天然橡胶（Natural rubber，NR）是植物类异戊二烯代谢途径中一种重要的次生代谢产物，其弹性、延展性、散热性等性能都优于合成橡胶。因此，NR作为一种重要的能源物质，在国民经济和国防建设中有至关重要的作用。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是NR原料的主要来源，但存在种植地域局限性、真菌易感性及收割工作的繁琐性等问题。为满足天然橡胶逐年上升的需求量，各国政府和跨国公司都将寻找NR替代资源列入战略计划中[1]。
在已探明的2 500多种产胶植物中，橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）和银色橡胶菊（Parthenium argentatum L.）产胶的相对分子质量较大，能够满足工业应用需求。其中，橡胶草适应性强、生长周期短、适合机械化种植和采收，是理想的天然橡胶替代资源，具有极高的开发价值；又因其基因组相对简单，遗传转化与基因编辑较为容易，可作为科学研究的模式植物。李家洋研究组运用PacBio单分子实时测序技术（SMRT）组装完成了高质量的橡胶草基因组草图，为天然橡胶研究奠定了坚实的基础[2]。
橡胶粒子是天然橡胶生物合成与贮存的重要场所，根据其直径的不同可分为小橡胶粒子（Small rubber particles，SRPs）和大橡胶粒子（Large rubber particles，LRPs）。橡胶粒子的膜蛋白，如橡胶转移酶（Rubber transferase，HRT）、橡胶延伸因子（rubber elongation factor，REF）和小橡胶粒子蛋白（SRP protein，SRPP），是橡胶生物合成的关键酶或蛋白因子[3-6]。所有的REF和SRPP蛋白都有一个REF保守结构域，不同的是大部分SRPPs家族成员位于SRPs，SRPPs蛋白家族N端较短，且有一个可变C端。橡胶草基因组共编码五个TkSRPP蛋白，相关研究表明，TkSRPP3、TkSRPP4和TkSRPP5基因在胶乳中的表达量较高[7]。通过抑制TkSRPP3基因的表达，橡胶草根中的乳胶含量和橡胶相对分子质量均显著降低[8]。由此可见，SRPP在维持橡胶粒子稳定和天然橡胶合成等方面都有重要作用。
SRPP基因在橡胶树乳管细胞中高水平表达，SRPP是催化和调控橡胶生物合成的重要蛋白因子[9]。为探究SRPP2蛋白在橡胶草中的作用，本研究通过提取橡胶草RNA，反转录得到橡胶草cDNA全长，克隆橡胶草小橡胶粒子蛋白（SRPP2）基因，并命名为TkSRPP2。运用生物信息学的方法对该基因序列进行同源性分析、亚细胞定位预测、蛋白质结构预测，构建细胞融合表达载体，并进行烟草亚细胞定位预测，为深入研究TkSRPP2基因的功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料新疆野生型（Wild Type，WT）橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）无菌苗由石河子大学农业生物技术重点实验室培养。
1.2 方法 1.2.1 TkSRPP2的克隆利用李家洋课题组公布的橡胶草基因组数据，运用Primer Premier 5.0设计TkSRPP2基因引物，用TkSRPP2-F和TkSRPP2-R（表 1）；以橡胶草cDNA为模板，克隆橡胶草TkSRPP2基因。PCR体系：10 μL Mix；8 μL ddH2O；1 μL cDNA；0.5 μL TkSRPP2-F；0.5 μL TkSRPP2-R。PCR反应程序：94℃预变性1 min；94℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸60 s，35个循环。
利用NCBI中的Blast数据库，获得15条相似度较大的CDS序列，利用MTGA7.0对所得序列进行聚类分析并构建系统进化树。利用Vector NTI Advance 11获得TkSRPP2基因的氨基酸序列，使用在线生物软件ExPASY ProtParam tool、SOPMA secondary structure prediction、SWISS-MODEL等在线软件分析其蛋白质理化性质并构建其三维蛋白模型。利用SignalP3.0Server（http://http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）预测信号肽，使用在线软件WoLF PSORT（http://psort.hgc.jp/form.html）对TkSRPP2蛋白亚细胞定位进行预测。通过NCBI中的Blastp工具对TkSRPP2蛋白的保守结构域进行分析。利用在线软件TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测分析TkSRPP2蛋白的跨膜区。
1.2.3 细胞融合表达载体构建设计引物并命名为Y-TkSRPP2-F和Y-TkSRPP2-R（表 1），克隆去终止子且带有XhoLI和BamHI两个酶切位点的TkSRP-P2基因。PCR反应条件为94℃预变性1 min；94℃变性15 s，62℃退火15 s，72℃延伸60 s，35个循环。回收得到的目的片段与细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞并进行重组子筛选鉴定，获得细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-TkSRPP2。
1.2.4 烟草表皮细胞的瞬时转化参照于小帆等[10]的植物亚细胞定位方法，采用注射法进行烟草叶片瞬时表达的亚细胞定位。烟草注射菌液后在22-24℃下培养48 h。将处理后烟草叶片使用酶解法制备原生质体，共聚焦显微镜观察TkSRPP2蛋白质的定位。
1.2.5 橡胶草TkSRPP2基因的时空表达分析研究基于已公布的橡胶草基因组数据，选取稳定的GAPDH基因为内参基因[11]，用Primer5.0设计引物，分别命名为q-TkSRPP2-F、q-TkSRPP2-R（表 1）。提取6月龄橡胶草不同组织及不同生长期橡胶草植株根部RNA并反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR，检测6月龄橡胶草不同组织及不同生长期橡胶草TkSRPP2基因表达量的差异。
2 结果 2.1 TkSRPP2基因的克隆与分析以橡胶草cDNA为模板，根据橡胶草全基因组数据设计特异引物TkSRPP2-F和TkSRPP2-R，进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图 1）显示：在大约633 bp处有单一的特异条带，片段大小与理论值相符，将所得片段测序，测序结果与已公开基因序列相符，将其命名为TkSRPP2。
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| M:DNA Maker3;1:TkSRPP2 图 1 TkSRPP2基因的克隆 |
通过NCBI中的Blastp工具对TkSRPP2氨基酸序列进行分析，结果显示TkSRPP2蛋白均具有一个REF超家族保守结构域。经在线生物软件ExPASY ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析可以得出，TkSRPP2蛋白共有210个氨基酸；理论分子量为23.15 kD；理论等电点为8.51，属于碱性蛋白；不稳定性系数为41.02，属于不稳定蛋白；平均亲水性为-0.180，为亲水性蛋白。在线软件SOPMA预测TkSRPP2蛋白质的二级结构，发现其主要由66.19% α螺旋构成，其次为26.19%无规则卷曲、4.29% β-转角。利用SWISS-MODEL软件构建其三维蛋白模型（图 2）。TkSRPP2蛋白没有跨膜区，不属于跨膜蛋白。SignalP3.0Sever预测TkSRPP2蛋白质没有信号肽，不属于分泌蛋白。亚细胞定位预测结果表明TkSRPP2蛋白主要分布于细胞质中。
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| 图 2 TkSRPP2蛋白的三级结构预测 |
TkSRPP2基因编码的氨基酸序列经BLAST比对，与莴苣（Lactuca sativa）、黄花蒿（Artemisia annua）、向日葵（Helianthus annuus）、洋蓟（Cynara cardunculus var. scolymus）、短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）等的抗胁迫蛋白或小橡胶粒子蛋白具有同源性，相似度均在90%以上。运用MEFA7.0构建系统进化树，结果（图 3）表明，TkSRPP2氨基酸序列与莴苣SRPP3亲缘关系最近。
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| 图 3 TkSRPP2系统进化树分析 |
将去终止子的目的基因片段与克隆载体pMD19T连接，以此获得重组质粒pMD19-T-TkSRPP2。将测序鉴定正确的pMD19-T-TkSRPP2重组质粒和细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP同时用XbaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取抗性筛选平板上的单菌落，做菌落PCR鉴定；PCR鉴定为阳性的菌落扩繁提取质粒，并做双酶切鉴定（图 4），成功构建细胞融合表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-TkSRPP2。
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| 图 4 pCAMBIA2300-35S-GFP-TkSRPP2双酶切鉴定图 |
在模式植物烟草体内进行瞬时表达，用酶解法处理侵染后的叶片，成功制备原生质体后，在激光扫描共焦显微镜下观察，分析橡胶草TkSRPP2蛋白的亚细胞定位情况（图 5）。显微镜下多数细胞中均有荧光，橡胶草TkSRPP2蛋白定位于植物细胞质内，与其功能及预测结果相符。
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| A：绿色荧光；B：明场；C：合成 图 5 TkSRPP2亚细胞定位图 |
采用qRT-PCR分析橡胶草TkSRPP2基因的时空表达特异性，检测TkSRPP2基因在6月龄橡胶草根、叶、花、花葶等不同组织表达情况以及在1月龄、3月龄、5月龄、6月龄、7月龄、8月龄不同生长期橡胶草根部的表达量。结果（图 6）表明，TkSRPP2基因在6月龄橡胶草根部表达量最高；6月龄橡胶草根部TkSRPP2基因表达量到达峰值。
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| A：6月龄橡胶草不同组织；B：橡胶草根部不同生长时期 图 6 TkSRPP2基因时空表达分析 |
天然橡胶是一类有经济价值的聚异戊二烯链，存在于约2 500种植物的胶乳细胞中。虽然不同物种胶乳中的化学成分存在一定差异，但天然橡胶生物合成的机制相似，植物体内主要通过MVA的类异戊二烯代谢途径完成天然橡胶的合成，都涉及酶与胶乳中橡胶粒子结合的过程[12-13]。橡胶粒子中含有300种以上蛋白质，其中橡胶延伸因子（REF）和小橡胶粒子蛋白（SRPP）含量最高[14]。经系统进化关系研究发现，REF蛋白和SRPP蛋白为同源蛋白，都属于植物应激相关蛋白超家族[4]，在橡胶树乳管细胞中，REF和SRPP家族基因均有很高的表达量[9]。在银胶菊、橡胶草等产胶植物的乳胶中均发现了SRPP蛋白，短角蒲公英的SRPP蛋白与橡胶草中的极为相似，与橡胶粒子密切相关[15-16]。由此可见，这些基因与橡胶的生物合成相关。SRPP蛋白属于植物抗逆蛋白家族中的一员，已有研究表明，在环割胁迫后，SRPP蛋白出现高表达和大量累积[17]；研究者在巴西橡胶树SRPP基因启动子的研究中发现，SRPP基因启动子存在热响应元件、脱落酸响应元件等顺式作用元件，据此推测SRPP基因在抵御逆境胁迫的生理过程中可能具有重要的功能[18]。
本研究从橡胶草植株中克隆得到全长633 bp的编码序列，并将其命名为TkSRPP2。实时荧光定量分析结果显示，该基因主要在橡胶草根中表达，与其协助橡胶草产胶的功能一致；6月龄橡胶草根部TkSRPP2基因表达量达到峰值，此时橡胶草乳管分化最为完全。由此可见，TkSRPP2基因功能与乳管分化息息相关。运用NCBI中的Blastp功能进行结构域预测，发现TkSRPP2蛋白有一个REF保守结构域，符合SRPP家族的基本特征。通过相关软件预测TkSRPP2蛋白结构及性质，结果表明，该蛋白属于碱性、亲水性、不稳定蛋白，没有信号肽及跨膜结构域。亚细胞定位预测结果表明TkSRPP2蛋白主要位于细胞质中，这一预测结果与烟草亚细胞定位结果相符。已有研究表明，SRPP蛋白可能会通过渗透作用从橡胶粒子中释放，在橡胶粒子膜脂质的头部基团起到类似于“覆盖”的作用[19]，本研究的预测结果符合这一特征。在橡胶树中，SRPP蛋白被认为存在于橡胶粒子膜上，起到维持胶体稳定性的作用，在调控胶乳形成过程中起着重要作用[20]。进化树分析结果表明，产胶植物的REF/SRPP家族成员分布于一大支，其中橡胶草TkSRPP2蛋白与莴苣SRPP3蛋白有最近的亲缘关系，橡胶树SRPP家族成员分布于另一小支，这也表明橡胶草TkSRPP2蛋白与橡胶树SRPP蛋白具有相似功能。这些研究为TkSRPP2基因功能的探索提供了重要依据。
4 结论以橡胶草cDNA为模板，克隆得到TkSRPP2基因。该基因主要在根部表达，在6月龄橡胶草根部表达量达到峰值，TkSRPP2蛋白定位于细胞质中。
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