乳酸杆菌是一类对人体有益的微生物，通过定植在肠道上皮细胞，保护肠道免受病原微生物的侵害，常用于预防和治疗感染性腹泻，此外乳杆菌还有调节机体免疫功能、抗炎、抗氧化等功效[1]。利用益生菌代替抗生素治疗急慢性腹泻、便秘，保护肠道微生态平衡是治疗肠炎性疾病的新途径。临床常见的益生菌制剂如“金双歧”、“贝飞达”、“思连康”等已取得了良好的治疗效果[2]。临床应用最为广泛的两大类益生菌包括双歧杆菌和乳杆菌[3]。乳杆菌通过黏附在肠道内壁，并定植于肠道上皮细胞，降低肠道内pH，形成不利于病原微生物滋生的微环境，同时促进肠道黏膜的恢复，阻止病原微生物与肠上皮细胞的接触，从而抵御致病菌的侵袭[4-5]。研究表明，S-层蛋白是乳杆菌发挥益生功能的重要因子，S-层蛋白是细菌细胞壁的一种蛋白，分子量为40-200 kD，占细胞总蛋白的10%-15%。乳杆菌的S-层蛋白能够黏附于肠道上皮细胞，覆盖了病原菌与肠道上皮细胞结合的受体位点，从而抑制病原菌的黏附[6]。
Ren等[7]的研究表明，唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）可抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）对Caco-2细胞的黏附，当去除菌株的S-层蛋白后，抑制率由58%下降到4%；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的S层蛋白能够降解大肠杆菌表面的肽聚糖，进而抑制其对HT-29细胞的侵袭[8]。临床上使用益生菌制剂治疗细菌性肠炎已取得了良好的疗效，然而常规剂量的乳酸菌即使能定植于肠道其增值速度也很慢，难以覆盖整个肠道，大剂量的使用益生菌可能增加其移位的风险，引起不必要的炎症[9]，同时抗生素类药物也能影响益生菌制剂的疗效[10]，因此开发能够应用于临床的安全、稳定且不受抗生素影响的S-层蛋白制剂具有重要的意义。本研究提取获得嗜酸乳杆菌S-层蛋白，比较其对几种致病菌感染Caco-2的抑制效果，为后续开发该类产品提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、致病性大肠杆菌（Enteropathogenic escherichia coli，EPEC）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SAU）由本实验室保存。MRS培养基（北京陆桥技术股份有限公司）、盐酸左氧氟沙星（Sigma）、LiCl（Sigma）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、胎牛血清（杭州四季青有限公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 菌种的发酵培养和S-层蛋白的提取和纯化嗜酸乳杆菌的培养采用三级发酵培养法，取冻干菌种1支，接种于MRS培养基中，38℃厌氧培养16 h，按5%的接种量传代活化，连续传两代得到三级发酵液，梯度稀释，平板计数法测定发酵液活菌数。
三级发酵液4℃、8 000 r/min离心收集菌体，用PBS洗两次，加入5 mol/L的LiCl，37℃、200 r/min摇床孵育1 h，4℃、8 000 r/min离心收集上清液，放入20 kD的透析袋中4℃透析24 h，期间换液3次，聚乙二醇浓缩，得到S-层蛋白粗提物浓缩液。使用Sephadex G-75凝胶柱进行纯化，用pH7.0、0.025 mol/L的Tris-HCl作为流动相平衡凝胶柱，上样，流动相洗脱，流速0.5 mL/min，每5 min换管收集洗脱液，酶标仪280 nm处检测吸光度，收集洗脱峰，浓缩得到S-层蛋白溶液。
取S-层蛋白粗提物和S-层蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，计算蛋白分子量。BCA法测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作进行。
1.2.2 Caco-2细胞培养Caco-2细胞胰酶消化后接种于12孔板中，加入含10% FBS的DMEM/F12培养基，放置二氧化碳培养箱5% CO2、37℃静置培养。
1.2.3 不同浓度的S-层蛋白对致病菌的抑制作用选取致病性较强的大肠杆菌EPEC和金黄色葡萄球菌SAU为研究对象，考察不同浓度的S-层蛋白对两种菌的抑制作用。
Caco-2细胞用PBS清洗3次，加入细胞培养液，加入终浓度为1×108 CFU/mL的EPEC或SAU，放置二氧化碳培养箱37℃静置培养2 h，PBS清洗3次，加入细胞培养液，加入不同浓度（100、200、300 μg/mL）的S-层蛋白，以PBS为对照，放置二氧化碳培养箱37℃静置培养2 h，PBS清洗3次。加入终浓度为0.2%的Triton×100，反复吹打裂解细胞，保留菌体，梯度稀释与大肠杆菌显色培养基（鉴定EPEC）或金黄色葡萄球菌显色培养基（鉴定SAU）混匀，培养24 h平板计数，计算EPEC和SAU活菌数。
1.2.4 不同时间条件下S-层蛋白对致病菌的抑制作用同法考察EPEC或SAU侵袭Caco-2细胞0、1、2、4、6、8 h后，S-层蛋白干预2 h对EPEC或SAU的抑制作用。
1.2.5 嗜酸乳杆菌及S-层蛋白联合抗生素对致病菌的抑制作用同法考察在EPEC或SAU侵袭Caco-2细胞2 h后，1×108 CFU/mL的嗜酸乳杆菌或300 μg/mL的S-层蛋白联合抗生素（0.5%左氧氟沙星）干预2 h对EPEC或SAU的抑制作用。实验分组：（1）对照组；（2）嗜酸乳杆菌组；（3）S-层蛋白组；（4）抗生素组；（5）嗜酸乳杆菌+抗生素组；（6）S-层蛋白+抗生素组。
1.2.6 数据分析每组实验设4个重复，实验数据用SPSS 17.0处理，数据采用平均值±标准误差表示，组间比较采用t检验，P < 0.05和P < 0.01表示差异显著和极显著。
2 结果 2.1 嗜酸乳杆菌的培养及S-层蛋白的SDS-PAGE对嗜酸乳杆菌进行发酵培养，取三级发酵液显微镜下观察形态，结果（图 1-A）显示，菌体成短杆状，生长良好，可进行下一步实验。使用LiCl得到S-层蛋白粗提物，用Sephadex G-75凝胶柱纯化，并进行SDS-PAGE，结果（图 1-B）显示，在45 kD左右有清晰的条带，与文献中所描述的S-层蛋白分子量大小一致，且纯化后的S-层蛋白条带单一，可进行后续实验。
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| A：嗜酸乳杆菌显微形态1000×，标尺=10 μm；B：S-层蛋白粗提物和S-层蛋白SDS-PAGE电泳图 图 1 嗜酸乳杆菌的培养及S-层蛋白的SDS-PAGE |
如图 2-A所示，培养好的Caco-2细胞分别经EPEC或SAU处理2 h后，再用不同浓度（100、200、300 μg/mL）的S-层蛋白干预2 h，平板计数EPEC或SAU的活菌数。结果显示，S-层蛋白可明显抑制EPEC或SAU对细胞的黏附，且程浓度依赖性，其中300 μg/mL的S-层蛋白抑制效果最好，对EPEC或SAU的抑制率分别达到42.2%、31.7%，抑制率%=（对照组活菌数-干预组活菌数）/对照组活菌数×100%。
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| A：不同浓度的S-层蛋白对致病菌的抑制作用；B：致病菌作用不同时间条件下S层蛋白对致病菌的抑制作用（n=4，*/#P<0.05，**/##P<0.01，下同） 图 2 不同浓度的S-层蛋白和致病菌作用不同时间条件下的抑菌实验结果 |
如图 2-B所示，选取抑菌效果最好的300 μg/mL浓度的S-层蛋白，考察致病菌作用不同时间（0、2、4、8、12 h）后，S-层蛋白对EPEC或SAU的抑制作用。结果显示，S-层蛋白可明显抑制EPEC或SAU对细胞的黏附，且在致病菌侵袭短时间内干预效果明显，其中0 h，即EPEC或SAU与S-层蛋白同时加入对细菌的抑制作用最好，对EPEC或SAU的抑制率分别达到59.3%和48.4%。。
2.3 嗜酸乳杆菌及S-层蛋白联合抗生素对致病菌的抑制作用结果为了考察S-层蛋白对比嗜酸乳杆菌的抗菌效果，在EPEC（图 3-A）或SAU（图 3-B）作用Caco-2细胞2 h后，用嗜酸乳杆菌或S-层蛋白联合抗生素（0.5%左氧氟沙星）作用Caco-2细胞。结果显示，较对照组而言，嗜酸乳杆菌组、S-层蛋白组和抗生素组均可明显抑制EPEC或SAU对Caco-2细胞的侵袭，其中抗生素组的抑制效果最为明显。当联合用药后，嗜酸乳杆菌+抗生素组并没有显示出比抗生素组更强的抑菌效果，可能由于抗生素抑制了嗜酸乳杆菌的作用。S-层蛋白+抗生素组显示出比抗生素组有更强的抑菌效果，对EPEC和SAU抑菌率分别达到81.7%和78.3%，说明S-层蛋白可与抗生素联用，且效果优于单独使用抗生素。
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| 图 3 嗜酸乳杆菌及S-层蛋白联合抗生素对EPEC（A）和SAU（B）的抑制作用结果 |
近年来，利用乳杆菌对抗病原微生物的入侵已成为研究的热点，乳杆菌的黏附定植是其发挥作用的前提，定植后的乳杆菌可以和肠道上皮细胞作用，形成保护层，阻止病原微生物与肠道的接触黏附，从而减轻肠炎类疾病的发生。研究表明，S-层蛋白是乳杆菌黏附肠道细胞的关键蛋白[11]。Johnson等[12]的研究显示，从瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）中提取的S-层蛋白可以抑制出血性大肠杆菌O157：H7对上皮细胞的黏附；同样Golowczyc等[13]的研究表明，克菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir）通过其表面的S-层蛋白保护了肠道免受肠炎沙门氏菌的损伤。本研究考察了嗜酸乳杆菌S-层蛋白在不同浓度和时间条件下对致病性较强的EPEC或SAU侵袭Caco-2细胞的干预作用，结果表明S-层蛋白可明显抑制EPEC或SAU的侵袭。在比较了嗜酸乳杆菌与S-层蛋白联合抗生素对致病菌的作用后发现，S-层蛋白与抗生素联用表现出协同抗菌作用，而嗜酸乳杆菌与抗生素联用则表现出拮抗作用。目前上市的益生菌活菌制剂均采用干粉状态保存，进入人体后必须定植于肠道，并利用肠道内的营养成分生长才能发挥益生作用，而抗生素会抑制益生菌的生长，从而影响其功能。S-层蛋白则避免了这种弊端，这也是本研究首次证明了嗜酸乳杆菌的S-层蛋白可以和抗生素联用，起到协同效果。
S-层蛋白具有基因多样性，即不同来源的S-层蛋白具有不同的晶格结构和生物学功能，乳杆菌的S-层蛋白是其具有定植和黏附功能的主要蛋白[14]。研究表明，一些种属的乳杆菌S-层蛋白能够裂解革兰氏阳性菌细胞壁，如嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和卷曲乳杆菌[15]。干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）S-层蛋白能够显著抑制致病菌导致的HT-29细胞产生PGE2和NO。同时，能刺激HT-29细胞产生轻微的NF-ĸB核移位，也能一定程度上抑制S. sonnei引起的NF-ĸB核移位[16]。本研究显示嗜酸乳杆菌S-层蛋白与抗生素能够协同作用抑制EPEC或SAU，然而该菌的S-层蛋白是否有抵抗炎症的作用还有待进一步验证。S-层蛋白来源于安全性极高的乳酸菌，因此开发相关产品应用于临床具有较好的应用前景。
4 结论本研究证明了嗜酸乳杆菌S-层蛋白可浓度依赖性的抑制致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对Caco-2的侵袭，在致病菌感染初期干预最为有效，并且S-层蛋白与抗生素联用有协同抑菌效果，有望开发成为一种新型的抗菌药物。
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