变的情况下，植物通过囊泡运输重塑细胞的过程出现障碍，这两者往往是伴随发生的，这说明NHX对pH的调节与囊泡运输密切相关。植物NHX定位于质膜，液胞膜和内膜系统的膜结构上，对各个区室pH具有调节作用，而这些位置都是蛋白合成、加工、修饰的部位，任何一个部位pH的改变都可能影响参与囊泡运输相关蛋白的翻译及翻译后加工、修饰过程，也可能影响囊泡运输过程中的囊泡出芽或膜融合过程，从而对植物生长发育造成不利影响。这也表明，植物NHX对囊泡运输的影响很可能通过调节pH实现。在一些离子胁迫条件下，植物NHX会通过将离子外排及区室化等减轻毒害，同时，这必须伴随着H⁺在一些区室的转移，势必会影响这些区室的pH，而pH的改变将影响囊泡运输中一些蛋白的编码、修饰及加工等，同时也将对囊泡运输的各过程造成影响，而这些都是植物在规避不利的非生物胁迫条件下的自主选择。这就暗示，植物在遭受离子胁迫时，H⁺在各区室的转移，造成囊泡运输发生改变，可能是规避危害的一种方式或者还有其它途径来重新调节各区室的H⁺浓度，使各区室pH尽量恢复到胁迫前水平，保证囊泡运输免被影响。目前，植物遭受离子胁迫的研究机理主要集中在阳离子转移方面，而pH平衡方面研究的还比较少，植物NHX调节一价阳离子胁迫的研究如果从pH和囊泡运输方面着手，可能是新的研究领域。

目前，对植物NHX的研究虽然已经取得了一系列进展，但大部分研究主要在模式植物拟南芥中进行，且关于NHX是否在植物遭受外界环境酸、碱胁迫中的作用研究还相对较少，尤其是在农业种植中，由于过量使用化肥导致土壤酸化和盐碱地等，其研究将更有意义。在遭受pH胁迫时，NHX很可能通过自身对pH的调节作用，维持胞内pH的稳态，并在一定范围内保障很多关键蛋白的合成、加工，从而使囊泡运输得以顺利进行，为自身细胞塑造提供保障，进而减弱逆境胁迫。因此，在一些抗逆性强的植物内鉴定和克隆NHX，并对其相关功能进行研究将对生产具有重要意义。