2. 北京林业大学螺旋藻研究所，北京 100083
2. Institute of Spirulina, Beijing Forestry University, Beijing 100083
螺旋藻（Spirulina）是一种光合自养原核浮游植物[1]，能够产业化的藻种营养丰富，蛋白含量高达60%-70%[2]，还含有其他多种活性物质，用途十分广泛，被联合国粮农组织推荐为“21世纪最佳食品”[3]。当养殖条件适宜，螺旋藻生长十分迅速，产量高。然而，螺旋藻粉质量要求严格，其中重金属含量是质量检测的重要方面，藻粉砷含量是其中指标之一。螺旋藻细胞本身具有吸收和积累重金属的特性[4-5]，易在养殖过程中造成砷积累，造成藻粉砷含量升高或超标，导致藻粉质量下降。王志忠等[6]研究表明藻粉中砷含量与养殖用水砷含量呈正相关；Guo等[7]和Uppal等[8]及王淑[9]研究表明砷在螺旋藻细胞内主要通过砷的吸收、还原或氧化和甲基化过程进行砷解毒；尽管穆文静[10]和乌达巴拉[11]研究了砷（AsⅢ）胁迫下螺旋藻光合色素、藻蓝蛋白、抗氧化酶活性的变化，表明砷对螺旋藻物质代谢有影响，但迄今为止，在生理指标变化研究的基础上，关于砷对螺旋藻分子水平的影响并未见报道。因此，本研究对螺旋藻砷胁迫的蛋白组学水平展开研究，以在蛋白组水平上探索螺旋藻细胞对砷胁迫的应对机制，为在螺旋藻养殖过程中调控砷吸收和积累提供理论依据和实际应用指导。
1 材料与方法 1.1 材料本实验所用藻种为北京林业大学螺旋藻研究所提供的钝顶螺旋藻（Spirulina platensis sp.）。
1.2 方法 1.2.1 螺旋藻培养条件采用Zarrouk培养基于28℃，光照强度60 μmol· m-2 ·s-1，摇床100 r/min培养，光照周期12 h:12 h。
1.2.2 螺旋藻砷离子胁迫培养将处于对数生长期的藻种分别接种于不同浓度（0 ppm、1 ppm和2 ppm）的100 mL含砷培养液中，于28℃，光照60 μmol· m-2 ·s-1，光暗比12 h:12 h，摇床100 r/min下培养。
1.2.3 光合放氧测定取经过砷离子胁迫10 min后的藻液，控制测定温度31℃，光强60 μmol· m-2 ·s-1，使用Chlorolab-2液相氧电极（Hansatech Ltd.，UK）测定各组藻液的光合放氧速率，每个样品重复测定3次。
1.2.4 紫外-可见吸收光谱全波段扫描收集24 h培养后的藻泥，蒸馏水冲洗至pH值7左右，冻干。取0.04 g冻干藻粉于试管中，加入5 mL PBS磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH值7.0），搅匀，溶胀4 h后超声震荡10 min（冰水浴），离心（6 000 r/min，4℃，15 min），收集离心上清液定容至10 mL，用紫外-可见分光光度计进行200-800 nm全波长扫描。每个样品重复测定3次。
1.2.5 SDS-PAGE电泳取培养7 d后经过冻干的螺旋藻样品，在液氮中磨碎，加入25 mL 10%的三氯乙酸丙酮溶液和65 mmol/L DTT，-20℃沉淀1 h，10 000 r/min离心45 min，取沉淀。向沉淀中加入25 mL无水丙酮溶液，再次静止沉淀、离心。离心沉淀干燥后在-80℃下保存。取干燥蛋白样品40 μg，以上样比例5:1（V/V）加入6×上样缓冲液，沸水浴反应5 min，14 000 r/min离心10 min，取上清液进行12.5%的SDS-PAGE电泳。电泳条件为：恒流：14 mA，电泳时间90 min。使用考马斯亮蓝来染色，每个样品进行3次，以获得稳定的差异蛋白图谱。
1.2.6 质谱样品的制备将存在显著差异的蛋白质条带从整张凝胶图谱中取出，放入装有1 mL水的离心管内，清洗10 min，除去水后重复此操作一次。向样品中加入1 mL酶内消化脱色液（50%乙腈，25 mmol/L碳酸氢铵）清洗10 min，除去脱色液，重复此操作一次。向离心管中加入乙腈至样品完全变白，真空抽去乙腈后加入10 mmol/L DTT，56℃水浴锅内孵育1 h。移除DTT后加入55 mmol/L IAM，室温下于暗室孵育45 min。移除IAM后加入25 mmol/L碳酸氢铵清洗10 min，除去碳酸氢铵加入脱色液清洗10 min，重复清洗一次。加入乙腈脱水至样品完全变白，真空抽去乙腈。用25 mmol/L碳酸氢铵将1 μg/L的酶储液稀释15倍后加入样品中，使样品充分吸收，继续加入25 mmol/L碳酸氢铵没过样品，37℃水浴过夜。过夜后向样品中加入终浓度为0.1%的TFA终止消化。取10 μL样品上质谱仪检测。
1.2.7 质谱分析使用的液相系统为ultimate3000纳升液相，流动相分别为A：0.1% FA水溶液和B：0.1% FA乙腈。样品在2 μL/min流速下通100% A相完成上样，在ChromXP C18预柱上（360 μm×0.5 mm，3 μm，C18-CL，120 A）富集，之后在0.4 μL/min的流速下，通过一个65 min的梯度在AcclaimTM PepMapTM 100 C18液相色谱柱（75 μm×2 cm，3 μm-C18）上分离。使用的梯度为：0-40 min，B相由0线性升至30%；40-48 min，B相由30%线性升至100%；48-65 min B相保持为100%。经过液相分离后的肽段进入Q Exactive质谱仪检测。
1.2.8 数据库检索使用MASCOT引擎（2.2版本）建立了螺旋藻转录组数据库，并结合UniProt（Release-201707）微藻蛋白库进行综合比对。质谱定量到的蛋白质以3次对的生物学重复和3次技术重复结果的平均值作为基础，以Ratio > 1.2且P value < 0.05作为标准筛选差异蛋白，查库搜索MS/MS质谱检测肽段。
1.2.9 生物信息学分析利用Blast2GO（Version 2.7.2）鉴定所获得的差异蛋白，对定量到蛋白的比对序列行使代谢途径追踪功能，分别提取与其所有关联的GO功能条目。用GO注释进行蛋白质的功能分析，根据其生物学过程、分子功能对蛋白质进行分类，并对差异蛋白进行KEGG通路注释。
2 结果 2.1 砷离子对螺旋藻光合放氧速率的影响由图 1可以看出，螺旋藻受到外液1 ppm砷离子胁迫时，与对照相比光合放氧速率就出现明显降低，光合放氧速率下降了21.2%；当其砷离子浓度增加为2 ppm时，光合放氧速率下降了27.7%，但两者浓度之间差异并不大。
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| 图 1 砷离子浓度对藻细胞光合放氧速率的影响 |
由紫外-可见吸收光谱（图 2）可以看出，处理组与对照组特征峰趋势一致，但砷处理组特征峰明显低于对照。在200-800 nm紫外-可见光范围共有3个吸收光谱带200-400 nm，400-500 nm和600-800 nm。在200-400 nm的特征吸收峰位于254 nm；400-500 nm紫外-可见光范围有3个吸收峰，吸收峰波长分别是440 nm、490 nm和500 nm；600-800 nm紫外-可见光范围内分别出现620 nm、680 nm吸收峰。
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| 图 2 砷离子胁迫下螺旋藻提取液紫外-可见吸收光谱图 |
由凝胶电泳（图 3）可以看出，与对照样品相比，经过2 ppm砷离子处理后的样品蛋白质分子段在30 kD-55 kD和70 kD-90 kD范围内存在极显著的差异，蛋白条带颜色较深且密集。可见砷离子浓度增加到2 ppm，蛋白条带变化更为显著，且主要差异蛋白集中在上述两个分子量范围内。因此，选择2 ppm砷胁迫差异蛋白条带进行后续分析。
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| 图 3 不同浓度砷离子处理的螺旋藻蛋白电泳图谱 |
采用质谱分析和Mascot查库对差异蛋白进行分析，以PFD≤0.01过滤筛选后去除反相数据库数据，得到唯一肽段的数目为5 783，蛋白质组数目为721，3个通道皆有定量信息的蛋白质组数是596个，其中上调蛋白为28个，下调蛋白47个（P < 0.05）（表 1）。
GO功能分析表明，这些差异蛋白参与的细胞组成主要有功能酶活性（47.6%），结合（38.1%）以及氧化还原酶活性（7.6%）（图 4）；生物过程主要包括生物合成过程（46.2%），代谢过程（23.1%），光合过程（7.7%）与运输过程（7.7%）（图 5）。
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| 图 4 差异性蛋白GO功能注释统计（分子功能） |
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| 图 5 白GO功能注释统计（生物过程） |
KEGG通路注释分析表明，差异蛋白主要涉及光合作用、硝酸盐代谢、氧化磷酸化、氨基酸的从头代谢和氮代谢等信号/代谢通路。
根据GO功能注释结果，按参与生物代谢过程，这些差异蛋白主要可以分成5大类：能量代谢（33.3%），蛋白质合成与折叠（8%），活性氧清除与防御（8%），离子运输和膜转运（6%），以及氨基酸合成（17.4%）（表 1）。
3 讨论 3.1 砷离子对螺旋藻光合放氧及其细胞内容物的影响螺旋藻光合作用是决定其生长和产量的重要生理过程，砷离子浓度较低时（1 ppm-2 ppm），螺旋藻光合放氧速率就会受到显著的抑制。砷含量小于1 ppm是饲料级螺旋藻粉的国家标准。因此，控制砷离子浓度，对防止螺旋藻粉砷超标及其稳产都具有重要意义。
砷离子在较低浓度时就影响了螺旋藻的光合作用进程，也一定会影响螺旋藻活性物质的代谢。图 2结果表明，砷离子明显抑制了螺旋藻细胞的物质积累。254 nm为金属硫蛋白的吸收峰[12]，金属硫蛋白是细胞内金属结合蛋白的总称，可以被包括砷在内的许多离子和化合物诱导，使细胞对重金属的毒害有一定的抗性[13-14]，金属硫蛋白相对含量的下降表明砷离子抑制了其在螺旋藻细胞内的积累且增加了其消耗。400-500 nm一般为叶绿素与类胡萝卜素吸收峰[15-18]。620 nm与680 nm分别为藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的特征吸收峰[19]。叶绿素和类胡萝卜素通常与蛋白质结合成色素蛋白，构成螺旋藻的天线色素蛋白[20]，藻胆蛋白更是螺旋藻重要的捕光色素蛋白[21]。几种捕光色素蛋白的降低，表明螺旋藻光合作用可能受到严重影响。穆文静等[10]研究也表明砷离子（AsⅢ）会导致螺旋藻叶绿素、类胡萝卜素以及藻胆蛋白含量的降低。光合速率降低，抗氧化作用启动，一定引起藻生理作用的改变。
3.2 螺旋藻砷胁迫蛋白质组学 3.2.1 能量代谢与光合作用相关蛋白砷胁迫使ATP合酶β亚基（ATP synthase subunit beta）的数量下调，表明螺旋藻在砷胁迫下能量供应系统可能受到了影响。Pandey等[22]发现在40 mmol/L As（Na2HAsO4·7H2O）处理下。鱼腥藻中该酶数量也呈下调趋势。同样的结果也在杜氏盐藻[23]中出现。光合系统对于不同金属污染物的损伤十分敏感。在呈现显著下调表达的蛋白中也可以发现。藻细胞的光合作用受到了显著的影响。与光合作用、氧化磷酸化以及电子传递相关的蛋白均呈现下调表达。镁原卟啉IX螯合酶（Mg-protoporphyrin IX chelatase）作为合成叶绿素的重要酶呈现出显著的下调性表达，这种酶是参与卟啉和叶绿素代谢的最重要的酶之一[24-25]；光系统Ⅰ P700叶绿素a载脂蛋白A2（Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A2）也呈现显著性的下调表达，两种叶绿素相关蛋白的下调标志着叶绿素合成减缓或分解加速[26]。叶绿素作为电子传递链中吸收光子并传递电子的组分[27]，其分解影响了电子传递，从而抑制光合作用。同时，作为电子传递链中最大最复杂的一种酶NAD（P）H-醌氧化还原酶亚基H（NAD（P）H-quinone oxidoreductase subunit H），其下调也会影响电子传递过程，导致氧原子积累、叶绿素降解，从而影响光合作用[28]。
丝氨酸/苏氨酸激酶（Serine/Threonine protein kinase with FHA domain modulation）、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶（Succinyldiaminopimelate transaminase）等蛋白的降低，表明光合作用产生能量的过程受到影响时，螺旋藻细胞无法通过氧化磷酸化的过程进行能量补充。乙酰辅酶A合成酶（Acetylcoenzyme A synthetase）的下调直接影响了乙酰辅酶（Acetyl-CoA）的合成，乙酰辅酶的主要作用是将乙酰基传递给TCA，使其被氧化从而产生能量。碳酸脱水酶（Carbonate dehydratase，CA），又称carbonic anhydrase[29]，能够促进CO2在藻细胞中的固定[30]，对维持水溶CO2从质膜到Rubisco位点的稳定流量，避免CO2从胞内CO2库向外流失起关键作用[31]。CA数量的下调表明螺旋藻胞外固定CO2的能力已被抑制。另外，磷酸核酮糖激酶（Phosphoribulokinase，Prk）作为卡尔文循环最后一步的催化酶同样被抑制，表明砷损害了螺旋藻对CO2的固定。Ge等[23]发现杜氏盐藻在11.2 mg/L As（Ⅴ）处理下，CA与Prk均下调，其CO2固定过程也被抑制。
3.2.2 蛋白质合成与折叠相关蛋白由于光合作用的降低，导致ATP和NADPH无法正常合成，故而，依赖ATP和NADPH进行的跨膜运动、酶促反应和蛋白质空间结构的形成受到了不同程度的影响。包括硝酸盐转运相关蛋白铁氧蛋白亚硝酸合酶（Ferredoxin-nitrite reductase）的降低，直接导致藻细胞对培养液中氮源吸收的降低，进而影响蛋白质的合成[32-35]。同时，与氨基酸、蛋白质转运相关蛋白的下调，如苯丙氨酸tRNA连接酶β亚基（Phenylalanine-tRNA ligase beta subunit），也表明了蛋白质合成过程的受阻。
ClpP是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶[36-37]，完整的Clp蛋白酶复合物具有一个桶装结构，其中ClpX是夹在其中的具有ATPase活性的子单元[38]。这些ClpX可用于识别、展开并将蛋白质底物转移到核心位置的功能[39]。在本研究中，ClpX的降低大大影响了Clp蛋白酶与底物结合的效率，导致蛋白质合成受损。
砷会干扰蛋白质的折叠，造成蛋白质错误折叠和聚集[40]。虽然螺旋藻蛋白质合成过程受阻，但在砷胁迫下，一些伴侣分子蛋白呈现上调。这说明藻细胞虽无法完全抵抗砷离子带来的伤害，但其细胞内部依然对砷离子的影响作出了明显的响应，重点保护蛋白质的结构。33 kD伴侣蛋白（33 kD chaperonin）主要涉及蛋白质的折叠，此伴侣蛋白帮助组蛋白折叠形成核小体，它涉及了将折叠的子单元组装成寡聚结构[41-42]。并且这类蛋白的一个主要功能是放置新合成的多肽链和聚集的亚单位聚合成非功能区域[43]，同时为合成功能性区域保留必需的能量来源，这种伴侣蛋白的显著上调在能量供给不足的情况下显得尤为重要。延长因子T（Elongation factor T）主要行使分子伴侣蛋白功能，此蛋白上调可保护其他蛋白免于聚集和降解。Anabaena sp. PPC 7120在砷处理后也出现了相同的结果[22]。核糖体结合分子伴侣（Trigger factor）能与新生多肽链结合，是帮助新合成蛋白折叠的主要伴侣蛋白[44]，此类蛋白的上调也是螺旋藻为保护蛋白结构对砷胁迫作出的响应。
有3个核糖体蛋白表达出现明显的变化，其中两个上调一个下调。然而，这些蛋白在砷代谢中的功能还需要进一步研究。
3.2.3 活性氧清除与防御相关蛋白砷酸盐会引发细胞过氧化，对DNA、脂质以及蛋白等大分子物质造成氧化损伤[45]。砷处理下螺旋藻细胞中与氧化应激相关的某些蛋白出现上调，包括谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase，GSH），氧化还原酶结构域蛋白（Oxidoreductase domain protein），醛酮还原酶（Aldo/keto reductase）。
目前已确定谷胱甘肽（GSH）是植物防御系统抵御各种胁迫的核心组成部分之一[46]，GSH通过捕获自由基和催化还原过氧化氢来保护细胞[47-48]。螺旋藻内GSH的上调表明其对细胞内氧化损伤作出积极应答，此结果与杜氏盐藻砷胁迫结果相同。当杜氏盐藻暴露于砷溶液时，会诱导细胞内的GSH合成，在砷积累过程中作用显著[49-50]。重金属会引起细胞的强烈脂质过氧化反应，产生多种醛类物质。Aldo/keto reductase（醛酮还原酶）在生物体内能将多种有毒醛还原为毒性较小或没有毒性的相应醇类物质，是有毒醛的一个重要的代谢和解毒途径[51]。螺旋藻中醛酮还原酶的上调表达也是对砷引起的脂质过氧化的应激反应，同样的现象在水稻中也有出现，泰国香米水稻中的AKR在活性醛解毒途径也有着独特的作用[52]。
乙醇脱氢酶（Alcohol desydrogenase，zinc bind-ing，ADH）是一种含锌酶，属于脱氢酶/还原酶（Dehydrogenase/reductase，MDR）蛋白基因超家族的成员[53]，可将乙醛和乙醇相互转换。螺旋藻细胞内ADH的上调可能会起到清除活性醛的作用，以此来对抗砷离子引起的的细胞过氧化。在梁燕等[54]研究也发现，水稻中的ADH具有保护膜结构功能的完整性，延长细胞寿命的功能。
3.2.4 磷酸盐转运与跨膜相关蛋白P和As属同族元素，由于两者化学结构相似，As（Ⅴ）可通过磷酸盐转运通道被浮游植物吸收[9, 55]。螺旋藻培养液中添加砷离子不可避免会影响磷代谢，磷信号转导系统（Regulator）下调表明其跨膜运输受到干扰，同时磷酸结合蛋白（Phosphate-binding protein）通过上调以结合补充磷。谷氨酰胺合成酶的上调很有可能是因为砷离子干扰磷代谢造成的。谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase）通过催化谷氨酸盐与铵生成谷氨酰胺，此反应消耗一个ATP的同时释放焦磷酸盐，后者可被降解为无机磷酸盐，补充砷胁迫下减少摄入的磷。杜氏盐藻在砷胁迫与盐胁迫下均出现磷酸盐吸收降低的现象，同时谷氨酰胺酶都呈现上调[23, 30]，与砷处理下的螺旋藻表现出相同的结果。
4 结论螺旋藻细胞对砷离子胁迫十分敏感，当外液砷离子浓度达到1 ppm时，螺旋藻细胞就有明显的响应；当外液砷离子浓度达到2 ppm时，就对螺旋藻细胞光合放氧产生显著的影响，并对螺旋藻光合色素相关蛋白产生抑制作用。砷离子在藻细胞内的转化触发了螺旋藻的氧化应激反应，产生了一系列活性氧清除与防御过程，75种差异蛋白指示了这些变化过程也涉及到能量代谢、蛋白质合成与折叠、磷酸盐转运等途径。因此，在实际应用中，螺旋藻养殖培养液砷离子浓度一定要控制在1 ppm以下，才可能避免其较大的影响，确保不会因此减产，从而获得合格的藻粉和较高的产量。
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