花生四烯5-脂氧合酶基因（Arachidonate 5-lipoxygenase gene，ALOX5）编码产生含673个氨基酸的5-脂氧合酶（5- Lipoxygenase，5-LO）。5-LO是人体必需脂肪酸花生四烯（Arachidonic acid，AA）代谢途径中的关键酶之一，通过催化AA生成白三烯（Leukotrienes，LTs）^[1]。Chen等^[2-3]观察到ALOX5是建立BCR-ABL逆转录病毒介导的小鼠慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）模型的必需基因，运用DNA微阵列与实时荧光定量PCR技术检测到Alox5在白血病干细胞（Leukem stem cell，LSCs）中的表达显著上调，并伴有5-LO代谢产物白三烯B4（Leukotriene B4，LTB4）血浆浓度的升高，且Alox5表达上调不受酪氨酸激酶抑制剂imatinib的影响。Roos等^[4]在PML-RARa诱发的急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）小鼠模型中观察到5-LO抑制剂CJ-13，610呈剂量依赖性地抑制LSCs的存活、增殖和自我更新。上述研究结果提示ALOX5及其产物5-LO在髓系白血病的发生发展中扮演着重要角色，有望成为髓系白血病的一个生物标志物或治疗靶点。但目前对其功能及作用机制尚未完全阐述清楚。

规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）技术是一类高效经济的基因编辑技术^[5]，而传统的基因编辑手段，例如：锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）和类转录激活因子效应分子核酸酶（Transcriptionactivation-like effector nucleases，TALEN）因效率低、实验周期长及操作步骤繁琐等原因正逐渐被具有"魔剪"之称的CRISPR-Cas9技术所替代^[6]。CRISPR/ Cas9技术可以对基因组特定位点/片段进行靶向编辑，包括缺失（Indel）、修复（Repair）和替换（Replacement）等进行基因敲除/插入；鉴于该技术在动物研究中已得到应用^[7]，而且在植物研究中也被涉及，为农业中的育种、培育等过程提供了新的技术与思路^[8-9]。本文在CRISPR-Cas9骨架质粒pX458的基础上，建立敲除人源ALOX5基因的重组质粒，为后续基因功能及其机制研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究获得我院医学伦理委员会批准。pX458质粒来自于本研究所，长9.3 kb，携带氨苄抗性与GFP标签。293T细胞（人肾上皮细胞）系为本研究所冻存。DH5α感受态细胞、Loading Buffer、DNA marker、Gibco胎牛血清、BbS Ⅰ限制性内切酶、T7核酸内切酶、琼脂糖粉、质粒纯化试剂盒、T4连接酶、T4磷酸化酶（T4PNK）、无内毒素质粒大提试剂盒（离心柱型）、PBS缓冲液、高纯度质粒DNA小量试剂盒、转染试剂LipoFiterTM；DNA marker、成品LB培养基粉末、DMEM培养基、电泳所需试剂。

1.2 方法 1.2.1 sgRNA靶点选择及其寡核苷酸链的合成

从GenBank下载ALOX5基因序列（NG_011437）），基于美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，www.jax.org）制备的ALOX5^-/-小鼠是敲除ALOX5外显子6，本研究针对ALOX5外显子6在sgRNA设计网站设计3对sgRNA（表 1），由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司合成。鉴定pX458-sgRNA重组质粒用U6通用引物进行测序，测序引物为F5′-atggactatcatatgcttaccgta-3′；R5′-atcaagtgtatcatatgcca -3′。

1.2.2 构建重组真核表达质粒pX458-sgRNA

分别将合成的6条单链寡核苷酸sgRNA经退火形成二聚体，用T4多聚核苷酸激酶将寡核苷酸退火产物双链sgRNA连接到经BbSⅠ酶切后的pX458载体中，再将连接产物转化到DH5α感受态中，摇菌过夜后，将其涂于含有氨苄抗性的平板上，次日挑取单克隆进行测序，明确二聚体sgRNA是否与载体pX458正确连接。

1.2.3 293 T细胞的培养、转染

将空载体以及构建的pX458-sgRNA重组质粒分别转染293T细胞，并在37℃、5%CO2培养箱中培养24-72 h，在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。

1.2.4 提取转染细胞基因组DNA

用基因组DNA提取试剂盒提取转染细胞基因组DNA，核酸定量仪确定DNA的纯度与浓度，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳检测，其余保存于-80℃冰箱备用。

1.2.5 PCR扩增sgRNA靶点附近的核苷酸片段

PCR扩增引物为F5′-TGGGCTGAAGGACCTGAGT-3′，R5′-CCGCAATTCCTCCTCTGAT-3′；体系为20 μL，含2× Taq PCR MasterMix 10 μL，25 μmol/L上游、下游引物各0.25 μL，模板DNA 1 μL，扩增条件为95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s，32个循环；72℃充分延伸10 min，4℃保存。用PCR产物直接测序法验证pX458-sgRNAs对ALOX5基因的敲除效果。

1.2.6 统计学分析

数据以x±s表示，用EXCEL软件处理，用DNAStar软件对测序结果进行分析。

2 结果 2.1 pX458-sgRNA质粒的酶切

pX458质粒经过BbsⅠ酶切后，观察到酶切后pX458质粒的条带大小正确（图 1）。

2.2 pX458-sgRNA载体的构建

将sgRNA二聚体与酶切后pX458质粒连接，转化感受态细胞DH5α的菌落送铂尚生物技术有限公司测序，结果（图 2）显示gRNA-1、gRNA-2序列插入正确，提示二聚体sgRNA与pX458质粒成功连接，pX458-sgRNAs-ALOX5重组质粒构建成功。

2.3 重组质粒转染的效果

在倒置荧光显微镜下观察到pX458-sgRNAs-ALOX5重组载体转染293T细胞后有绿色荧光（图 3），在转染24 h，将5个高倍镜视野中转染阳性细胞数量与接种细胞数量比较，转染阳性率约为50%。

2.4 一代测序法检测sgRNA的靶向敲除效果

PCR扩增产物直接测序法获取EXON 6 sgRNA靶点附近的核苷酸序列，与野生型基因组进行比对分析，未检测到EXON 6 sgRNA对目标基因组核苷酸序列发生切割。

3 讨论

在以逆转录病毒作为载体构建的BCR-ABL诱发小鼠CML模型中观察到，敲除ALOX5基因影响小鼠CML模型的建立，与其发挥清除白血病干细胞的作用有关^[2]。在PML-RARa诱发小鼠AML模型中也观察到，5-LO在AML中扮演着重要角色^[4]。但ALOX5基因及其编码产物5-LO在髓系白血病中的功能及其作用机制尚未阐述得十分清楚。

ALOX5基因位于染色体10q11.2，由71 937个碱基对组成（NG_011437），有14个外显子和13个内含子，编码产生含673个氨基酸的5-脂氧合酶（5- Lipoxygenase，5-LO）。5-LO广泛存在于组织细胞中，主要在中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞中表达^[10]。5-LO在生理状态下表达量少，在病理情况时表达上调，并且与疾病的发生、发展有关^[11]。已有研究表明，5-LO直接参与许多的肿瘤发生、发展，如肝癌、肺癌、前列腺癌及结肠癌^[10-13]。研究提示5-LO与肿瘤的增殖、转移、侵袭、凋亡过程有关，参与了多个信号通路的调控，对多个基因如P53、血管内皮生长因子（Ascular endothelial growth factor，VEGF）等的表达起关键的调控作用^[14]。

在白血病中，5-LO抑制剂能抑制恶性血液肿瘤细胞系的增殖^[15]。Rådmark等^[16]报道，5-LO在HL-60、THP-1细胞中表达量与活性增加。Lo等^[17]发现在矮小相关转录因子1（Runt related transcription factor 1，RUNX1/ETO，）即RE9a融合基因形成的小鼠AML模型中，通过微阵列与染色质免疫共沉淀-芯片（Chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-chip）技术分析发现Alox5是疾病相关的靶基因，且Alox5的表达水平显著上调。Woessner等^[18]发现利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术沉默ALOX5基因，再联合BCR-ABL蛋白的卷曲螺旋结构域突变体，粘蛋白1抑制剂GO-201，或自噬抑制剂氯喹均能有效清除人髓系白血病K562细胞中的LSCs、抑制K562细胞增殖以及促进细胞死亡。上述研究提示，ALOX5表达上调与髓系白血病密切相关，但机制尚不十分清楚。在BCR-ABL逆转录病毒介导的小鼠CML模型中证实，敲除ALOX5基因与清除LSCs有关。Roos等^[4]报道，5-LO抑制剂CJ-13，610可抑制AML源LSCs的增殖能力，且与抑制剂浓度呈正相关，而对正常HSCs无明显影响。已有研究表明，Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路是髓系LSCs存活与自我更新所必需的，ALOX5调控β-catenin、转录因子GATA-1的表达^[19-20]，但对ALOX5基因的功能及作用机制了解甚少。雒钰杰等^[21]通过构建pGenesil-1-shRNA-Alox5重组质粒，转染白血病细胞K562/ADM，利用慢病毒载体携带shRNA敲低ALOX5的表达后，检测到BCR-ABL在基因、蛋白水平的表达量显著降低、细胞凋亡率显著增加。

基于CRISPR/ Cas9技术能高效、经济地敲除/插入基因^[22]，本研究利用该技术将靶向人ALOX5基因第6外显子的sgRNA插入携带绿色荧光蛋白（GFP）标记的PX458^[23]，构建pX458-sgRNAs-ALOX5重组质粒。sgRNA的设计普遍共识是选择靶基因的第1、第2外显子区域，但基于ALOX5基因敲除（ALOX5^-/-）小鼠是在第6外显子，本研究在ALOX5基因第6外显子区域选择sgRNA靶点。将3对sgRNA分别与pX458进行连接后，转化感受态细胞DH5α，测序提示2对sgRNA插入序列正确，将成功构建的重组质粒pX458-sgRNAs转染到293T细胞中24 h，在荧光显微镜下观察到转染成功的细胞有GFP表达，转染阳性率约为50%；但分析转染组细胞中sgRNA靶点附近的核苷酸序列，发现sgRNA对靶点附近核苷酸序列未发生切割；其原因可能是sgRNA脱靶；另外，可能与检测敲除效果的方法有关，用PCR扩增未经筛选的转染组来源的模板DNA，其含有未转染成功的细胞基因组，因而PCR扩增产物经一代测序法获取的核苷酸序列中，发现sgRNA切割的核苷酸序列的机率降低。

4 结论

本研究应用CRISPR/ Cas9技术成功构建敲除人源ALOX5基因第6外显子的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5，为后续在白血病细胞系如K562、MEG-01、KA-1/A3中建立ALOX5基因敲除细胞模型奠定了理论基础和技术平台。