脂质代谢紊乱会造成脂肪堆积，进而引发肥胖症、脂肪肝、糖尿病等一系列代谢性疾病^[1-2]。在哺乳动物体内，异常或过量的脂肪会在脂肪细胞中累积，形成脂滴（Lipid droplets，LD）。脂滴是一个与脂质储存、代谢和分泌密切相关的细胞器，由甘油三酯（Triglyceride，TG）、胆固醇酯的中性脂肪核心及单层磷脂包被组成^[3]。Fsp27是一种脂滴表面结合蛋白，是调控脂滴发育和脂质沉积的关键因子^[4]。Fsp27蛋白定位于脂滴表面，并富集在脂滴与脂滴的接触位点（Lipid droplet contact site，LDCS），调节脂滴代谢，介导脂滴之间的相互融合形成单个大脂滴^[5-6]，但其具体的作用机制尚不明确。

本研究以分化的3T3-L1^[7]脂肪细胞作为研究模型，通过构建shRNA基因沉默载体沉默Fsp27基因，探究Fsp27基因沉默对脂肪细胞脂解的影响，以及对脂滴的形成、融合过程中的作用，推断其具体机制，旨在为了解Fsp27基因的生物学功能、脂类代谢疾病的治疗和预防奠定重要的实验基础和提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

3T3-L1前脂肪细胞系、DMEM高糖细胞培养基、BCA蛋白定量试剂盒、β-Actin抗体、山羊抗兔Ig G抗体、山羊抗鼠Ig G抗体（武汉BOSTER生物工程公司），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰岛素（Ins）、Lipofectamine 3000、P3000^TM试剂、油红O染料（Sigma公司，美国），真核表达载体（编号：GV104）（上海吉凯基因化学技术有限公司），离心柱型质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司），甘油三酯检测试剂盒、甘油含量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），HSL抗体、ATGL抗体、Fsp27抗体（Abcam公司，英国），PPARγ抗体（Bioworld公司，美国），GAPDH（CST公司，美国）。

1.2 方法 1.2.1 sh-Fsp27干扰载体的构建

查找NCBI基因数据库中小鼠Fsp27基因mRNA（NM_001301295）碱基序列，设计3条与小鼠Fsp27基因序列一致，且与其它基因同源性最低的阳性序列，同时再设计1条与小鼠Fsp27基因无任何同源性的阴性对照序列（表 1）。设计好的4个靶点序列委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成。构建带有RFP红色荧光的真核表达质粒载体GV104，鉴定其DNA序列。3条阳性重组干扰载体分别命名为sh-Fsp27-1、sh-Fsp27-2、sh-Fsp27-3，阴性对照为sh-Fsp27-0。

1.2.2 质粒的扩增（工具菌培养）与提取

取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养，待培养平板上长出单个菌落后，挑取菌落接种于含有氨苄青霉素（终浓度为50 µg/mL）的LB液体培养基中。将接种好的锥形瓶置于37℃恒温摇床中220 r/min，振荡培养16 h。

采用碱裂解法，严格按天根质粒小提试剂盒说明书在无菌环境中提取质粒。通过微孔板分光光度计测定质粒的浓度和纯度（A₂₆₀/A₂₈₀值），剩余质粒放于-20℃保存备用。

1.2.3 细胞培养与诱导分化

用含10%FBS的DMEM高糖培养基培养3T3-L1前脂肪细胞：将其放置于环境为37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，2 d更换完全培养液1次。将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合至80%左右时，按本课题组前期优化过的经典“鸡尾酒”方法，诱导分化3T3-L1前脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞。对照组诱导分化后用完全培养基继续培养，2 d换液1次，sh-Fsp27-0组（即阴性对照组）、sh-Fsp27-1组、sh-Fsp27-2组、sh-Fsp27-3组在诱导分化4 d时进行脂质体转染。

1.2.4 脂质体转染

sh-Fsp27-0组、sh-Fsp27-1组、sh-Fsp27-2组、sh-Fsp27-3组细胞在诱导分化4 d时，取出六孔板，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行转染，37℃孵育细胞2 d，然后荧光显微镜观察转染效果。

1.2.5 油红O染色

在细胞干预完成后，弃掉六孔板中培养基，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛缓冲溶液，室温固定细胞1 h。用PBS洗净残留的多聚甲醛缓冲溶液，每孔加入油红O工作液1 mL（现配现用）。室温染色1 h后蒸馏水清洗残留油红O工作液，置于显微镜下观察并拍照。

1.2.6 TG含量与甘油含量检测

细胞干预完成后，收集6孔板中的细胞至EP管。每个EP管中加入900 μL PBS缓冲液，用枪头吹打细胞沉淀至细胞悬浮。在冰水浴条件下进行超声破碎细胞。制备好的匀浆液直接按照甘油三酯（TG）试剂盒检测说明书测定TG含量，每组以细胞总蛋白浓度对测定值进行校正。制备好的匀浆液70℃金属浴10 min，灭活脂肪水解酶，严格按照甘油测定试剂盒说明测定样本甘油含量。根据预先绘制的标准曲线计算各样本的甘油含量，并以每mg蛋白浓度对测定值进行校正。

1.2.7 Western-blot检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ蛋白表达

收集各组细胞沉淀至EP管中，加入200 µL细胞总蛋白裂解液，冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上层液体即为待测总蛋白样品。采用BCA法测定各组待测样品的总蛋白浓度，并调平浓度。PAGE电泳，电泳参数：浓缩胶80 V恒压，分离胶120 V恒压；湿式转膜，参数：220 mA恒定电流，转膜持续2 h。取出NC膜，浸入封闭液中封闭2 h。蛋白一抗4℃过夜孵育。次日，取出条带，孵育二抗，37℃摇床2 h。显影仪曝光目的条带，挑选出目的条带清晰、背景浅的图片。用ImageJ软件对目的蛋白条带进行分析并测定吸光度值，以β-actin进行校正。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验数据统一采用x±s来描述。计量资料采用t检验进行分析，多组样本均数比较采用one-way ANOVA进行分析。

2 结果 2.1 干扰载体的鉴定

通过0.8%琼脂糖凝胶电泳，4组质粒电泳条带均位于6 500 bp附近（图 1-A），提取的质粒准确，可进行后续实验。经过DNA测序结果证实，3个sh-Fsp27阳性干扰载体中的插入的shRNA编码序列正确，与预期设计合成的干扰序列相符合（图 1-B）。

2.2 质粒浓度、纯度

经DH5α大肠杆菌培养后提取质粒，质粒浓度为300-700 μg/mL，A₂₆₀/A₂₈₀均介于1.8-2.0之间，可用于脂质体转染（表 2）。

2.3 细胞转染效果及Fsp27蛋白的沉默效果

细胞脂质体转染4 d后，荧光显微镜下观察拍照显示：4组红色荧光蛋白基本表达一致，转染效率在45%左右（图 2-A），阴性对照组和阳性sh-Fsp27干扰载体之间的转染效果没有显着差异。Western blot结果显示，与sh-Fsp27-0组和空白组比较，3个阳性干扰载体可以明显下调Fsp27蛋白的表达量（P < 0.05）（图 2-B），且在3个阳性载体中sh-Fsp27-2干扰载体下调Fsp27蛋白表达的效果最好，后续实验以sh-Fsp27-2作为阳性组。

2.4 脂肪细胞中脂滴的变化

未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈纤维样，胞质内无明显脂滴。诱导分化后，细胞形态由成纤维样变为圆形，伴随着胞体的增大，胞内出现脂滴。油红O将细胞中的脂质染成红色，普通光学显微镜下观察可见，对照组与sh-Fsp27-0组脂滴生成较快，8 d时能明显观察到脂滴聚集，12 d可见小脂滴融合成大脂滴；阳性sh-Fsp27组均可见大量小脂滴广泛地分布于细胞核周围，且在12 d时仍未出现明显的大脂滴（图 3）。

2.5 脂肪细胞内TG和甘油含量

采用酶学方法检测3T3-L1脂肪细胞内的TG和甘油含量。与对照组和sh-Fsp27-0组相比，阳性sh-Fsp27组中TG含量明显下降，甘油含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）（表 3）。

2.6 脂肪细胞中MAPK信号通路及脂肪水解酶的表达

经Western blot检测显示（图 4），与空白对照组和阴性对照组相比，阳性sh-Fsp27组PPARγ蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳性sh-Fsp27组ATGL蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；各组之间HSL蛋白表达量无显著差异（P > 0.05）。

3 讨论

脂肪组织是集体贮存和提供能量的主要组织，当脂质代谢紊乱时就会引发肥胖症、脂肪肝、高脂蛋白血症等疾病，严重危害人们的健康^[8-9]。脂滴是脂肪组织的主要贮存场所，其表面存在众多的脂滴相关蛋白，在脂肪的代谢、转运和信号转导等方面发挥作用^[10]。Fsp27是新近才发现的一种脂滴相关蛋白，研究发现Fsp27在促进脂滴融合，形成单房大脂滴，调控甘油三酯贮存方面具有重要作用，但其具体的作用机制尚不明确^[11]。

Fsp27蛋白表达于脂肪细胞中，当两个小脂滴相互接触时，Fsp27在脂滴之间的接触点富集，小脂滴中的中性脂质定性转移到大的脂滴中，导致小脂滴的相互融合形成大脂滴^[12]。本实验使用RNAi技术，成功构建了3条Fsp27基因沉默载体，并且证明了sh-Fsp27-2组载体的效率最高，可用于后续实验。成功沉默了Fsp27基因，可以明显观察到脂肪细胞内大脂滴数量减少，小脂滴广泛分布，说明Fsp27基因表达量的减少可以抑制小脂滴的融合，使其呈“戒环样”结构包围着细胞核，从而减少了大脂滴的生成，结果与之前的报道一致^{[7, 13]}。在脂肪分解的过程中，细胞内甘油三酯水解主要是通过激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）和甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）两种关键脂肪水解酶来完成的。本实验中可以明显观察到阳性实验组中TG含量减少，而甘油含量增加，说明通过下调Fsp27基因的表达可以促进甘油三酯的水解。Fsp27可以激活ATGL的抑制因子早期生长反应蛋白1（Early growth response protein 1，Egr1），从而抑制ATGL的转录水平^[14-15]。本次实验在降低脂肪细胞中Fsp27的表达后，可以观察到ATGL表达升高，而ATGL表达量的增加，进一步促进了脂肪的水解。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPARγ）是调节脂肪形成和能量代谢的关键因子，丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的下游靶点，其作为核转录因子可调控Fsp27的表达，促进脂肪细胞的分化和脂质沉积^[16-17]。在沉默Fsp27基因后，Fsp27蛋白的表达减少，从而负反馈调节使PPARγ的表达升高（图 5）。PPARγ表达的升高也从侧面印证了Fsp27基因通过PPARγ通路促进脂肪的生成，对脂肪细胞中甘油三酯的蓄积起正调控的作用。

4 结论

综上所述，sh-Fsp27-2组基因沉默载体的效率最高，沉默Fsp27基因可以促进3T3-L1前脂肪细胞的脂解。推测其作用机制可能是：Fsp27基因表达的缺失抑制了小脂滴的相互融合，增大了脂肪酶的接触面积，减少了对ATGL转录的抑制，增强了ATGL介导的脂肪水解作用，从而促进了3T3-L1前脂肪细胞的脂解。Fsp27基因通过PPARγ通路促进脂肪的生成，对脂肪细胞中甘油三酯的蓄积起正调控的作用。