鸡肠道中寄生着数量庞大且复杂多样的微生物, 参与了鸡体的正常生理代谢与发育过程, 既影响着饲料消化、营养物质吸收和能量供应, 又调控着宿主正常生理功能及疾病的发生与发展。正常稳定的微生物区系也是广义肠道健康的重要组成, 在肠道结构形态发育、免疫功能调节、抵御外源致病因子侵袭等方面发挥了重要的积极作用[1]。另一方面, 微生物由于参与胺类物质生成、胆汁盐分解等, 而对鸡体代谢产生不利影响[2]。虽然肠道菌群的重要性已得到充分认识, 但如何通过营养干预措施调控微生物区系结构与功能, 实现鸡体的健康和养分高效利用?这是目前运用微生态营养调控手段改善宿主代谢及健康面临的重要实际问题。为了找到理想的干预措施, 有必要深入地了解家禽不同生理阶段肠道微生物的组成特点及演替规律。在此基础上, 通过锁定关键菌群和代谢途径并与外部因素关联, 进一步探明微生物的作用及其与宿主代谢之间的互作, 将有助于找到调控靶标、应用于生产[3-4]。其中, 鸡微生物定植及区系形成的早期阶段是目前研究调控措施的热点之一。早期微生物定植阶段也是雏鸡肠道及免疫系统发育的关键时期。卵生鸟类在最初的微生物区系形成上不同于哺乳动物, 鸡早期肠道微生物区系的系统研究也相对较少。因此, 本文就鸡消化道微生物组成、肠道微生物组成演替阶段、早期定植及调控等方面进行综述并总结了最新研究进展, 旨在为研究和应用提供参考和借鉴。
1 鸡肠道微生物组成家禽消化道微生物由大量的革兰氏阳性菌组成, 以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)为优势菌群。由于食糜停留时间较短, 鸡肠道微生物的数量和多样性明显低于脊椎动物。Wei等[5]对公共数据库中3 184个鸡(肉仔鸡、蛋鸡)肠道微生物的16S rRNA序列进行分析, 将其分为915个操作分类单元(Operational taxonomic units, OTUs), 归为13个门, 117个属; 其中, 厚壁菌门(Firmicutes, 70%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 12.3%)、变形菌门(Proteobacteria, 9.3%)的丰度约占全部序列的90%以上, 以梭菌(Clostridium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)和拟杆菌(Bacteroides)为优势菌属。其他低丰度的菌门有放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻细菌门(Cyanobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes), 互养菌门(Synergistetes)、梭杆菌门(Fusobacteria), 软壁菌门(Tenericutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)等。
鸡消化道中微生物的数量由前到后依次增加。嗉囊和肌胃内容物的菌群数约为103-104 CFU/g, 十二指肠和回肠食糜分别为105 CFU/g和108-109 CFU/g, 盲肠食糜和泄殖腔内容物约为1011-1012 CFU/g[2]。其中, 厚壁菌门丰度最高也较稳定; 其次是拟杆菌门。18日龄肉仔鸡嗉囊、回肠和盲肠微生物区系中, 厚壁菌门的丰度约为60%, 而拟杆菌门丰度由14%增加到30%[6]。鸡嗉囊中的乳杆菌(Lactobacillus)多样性最丰富, 丰度约为28.62%[6]。乳杆菌属作为嗉囊中的优势菌群, 可能主要参与了淀粉降解和乳酸的产生。此外, 嗉囊中还有梭状芽孢杆菌(Clostridiaceae)。肌胃中也是以梭状芽孢杆菌和乳酸杆菌(Lactobacillaceae)为优势菌群, 但由于肌胃的酸性环境, 菌群丰度及发酵能力相对比较弱[7]。小肠中乳杆菌属是优势菌群, 相对丰度可达70%, 其他还有肠球菌(Enterococcus)和多种梭状芽孢杆菌[6]; 十二指肠和空肠pH值较低, 所含细菌种类和数量相对较少, 乳杆菌属丰度约为99%[8]。
回肠和盲肠是目前鸡消化道微生物研究报道最多的部位。与嗉囊和盲肠微生物组成相比, 回肠中厚壁菌门的相对丰度最高, 普雷沃氏菌属(Prevotella)的丰度也高于其他部位[6]。回肠是营养物质吸收的主要部位, 菌群的组成可能会影响营养物质的吸收和利用。将菌群丰度与肉仔鸡体重关联分析发现, 回肠中一些低丰度的菌属, 如链球菌属(Streptococcus, 丰度约为1.11%)和阿克曼属(Akkermansia, 丰度约为0.04%)与体重显著负相关[6]。进入盲肠内, 细菌的种类和数量明显增多, 可能与食糜停留时间最长有关[9], 主要菌属有梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus), 粪杆菌属(Faecalibacterium)和乳杆菌属等; 其他丰度大于1%的菌属还有乳杆菌、布劳特氏菌(Blautia)、巨单胞菌属(Megamonas)、罗斯氏菌属(Roseburia)和韦荣氏球菌属(Veillonella)等[5]。拟杆菌门的代表菌属为拟杆菌属(Bacteroides), 约占拟杆菌门丰度的40%。变形菌门中, 主要有脱硫盐菌属(Desulfohalobium)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)等[5]。结合盲肠的生理功能, 厚壁菌门和拟杆菌门作为优势菌群, 很可能在利用尿酸氮重循环、必需氨基酸的生成、非淀粉多糖的消化和短链脂肪酸的生成中发挥了重要作用。
2 鸡肠道微生物区系演替阶段及特点鸡肠道微生物组成并不是静态的。不同遗传背景、日粮模式, 以及消化道不同位置中的微生物组成存在较大差异, 并且随宿主年龄呈现一定的时空变化。肉鸡和蛋鸡具有不同的遗传背景和生理特点, 虽然二者微生物区系的比较少有报道, 但肠道形态、结构及免疫上的差异可能会对微生物区系产生较大影响[10]。肉仔鸡的微生物区系(粪便)演替过程大致可分为3个阶段, 第一阶段以垂直传播或快速定植的菌群为主, 包括链球菌(Streptococcus)和志贺氏菌或大肠杆菌; 第二阶段从出壳后4日龄开始, 以毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的快速增长为特征; 第三个阶段从10日龄开始, 部分梭菌被替代并出现芽胞杆菌目(Bacilliales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、假单胞杆菌目(Pseudomonadales)等丰富多样的微生物[11]。14日龄后, 肉仔鸡肠道微生物区系逐渐成熟, 15-22日龄可能是微生物区系发育成熟的过渡阶段[12-13]。以罗曼褐品系蛋鸡为例, 观察整个生产周期(1-60周龄)盲肠微生物的演替过程, 通过聚类分析可将其分成4个阶段。第一阶段是孵化出壳后第1周, 主要以高丰度的变形菌门(Proteobacteria)及其所属的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为特征。第二阶段是出壳后2-4周, 盲肠微生物中占绝对优势的是厚壁菌门的毛螺旋菌科和瘤胃球菌科。前两个阶段在微生物组成结构上比较相似, 主要区别是菌群的种类和丰度。第三阶段是从2-6月龄, 盲肠中厚壁菌门丰度增加, 拟杆菌门丰度相应降低, 直至7月龄两个菌门丰度比例达到稳定。7月龄及之后产蛋中后期, 是盲肠微生物区系演替的第四阶段, 以相对稳定的厚壁菌门和拟杆菌门丰度比例为特征[14]。
肉仔鸡和蛋鸡肠道微生物区系演替的前两个阶段极其相似, 共同点都是先以垂直传播或快速定植的肠杆菌科为特征菌群, 随后以毛螺旋菌科和瘤胃球菌科的快速增长为特征[11]。因此, 鸡肠道微生物演替的总体趋势可能是一致的, 由最初兼性厌氧菌为主要构成的简单区系逐渐过渡到包括专性厌氧菌在内的更加稳定、平衡的微生物区系[11, 13, 15]。另外, 微生物区系的演替也呈现出与宿主生长发育和饲养阶段的同步性。肉仔鸡微生物区系演替的前两个阶段分别是出壳后的1-3日龄和4-9日龄, 远远快于蛋鸡的演替过程, 这可能与其肠道快速发育的特点有关[10]。实际生产中, 肉仔鸡生长发育较快, 饲养周期相对较短。蛋鸡的养殖周期相对较长, 约为60周以上。根据盲肠微生物区系结构划分的前两个演替阶段[14], 恰好是蛋鸡免疫和消化道系统发育的关键时期, 对应蛋鸡饲养的育雏阶段。微生物区系演替的第三个阶段是蛋鸡的开产阶段, 肌肉、骨骼和繁殖系统等进行着巨大的生理转变。而第四个阶段对应的是产蛋高峰及后期阶段, 此时鸡体发育成熟, 而微生物区系组成也相对稳定。
鸡肠道微生物区系的演替与宿主不同阶段的生理代谢特点密切相关。肉仔鸡和蛋鸡肠道微生物区系演替的前两个阶段是微生物组成变化最为急剧的阶段, 以变形菌门及其所属的肠杆菌科丰度的迅速降低为特征。蛋雏鸡出壳后第1天, 盲肠中变形菌门丰度接近50%, 1周和2周后丰度分别降至21%和10%, 厚壁菌门的毛螺旋菌科和瘤胃菌科的丰度增至90%[14]。新生家禽肠道中短暂出现的高丰度肠杆菌科可能不是为了定植, 而是参与肠道免疫系统发育[9]。变形菌门及其所属的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)也是新生儿及新生哺乳动物肠道中的优势菌群[16]。另外, 对于新出壳的家禽, 由于体内有限的碳水化合物供应, 卵黄脂质的有氧氧化成为机体能量供给的主要途径[17]。高丰度的肠杆菌科可能与其较弱的碳水化合物利用和代谢能力有关[18]。
随后在家禽快速生长阶段, 厚壁菌门成为肠道优势菌群。丁酸是厚壁菌门的主要代谢产物, 也是后段肠道细胞首选能量来源。高丰度的厚壁菌门可能是为了满足肠道发育或宿主对能量的大量需求[18]。其中毛螺旋菌科和瘤胃菌科的相对丰度与鸡只饲料转化效率高度相关[19]。拟杆菌门通过利用复杂的多糖产生丙酸和丁酸, 也能为宿主肠道提供能量。随着肠道微生物区系逐渐复杂和成熟, 拟杆菌门出现直至与厚壁菌门丰度达到一定比例, 表明微生物的供能由主要依靠厚壁菌门产生丁酸这一途径逐渐过渡到两种途径的平衡, 这可能也是适应肉仔鸡或蛋鸡生长放缓的生理需求[18]。此外, 厚壁菌门的特征之一是能够表达L-岩藻糖异构酶, 而拟杆菌门表达的是木糖异构酶。肠道黏液中岩藻糖基化或木糖基化蛋白多糖因部位或宿主年龄的特异性表达, 可能是宿主选择微生物定植的条件之一[13, 18]。家禽肠道微生物区系组成还受到宿主肠道内环境的影响, 如肠道pH、气体(氧气、二氧化碳和氢气)、渗透压、底物、细菌代谢物和黏膜抗体产生[20]等因素。
3 鸡肠道微生物早期定植出生后肠道微生物的快速定植是肠道免疫程序化, 以及先天性和获得性免疫系统发育成熟的重要驱动因素[21]。早期研究认为, 初生健康雏鸡消化道通常是无菌的, 通过与环境的接触才开始建立起一个简单的微生物区系。近年来, 研究者利用高通量测序技术在胚龄为4 d和19 d的胚蛋中检出了丰富的微生物菌群[22], 包含28个门和162个属。其中, 优势菌属为变形菌门的盐单胞菌属(Halomonas), 丰度占比高达79%;其次为苍白杆菌属(Ochrobactrum), 丰度为5%[22]。家禽初期肠道微生物区系建立的一项研究显示, 在科水平, 鸡胚与雏鸡肠道菌群组成(相关系数0.40)、鸡胚与母鸡粪便菌群组成(相关系数0.52)之间均有中等程度的关联, 说明鸡胚细菌部分来源于母鸡。另一项研究报道, 母鸡(韩国商业品系)输卵管微生物区系主要由厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门构成, 核心菌属为假单胞菌(Pseudomonas)、乳酸杆菌、巨单胞菌和拟杆菌[23]。其中, 变形菌门的假单胞菌属在鸡胚盲肠微生物区系中丰度最高[23], 但存在原因和具体作用还不清楚。对于之前所报道的鸡胚核心菌属——盐单胞菌属, 在该项研究中只在个别鸡胚蛋清和鸡只输卵管中观察到, 并且丰度较低(0.02%-0.04%)[23]。尽管在鸡胚、输卵管的核心菌群方面还需要进一步的研究和验证, 但目前一致认为, 最初的肠道微生物定植发生在雏鸡出壳前, 母鸡是鸡胚微生物的重要来源[22-23]。雏鸡盲肠微生物组成在出壳第1天时个体差异最大, 随着区系演替, 个体差异逐渐减小[24], 说明母源性微生物对雏鸡早期肠道微生物区系形成的重要性。进一步研究发现, 鸡胚中的微生物几乎全部来自于母鸡泄殖腔和输卵管, 并且母鸡输卵管菌群可能是通过蛋清转移到胚胎中[23]。微生物从母鸡输卵管传递到胚胎似乎具有选择性。例如, 母鸡输卵管膨大部的乳酸杆菌很难转移到鸡胚中[23], 而沙门氏菌、大肠杆菌、弯曲杆菌(Campylobacter)等致病性微生物可以垂直传播[25]。关于胚内微生物随着肠道发育如何在肠道定植有待进一步研究。一种推测, 微生物可能是随着胚胎对羊水的吸收进入胚内肠道; 另外, 也可能是在胚胎发育后期, 通过卵黄囊的吸收途径进入肠道[26]。
4 鸡早期肠道微生物区系的调控 4.1 鸡肠道微生物区系调控的窗口期通过营养干预措施可调控肠道微生物区系结构与功能, 而微生态营养的调控是否存在最佳时期或生产中何时采取干预措施, 是运用调控手段时需要考虑的一个重要问题。有研究者提出, 肉仔鸡肠道微生物干预的最佳时期是出壳前后及出壳后第1周[11, 24, 27], 以及14-21日龄[11]或20-30日龄[12]。Kogut等[28]提出干预的4个窗口期, 一是肉仔鸡孵化期和最初采食的早期阶段; 二是换料阶段, 如14日龄和28日龄左右更换阶段料; 三是撤料时, 准备运输进行屠宰加工阶段; 四是肠道菌群紊乱或失调时期。虽然蛋鸡上还未有相似的研究报道, 但从上述肉仔鸡的报道可以看出, 调控的窗口期是针对肠道微生物区系演替的关键阶段, 共同特点是肠道微生物区系的不稳定性。
家禽早期微生物区系抵抗力和稳定性较弱, 可能对后期生长和生产造成不可逆的损伤[29]。实际生产中, 新生雏鸡通常不与母鸡直接接触, 而早期简单的微生物区系不利于对病原菌的排斥。由最初的简单微生物区系向成熟区系的过渡转变阶段, 雏鸡免疫系统也未发育完全, 极易感染沙门氏菌、大肠杆菌等细菌性疾病[20, 27]。早期肠道微生物区系的多样性和稳定性也与宿主生长和健康状况直接相关。在野生大山雀雏鸟的试验中发现, 微生物区系多样性较高的个体, 出壳后两周内的体重和体增重也越大[15]。另外, 肠道微生物区系一旦建立并达到平衡, 由于菌群多样性和功能的冗余性, 营养调控措施的作用将会受限于微生物区系的复原性(Resilience)和稳定性[28-29]。因此, 家禽微生物定植及区系形成的早期阶段是目前研究调控措施的热点, 主要目标是加快肠道微生物区系的成熟和稳定, 提高抵抗病原体感染的能力。
4.2 鸡早期肠道微生物区系的调控目前已报道的调控措施大致有两类, 一类是尽早饲喂明确或特定的益生菌、益生元或生物活性物质, 如植物提取物、丁酸钠等。已有大量研究报道, 可通过饲喂益生菌、益生元、植物提取物、有机酸等改变家禽肠道微生物组成, 促进肠道发育和增强雏鸡的抗病力[2, 30]。这也是在实际生产中应用最为广泛的微生物区系调控措施。据统计, 目前美国在售益生元产品有50余种, 可直接饲喂的益生菌产品多达130种[28]。需要注意的是, 在评价这些物质对肠道微生物区系的影响时, 仅根据局部某一菌群丰度的改变显然是不够的。蛋雏鸡(白来航品系)出壳后饲喂含乳酸菌(L. acidophilus, L. casei)和双歧杆菌(B. bifidum)等在内的益生菌组合, 虽然增加了14日龄盲肠乳杆菌属和28日龄瘤胃球菌科的丰度, 但对整个盲肠微生物组(Microbiome)功能的影响很有限[3]。有研究者提出"肠道微生物区系成熟指数(Intestinal microbiota maturation index)"的概念, 通过定量微生物区系达到完全成熟所需的时间, 来评价饲喂益生菌对肠道微生物区系成熟速度的影响[31]。通过该方法, 研究认为饲喂乳杆菌(L. plantarum strain)加速了肉仔鸡(科宝500)肠道微生物区系的成熟, 抗生素(盐霉素和金霉素)的使用延缓了肠道微生物区系的成熟[31]。但蛋雏鸡上的一项研究认为, 益生菌饲喂并没有使盲肠更快地演替为以厚壁菌门为优势的微生物区系[3]。早期益生菌的饲喂可能是持续作用于肠道微生物区系的演替, 而非局限于某一益生菌群的定植[32]。更多的研究显示, 饲粮处理对肠道微生物区系的影响小于家禽日龄的影响, 尤其在出壳后一周内, 即家禽日龄可能是肠道微生物区系变化的主要驱动因素[3, 33-34]。
另一类是将健康供体鸡只肠道菌群或菌群发酵培养物通过接种等方式传递给受体雏鸡, 如粪菌微生物移植(Facel microbiota transplantation)、早期母子接触等。这类措施是考虑到子代肠道微生物可能更易受母鸡的影响, 基于菌群相互作用, 将整体微生物区系或(及)其代谢物提供给雏鸡。当雏鸡出壳后与母鸡仅仅接触24 h, 母鸡肠道微生物就能有效地传递给雏鸡, 雏鸡盲肠中来源于母鸡的菌群大约占微生物组成中的50%[20]。但受试菌群组成或发酵培养物成份往往较复杂, 在实际应用时面临的一个问题是组分的控制和贮存。Gong等[24]体外发酵成年肉仔鸡(180日龄)盲肠内容物并灌喂给新出壳雏鸡, 发酵液中包含有25个门、465个属的微生物。雏鸡灌喂后, 1日龄和3日龄时盲肠中潜在致病菌(Escherichia-Shigella)的丰度降低, 拟杆菌门成为优势菌的速度加快[24]。也有研究者根据生产性能指标对供体鸡只进行了筛选, 将饲料转化效率较高个体的菌群接种于雏鸡(科宝品系), 结果显示5周后盲肠瘤胃球菌、乳杆菌, 以及未分类的梭菌丰度增加, 并且肠道通透性、发育、免疫等指标均观察到了积极作用, 但受体鸡只的饲料转化效率并没有改变[35]。因此, 能否达到预期效果及如何保证效果的稳定性也是在实际生产中需要考虑的一个问题。此外, 菌株的传递差异也是影响效果的一个不确定因素。新出壳蛋雏鸡(伊莎褐品系)接种不同周龄(1-42周)母鸡盲肠微生物, 弯曲杆菌、螺杆菌(Helicobacter)、黏液杆菌(Mucispirillum)和巨单胞菌等菌属在受体雏鸡盲肠中的丰度均高于供体母鸡, 但梭杆菌(Fusobacterium)、甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、理研菌属(Rikenella)等不易传递[18]。类似地, 新出壳蛋雏鸡(伊莎褐品系)与供体母鸡(罗曼褐品系)接触后, 只有拟杆菌门、放线菌门、Selenomonadales目、粪杆菌属(Faecalibacterium)能有效地从母鸡传递到雏鸡, 未观察到乳杆菌(Lactobacilli)、梭菌目(Clostridiales)以及其他厚壁菌门微生物的传递。由此推断, 雏鸡肠道中乳杆菌属、毛螺旋菌以及瘤胃球菌科可能来源于环境而不是母鸡[20]。母鸡和子代雏鸡间微生物传递的选择性也为益生菌种的筛选和开发提供了参考。有学者提出, 既产丁酸又产生孢子的菌属, 如Anaerostipes、Anaerotruncus和Subdoligranulum等, 可能是饲喂新生雏鸡的潜在益生菌[18]。
鸡胚给养(in ovo feeding)是一种将干预时间点提前到胚胎孵化阶段的超早期调控措施。肉仔鸡出壳前的孵化阶段约占其整个生命周期的1/3, 孵化阶段同时也是肠道发育和微生物定植的初始阶段。通过胚蛋注射手段, 为胚胎发育提供外源益生类物质, 如乳酸菌[27]、低聚半乳糖[36]、乳杆菌和寡糖组合[37]等能够增加鸡肠道中有益菌的丰度, 减少早期肠道病原菌的定植, 促进肠道免疫的发育。此外, 胚蛋注射来自成年鸡个体的竞争性排斥培养物(Competitive-exclusion product), 也能够增加雏鸡肠道菌群的多样性及益生菌的丰度, 使肠道微生物区系更加成熟[38]。值得注意的是, 益生元和益生菌的作用途径可能是不同的。胚胎发育第12天, 通过气室同时注射低聚半乳糖或Lactococcus lactis subsp., 3 d后观察到低聚半乳糖可通过血液循环进一步作用于发育中的肠道; 而益生菌停留在气室中, 直到19胚龄啄壳时才有可能植入雏鸡肠道[39]。Siwek等[39]提出, 胚龄12 d时尿囊绒毛膜血管较丰富, 可能是益生元、合生元等生物活性物质的最佳注射时间点。其次, 由于肠道微生物区系的多样性, 只注射一种或少量益生菌作用有限, 可能无法为宿主提供预期的保护[40]。雏鸡出壳后2日龄攻毒肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis), 并未观察到鸡胚注射乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus salivarius)的保护作用[41]。另外, 接种竞争性排斥培养物可能引入未知的有害菌, 对胚胎健康发育具有潜在危害[40]。
5 总结与展望近十几年来, 家禽肠道微生物的研究取得了很大进展, 包括肠道微生物区系的组成特点, 以及日粮营养、宿主遗传背景、环境等对微生物群落结构的影响[42]。基于16S rRNA的高通量测序技术的普遍应用极大地提高了肠道微生物研究的覆盖率和准确性, 但报道的微生物区系组成具有很大的变异性。即使相似的试验设计, 微生物区系的研究结果相差也很大, 可比性较差[43]。一方面, 鸡只个体间有较大差异; 另一方面, 测序费用相对较高, 大多数研究可能局限于一次试验观察或者较少的样本量。由于个体数量、时间点数量在统计上的不足, 鸡肠道微生物区系时空演替规律还未充分阐释清楚。如何做到肠道微生物区系数据的有效积累, 这对我们更加深入认识微生物区系结构和功能的动态变化十分重要。此外, 鸡肠道微生物的研究目前主要集中在组成层面的分析, 关于微生物功能的信息还非常有限, 包括随宿主年龄的演替有什么功能, 以及干预措施引起的肠道菌群变化有什么作用等。研究方法也多限于微生物种类与表型相关性分析与推测, 有待下一步的模型验证和机理解析。随着新的分析技术的应用, 我们对鸡肠道微生物区系的认识仍将快速发展, 但这一认识的实际应用还处于初级阶段。根据功能对微生物的分类可能比单纯的生物学种属分类对家禽生产更有价值。多组学技术手段的联合应用, 结合基因组学、免疫学和生理学, 将有可能阐明"健康"肠道微生物区系的定义, 在提出创新性的肠道微生态干预策略方面取得突破。
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