2. 云南师范大学马铃薯科学研究院 云南省高校马铃薯生物学重点实验室，昆明 650500
2. Joint Academy of Potato Sciences, Yunnan Normal University, Key Laboratory of Potato Biology in Universities of Yunnan Province, Kunming 650500
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上最重要的块茎类粮食作物，其在单位土地和时间内所提供的糖类、蛋白质、矿物质以及维生素超过了其他任何作物[1]。除了可以鲜食之外，马铃薯还可以通过工业加工成许多商品，如薯片、酒精、淀粉、动物饲料等[2-3]。由于马铃薯栽培种绝大多数为四倍体，常规育种方法周期漫长，费时费工。尽管传统育种方法已经成功育成了许多品种，但是绝大多数马铃薯栽培种是高度杂合的同源四倍体，要想将有益突变集中到一个品种当中相当困难，通常育成一个成熟的品种需要十几年的时间[4]。然而，随着全球气候变化、新病原体的出现以及提高马铃薯品质、储藏性、抗逆性等的需要，要求培育出具有理想农艺性状的马铃薯新品种。目前，通过多种分子辅助育种方法来进行马铃薯性状的改良，进而提高产量、加工品质以及储藏品质等方面已取得了一些进展[5]。随着马铃薯的基因组测序完成[6]，以及基因组编辑技术的迅猛发展，使得马铃薯的育种改良进程得以加快，定向设计和精准分子育种成为可能。本课题组在2018年通过CRISPR/Cas9基因组编辑体系对自交不亲和的二倍体马铃薯S-RNase基因进行了编辑敲除，成功获得了自交亲和的二倍体马铃薯突变材料，为后续的二倍体马铃薯杂交育种体系建立奠定了重要的基础[7]。本文简要综述了3类主流基因组编辑技术的原理，回顾了基因组编辑技术在马铃薯品种改良和精准分子育种中的应用，讨论了基因组编辑技术对于马铃薯精准分子育种的意义和目前存在的问题，并对基因组编辑技术在马铃薯精准分子育种中的应用进行了展望，旨在为该技术在以后的马铃薯精准分子育种中的应用提供借鉴和新思路。
1 基因组编辑技术基因组编辑技术是通过位点特异性核酸酶(Site-specific nucleases，SSNs)对靶位点造成DNA的双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，从而引发机体的修复机制，修复机制包括两种：非同源末端连接和同源重组修复[8]。非同源末端连接是一种高效的修复方式，能够快速在断口完成修复，但是重复的修复会引入错配，导致断裂位点产生缺失或者插入突变；这些突变使得基因的阅读框发生了变化，进而翻译出无功能或功能变异的蛋白，从而达到敲除该基因的目的。同源重组修复指的是断裂位点在修复的时候直接以转入细胞的与断裂位点同源的外源片段作为修复模板，使得在断口位置插入特定的基因或片段[9]。在此基础上，人们可以对任何已知序列的基因进行敲除以研究其功能，同时也可以对目的基因进行定点修复，使之恢复或者替换基因功能。目前主要用于基因组编辑的有3种SSNs：锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)以及RNA介导的规律的成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR/Cas9)。
1.1 ZFNsZFNs是由人工合成的核酸酶，包括了两个结构域：一个是由多个锌指结构组成的DNA结合结构域，每个锌指结构能结合3 bp的DNA序列[10-11]；另一个是由非特异性核酸内切酶Fok Ⅰ组成的DNA断裂结构域[12]。Fok Ⅰ需要以二聚体的形式才能够行使断裂功能[13]，因此需要在靶点两端单独设计ZFN，使与之相连的Fok Ⅰ核酸酶能够在靶点聚集，增加形成二聚体的概率，完成切割DNA双链并引发细胞的修复机制。
早在2001年，Bibikova等[14]就通过人工合成的ZFNs和外源质粒注射到非洲蟾蜍的卵母细胞中，成功获得了经过切割修复的质粒。随后，Bibikova等[15]又在果蝇中实现了对Y(yellow)基因进行定向突变，催生了ZFNs在基因组编辑中的应用。ZFNs已被报道应用于一些植物基因组编辑当中，如拟南芥[16]、玉米[17]、大豆[18]等，但未见到以马铃薯为材料的报道。
虽然ZFNs能够大大提高基因的编辑效率，但是由于公开的锌指模块较少，构建一个能够识别特定靶位点的ZFNs需要通过大量的筛选获得能够特异结合靶位点的锌指蛋白。此外，ZFNs对细胞的毒性也限制了该技术的广泛应用[19]。
1.2 TALENs人工改造的TALENs和ZFNs原理相似，其断裂结构域同样由非特异性核酸内切酶Fok Ⅰ组成；其DNA结合结构域是黄单胞菌入侵植物时所分泌的转录激活因子效应物[20](Transcription activator-like effector，TALEs)。TALEs能够进入细胞核，结合特定的DNA序列，激活部分基因的表达，增加植物对病毒的敏感性，也有可能引发植物防御机制。TALEs是由多个33-35个氨基酸组成的串联重复序列组成，每个重复大部分氨基酸的序列是不变的，只有在12/13位的氨基酸(重复可变双残基，Repeat-variable diresidues，RVDs)是可变的。含有不同RVDs的重复序列能够一对一的识别不同的碱基，利用特定的TALEs模块组合，能够实现识别任何DNA序列的目的。连接在TALEs上的核酸酶Fok Ⅰ在局部形成二聚体，就能在靶位点进行精确DSBs，实现基因组编辑的目的[21-22]。相对ZFNs来说，TALENs省去了大规模筛选锌指结构的程序，加大了靶向任何序列的能力，但是实现TALENs模块的组装比较费时费力，影响了该技术的大规模推广。
自2010年以来，TALENs在酵母中完成了对外源质粒的DSBs以及同源重组修复后，该技术已经在一些农作物上进行了应用，如烟草[23]、大豆[24]等。TALENs在马铃薯中也有几个成功的例子，2015年，Nicolia等[25]建立了马铃薯原生质体的基因组编辑体系，其编辑效率达到了10%。同样，TALENs介导的同源重组修复在马铃薯中也成功实现，Butler等[26]2016年通过双生病毒提供了大量的修复模板，成功提高了在马铃薯中的同源重组效率。
1.3 CRISPR/Cas9早在1987年，日本科学家Ishino等[27]在研究大肠杆菌的iap基因的时候，在其侧翼发现了一连串由29个碱基组成的串联重复序列，其间由32个特异碱基间隔开。在之后的研究中发现，这类结构存在于许多的原核生物中[28]。这种结构在2002年被正式命名为CRISPR，其间的间隔特异序列被称之为Spacer。2005年，Bolotin[29]通过比较嗜热链球菌的CRISPR序列和噬菌体的基因组时发现，噬菌体的序列与Spacer的序列是部分匹配的，同时证实了CRISPR系统与嗜热链球菌抵抗病毒相关。科学家们在对CRISPR的进一步研究中发现，细菌可以扫描噬菌体中在序列3’端含有NGG也就是PAM序列的DNA序列并进行切割，然后整合到细菌自身的CRISPR序列当中，形成新的Spacer；当噬菌体再次入侵的时候，CRISPR序列转录成CRISPR RNA，经加工成熟后与Cas蛋白结合，引导Cas蛋白切割与之匹配的噬菌体DNA序列，达到防御的目的。
CRISPR根据基因的保守性和组织排列特异性分为3种类型：Ⅰ型和Ⅲ型需要6到7种蛋白质才能发挥作用，目前通常用的是Ⅱ型的CRISPR，只需要一种Cas9蛋白就能发挥作用[30]。2012年，Jinek等[31]首先构建了CRISPR/Cas9载体，完成了环状DNA以及线性化DNA的体外切割。该系统主要含有两部分：Cas9蛋白以及导向靶基因的单链引导RNA(Single guide RNA，sgRNA)。因为潜在的靶点很多，以及载体构建方便，CRISPR/Cas9系统开始大规模应用于各种生物的研究。
目前，CRIPSR/Cas9系统已经成功应用于多种植物基因组编辑上[32]。在马铃薯中，Butler等[33]利用CRISPR/Cas9系统分别对二倍体和四倍体马铃薯的乙酰乳酸合成酶基因(Acetolactate synthase1，StALS1)进行了敲除，其中突变效率最高达到了60%。Hiroaki等[34]利用水稻的OsMac3的翻译增强子插入到启动子和Cas9基因之间，能够明显增加马铃薯等位基因的突变效率。Nadakuduti等[35]还对比了CRISPR/Cas9和TALENs在马铃薯原生质体中的突变效率，研究表明Cas9的编辑效率(27.4%)明显高于TALENs的编辑效率(12.6%)。另外，Veillet等[36]通过胞嘧啶单碱基核苷酸编辑使StALS1突变，使马铃薯获得了除草剂抗性，结合农杆菌侵染方法，从而获得不含外源DNA片段的基因组编辑植株。
2 基因组编辑在马铃薯品种改良和精准分子育种中的应用 2.1 降低马铃薯块茎中糖苷生物碱含量糖苷生物碱(Steroidal glycoalkaloids，SGAs)是一种存在于马铃薯中的有毒物质[37]，是影响马铃薯品质的重要性状。在马铃薯育种过程中，通过与野生种马铃薯杂交，能够带来一些优异的抗病性状，但同时也会提高SGAs的含量[38]，所以控制SGAs的含量对于马铃薯育种来说是非常重要的。
甾醇侧链还原酶2(SSR2)是合成胆固醇的关键酶，与SGAs的合成密切相关。Sawai等[39]首先通过RNAi技术对马铃薯的StSSR2进行干涉，在StSSR2转录本显著降低的转基因植株中，SGAs的含量无论在试管苗或是块茎皮中都低于非转基因的10%以下，且胆固醇的含量也显著降低。同时，下调StSSR2的表达量并不会影响薯块的产量。然后通过TALENs载体在StSSR2上引入突变，获得的突变体中SGAs的含量同样下降到野生型的10%左右。利用这种人工创制的低SGAs的马铃薯材料，能够加速低SGAs品种定向改良及精准育种的进程。此外，在龙葵碱合成通路中，还有一个2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxoglutaratedependent dioxygenase，16DOX)基因，在RNAi植株中被证实能够强烈抑制SGAs的产生[40]，同时不会影响马铃薯的产量。随后，Nakayasu等[41]利用CRISPR/Cas9基因组编辑体系在马铃薯根中对St16DOX进行了敲除，之后对转基因植株进行检测，发现在St16DOX不能正常表达的植株当中SGAs的含量几乎为零。因此，St16DOX能够成为创制不含SGAs的马铃薯品种潜在的基因组编辑位点。显然，经过多组学手段，进一步弄清马铃薯SGAs的详细代谢途径及关键调控酶基因，而后通过基因组编辑技术，可为降低马铃薯块茎SGAs含量的精准分子育种提供一条强有力而快捷的技术实现途径。
2.2 改良低温储藏马铃薯块茎的品质为了延长马铃薯的储藏时间，生产上一般都会采取冷藏的方式，但是冷藏会导致马铃薯的蔗糖大量裂解产生还原糖，使得马铃薯在高温加工时产生黑色苦味产物，降低品质[42-44]。还原糖还能够与游离氨基酸如天冬酰胺反应生成致癌物质丙烯酰胺[45]。所以在冷藏马铃薯中，还原糖的含量是一个很重要的指标。
液泡转化酶(VInv)定位在液泡中，在低温冷藏马铃薯产生还原糖中扮演着重要的角色[46]，通过RNAi下调StVlnv的表达能够显著降低薯块中的还原糖浓度，使得薯片中丙烯酰胺的含量下降到野生型薯片的1/15。之后，Clasen等[47]通过PEG介导，把包含靶向StVlnv的TALENs载体导入马铃薯原生质体中，成功获得了StVlnv敲除的再生植株。在4个等位基因都突变的冷藏马铃薯当中，葡萄糖和果糖的含量低于该实验的极限检测值(< 0.1 mg/g)，同时蔗糖的含量明显上升。在StVlnv敲除的冷藏马铃薯加工成薯片之后，其中丙烯酰胺的含量相较于野生型的下降了73.3%，且薯片的颜色明显要优于野生型的薯片。这为解决冷藏马铃薯的品质变差提供了很好的解决方法。
2.3 修改马铃薯块茎中的淀粉组成成分马铃薯淀粉在食品和工业上都有着非常广泛的应用。通常可以通过化学或者物理的方式来改变淀粉的性质，但是这些手段或多或少都会影响环境[48]。所以，如果在马铃薯块茎中能够直接完成淀粉合成特性的转变将会非常有应用价值。淀粉有两种组成成分：直链淀粉和支链淀粉。其中，马铃薯中含有一个合成直链淀粉关键的酶：颗粒结合淀粉合成酶(GBSS1)。高支链淀粉马铃薯(蜡质马铃薯)已经通过RNAi技术干涉StGBSS1成功实现[49]。随后，Andersson等[50]通过在四倍体马铃薯中瞬时表达靶向StGBSS1的CRISPR/Cas9编辑载体，使得该基因的4个等位基因全部突变，实现了马铃薯中合成的淀粉全部成为支链淀粉，并且没有任何外源DNA片段插入马铃薯基因组的情况，这为定向改变马铃薯块茎中的淀粉组成成分，进而为特定食品和工业用途的马铃薯品种的精准分子育种提供了一个很好的范例。
2.4 改变马铃薯自交不亲和性目前，栽培种马铃薯都是四倍体，一个马铃薯品种要育成每个显性抗病基因存在3个或者4个等位基因的话，可能需要时间长达15年[51]，这对于马铃薯的品种改良是很不利的。而如果用二倍体马铃薯的的近交系进行杂交育种的话可能是一个高效的育种方式[4, 52]。但是二倍体马铃薯存在着自交不亲和(Self-incompatibility，SI)现象。马铃薯中，自交不亲和由高多态性的S位点所控制，在野生马铃薯Solanum chacoense中含有显性的S位点抑制基因(Sli)，能够实现马铃薯的自交[53]。但是，导入该基因会使得S. chacoense中的一系列未驯化位点，如长匍匐茎、高龙葵碱等带入到育种材料中，增加筛选的工作量[38, 54]。本课题组在2018年，通过转录组测序获得了控制二倍体马铃薯自交不亲和的雌蕊决定基因S-RNase序列全长，之后通过CRISPR/Cas9基因组编辑体系，对该基因进行了编辑，成功获得了S-RNase双等位基因突变的且自交亲和的二倍体马铃薯材料[7]。该研究开辟了二倍体马铃薯育种的新途径，拓展了自交亲和马铃薯资源，将加速马铃薯的遗传改良[55]。不久之后，Enciso-Rodriguez等[56]也对S-RNase进行敲除，同样获得了能够自交亲和的二倍体马铃薯，进一步证实了对S-RNase的编辑能够获得自交亲和的二倍体马铃薯材料。
3 展望基因组编辑技术效率高，可对靶标基因进行定点敲除、插入、替换等，是非常实用的基因功能研究以及精准分子育种工具，已成为农作物改良的重要技术。目前基因组编辑技术在重要农作物如水稻、小麦、玉米等基因功能验证及定向遗传改良方面已有许多成功的案例，但是在马铃薯定向遗传改良方面的成功运用尚还有限。
马铃薯栽培品种通常是高度杂合的同源四倍体，遗传背景复杂，涉及到产量、品质、抗性等许多重要农艺性状的重要代谢途径和关键控制基因尚不清楚，进而或为通过基因组编辑来进行马铃薯精准分子育种的核心限制因素。因此，通过多组学联合分析，弄清控制马铃薯重要农艺性状的代谢途径和阐明关键控制基因的功能，将会为基因组编辑技术运用于马铃薯精准分子育种奠定坚实的基础。
此外，基因组编辑技术用于改良重要农作物对生物和非生物胁迫抗性已有不少成功的案例[57-58]，但在马铃薯方面尚未见到报道。马铃薯晚疫病是公认的对马铃薯最严重的病害，能够在感染后10 d完全摧毁马铃薯植株[59]。Oliva等[60]在水稻上已经通过基因组编辑技术编辑了感病基因(Susceptible gene)SWEET11、SWEET 13和SWEET 14的启动子的EBE结合元件，进而提高了水稻对细菌性白叶枯病广泛的抵抗力。而在马铃薯上同样存在着许多S基因，如StUBK[61]、StBSL家族基因[62]和StVIK[63]等，沉默这些基因能够获得抗病性增强的表型。可以推测，利用基因组编辑技术能够使得这些S基因应用于马铃薯抗晚疫病的精准分子育种，这将会是一个很有前景的研究方向。
因马铃薯品种的原因，很多品种的马铃薯遗传转化体系建立起来比较困难[64]，使得一部分品种的马铃薯难以获得所需要的转基因植株；此外，由于目前转基因作物在公众中的接受程度不高，想要推广基因组编辑马铃薯最好在完成编辑的马铃薯中不含外源DNA片段。对于含有外源片段的基因组编辑植株来说，想要去除转基因植株的外源片段，可以通过自交的方式进行筛选[7, 56]。另外，也可以通过载体在马铃薯原生质体中瞬时编辑来达到不含外源DNA片段的目的。但是，马铃薯的原生质体游离以及再生过程十分繁琐，耗费时间长达6-7个月[25]。因此，进一步改良和完善基因组编辑技术，以获得不含外源DNA片段的无转基因且能稳定遗传的基因组编辑马铃薯品种，这将会具有很大的应用价值。
CRISPR/Cas9基因组编辑体系因其结构简单且编辑效率高，在3种基因组编辑工具中应用最为广泛，但是其对于靶位点的识别可以容忍几个碱基对的不匹配，这意味着某些靶位点可能存在着数千的潜在脱靶位点，所以会造成脱靶现象，进而对细胞产生遗传损害作用[65-67]。Upadhyay等[68]通过对小麦的肌醇加氧酶基因(Inositol oxygenase，INOX)，八氢番茄红素基因(Phytoene desaturase，PDS)的靶位点进行了筛选，发现在gRNA的近5'部分不匹配并不会完全破坏Cas9的编辑效率。Xie等[69]通过对水稻的PS3基因进行编辑时，对11个潜在的脱靶位点进行了分析，发现了一个被成功编辑的潜在脱靶位点。这对于CRISPR/Cas9应用于作物精准分子育种是非常不利的。目前主要有3种降低脱靶率的方法：一是改变野生型的Cas9酶活性中心的关键催化残基，使其由内切酶转化为切口酶，在靶位点使用两个毗邻的gRNA，能够显著的降低脱靶效应且不损坏其编辑效率[70-71]；而在单碱基突变的体系当中，Zhou等[72]通过把腺嘌呤编辑器(Adenine base editors7.10，ABE7.10)中的腺嘌呤脱氢酶148位的脯氨酸置换为精氨酸后，能够完全去除对RNA的脱靶效应，且并不会降低对靶位点DNA的编辑效率。二是通过在gRNA的5'缩短2-3 bp，同样能够降低脱靶效应[73]。三是通过在线工具如(http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)来指导设计靶位点，达到降低脱靶效应的目的[74]。Xie等[75]对几个重要的模式作物以及农作物的全基因组进行了分析，发现含有特异性的gRNA的转录单元数量达到了83.4%-98.6%。因此，大部分基因都可以通过精心挑选靶位点，来避免脱靶效应。另外，Cas9蛋白在细胞内的持续表达也会对细胞造成持续的损伤，Jiang等[76]对莱茵衣藻进行研究，发现Cas9蛋白的持续表达能够对莱茵衣藻产生毒害作用。在人体细胞中，通过注射gRNA和Cas9蛋白可以显著的降低Cas9蛋白对细胞造成的毒害作用[77]。目前，Cas9蛋白在马铃薯中的持续表达所造成的细胞毒害以及解决方法尚未见到报道。这就需要大量的实验来论证并克服Cas9蛋白对马铃薯的毒害作用，为基因组编辑技术应用于马铃薯的精准分子育种提供支撑。
总之，基因组编辑技术将会给马铃薯的精准分子育种提供一个重要的技术解决手段，使马铃薯的重要农艺性状如低SGAs含量、营养与品质、风味、对生物和非生物胁迫的抗性等得以进行精准的定向遗传改良。目前需要通过多组学手段，全面解析控制马铃薯重要农艺性状的代谢途径和关键基因，进一步开发精准高效的基因组编辑技术，并与常规育种方法相结合，以最终育成更多性状优良的马铃薯品种。
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