磷脂酶C是一种可以水解磷脂的酶^[1]，近年来对磷脂酶C在油脂的酶法脱胶方面应用的研究非常广泛^[2]。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific phospholipase C，PI-PLC）是众多磷脂酶C中的一类，可以特异性作用于磷脂酰肌醇（PI，PIP，PIP₂）的磷酸二酯键，使之分解为结合在膜上的二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）和水溶性磷酸肌醇（InsP，InsP₂，InsP₃）。PI-PLC普遍存在于原核生物和真核生物体内，其中来源于真核生物的PI-PLC分子量通常为85-150 kD，在高等生物体内PI-PLC在多种受体介导的信号转导通路中扮演着重要的角色^[3]。

大多数来源于原核生物体的PI-PLC分子量为30-35 kD，来源于原核生物和真核生物体的PI-PLC的催化结构域极为相似，但催化结构域中不同的部分导致二者来源的PI-PLC对底物的作用略有不同^[4]，其中微生物中的PI-PLC可以直接专一作用于PI，而真核生物中的PI-PLC作用时需要Ca²⁺等调节因子的辅助且还可以作用于底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（PIP₂）^[5]。PI-PLC在蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等微生物中表达量较高。值得一提的是来自蜡状芽孢杆菌的PI-PLC的晶体结构显示该酶由具有TIM桶型结构的单个结构域组成，其与哺乳动物PI-PLC的催化结构域非常相似^[6]，与人类致病性寄生虫布鲁斯锥虫产生的糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（GPI-PLC）有很高的序列相似性，与其它大多数微生物来源的PI-PLC不同的是，来自致病菌蜡状芽孢杆菌的PI-PLC并不作为毒力因子^[7]。

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（Glycosylphosphatid-ylinositol-anchored protein，GPI-AP）普遍存在于细胞表面，蛋白通过GPI锚固定在细胞膜上。GPI锚主要结构为一分子磷酸乙醇胺、一分子磷脂酰肌醇以及一个聚糖核心^[8]。目前已经在哺乳动物细胞中鉴定出150多种GPI-APs，这些蛋白在哺乳动物的生长发育过程中起着重要作用，而这些蛋白错误的翻译后修饰可能会引发多种疾病^[9]。由于PI-PLC可以作用于磷脂酰肌醇，可以将GPI-APs从细胞膜上释放出来^[10-11]，因而PI-PLC也被应用于对细胞表面GPI-APs的研究和鉴定。另外，有证据表明，寄生虫表面存在大量GPI-APs，其中一些GPI-APs与寄生虫感染宿主细胞这一过程密切相关^[12]，因此利用PI-PLC替代抗生素来抵抗寄生虫具有广阔的潜在价值。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒与细胞系

大肠杆菌DH5α感受态、大肠杆菌BL21感受态购于天根生化科技（北京）有限公司；表达质粒pGEX-6P-1由本实验室保藏。膀胱癌细胞KK47由美国华盛顿大学SI Hakomori院士惠赠。

1.1.2 酶及相关试剂

高保真聚合酶2×Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶BamH I、EcoR I购于NEB；DNA marker、solution I购自日本TaKaRa公司；质粒小量提取试剂盒购于Magen（美基）生物；DNA片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；氨苄青霉素、红霉素购自上海生工生物工程有限公司；Protein marker购于赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）；p-nppc购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GST标签蛋白纯化试剂盒购于碧云天试剂公司；CD59抗体购于美国SantaCruz Biotechnology公司；HRP标记二抗、ECL发光试剂购自碧云天公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 PI-PLC基因的合成

以NCBI数据库报道的来源于蜡状芽孢杆菌的PI-PLC基因（GenBank：M30809.1）为模板，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化后，由北京擎科新业生物技术有限公司完成基因合成。

1.2.2 PI-PLC基因的克隆

利用Snap Gene软件以合成的基因片段为模板设计基因扩增引物P1（5′-CGGGATCCATGGCAAGCAGCGTTAA-3′下划线处为BamH I酶切位点）和P2（5′-GGAATTCCTCGAGTTCTTTAATCAGGCTT-3′下划线处为EcoR I酶切位点）。引物合成由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

以合成基因为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增。扩增体系如下：1 μL PI-PLC合成基因，上游引物和下游引物各5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，灭菌的双蒸水14 μL。PCR扩增条件为：95℃预变性30 s；95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，29个循环后72℃延伸5 min。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，利用DNA片段纯化试剂盒对扩增的PI-PLC产物进行纯化。

1.2.3 重组大肠杆菌表达载体的构建

提取表达质粒pGEX-6P-1，利用限制性内切酶BamH I和EcoR I对纯化后的目的基因和表达质粒pGEX-6P-1在37℃条件下进行酶切处理，纯化回收，利用solution I于16℃金属浴中连接3 h。将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，利用含有氨苄抗性的LB固体培养基平板进行筛选，挑取平板上带有氨苄抗性的单菌落，利用质粒pGEX-6P-1测序引物进行菌落PCR，选取扩增出与目的基因大小相同片段的转化子扩大培养，将重组子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序正确的质粒命名为pGEX-6P-1-PI-PLC，提取测序正确的质粒并将其转化于E.coli BL21（DE3）中，将转化子保存于-80℃甘油管中。

1.2.4 重组大肠杆菌的诱导表达、纯化及SDS-PAGE凝胶电泳检测

将重组大肠杆菌pGEX-6P-1-PI-PLC/DE3及对照于氨苄抗性LB培养基37℃、200 r/min条件下过夜培养。以5%接种量将重组菌转接至20 mL氨苄抗性LB培养基，37℃、200 r/min条件下培养至菌液长至OD_600nm为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于16℃进行诱导（终浓度0.1 mmol/L），12 h后将收集到的菌液以6 000 r/min离心10 min收集菌体，用4 mL浓度为Tris-HCl（pH7.2）缓冲液重悬菌体，冰浴破碎至菌体澄清，14 000 r/min、4℃离心15 min，收集上清液。

根据GST纯化试剂盒说明书对PI-PLC进行纯化，把纯化液加入10 kD离心管，6 000 r/min离心10 min对目的蛋白进行除盐、浓缩。取30 μL纯化液，加入5×loading buffer，100℃水浴加热10 min。用5%浓缩胶、10%分离胶进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定目的基因是否表达。

1.2.5 PI-PLC比酶活的测定

由于PI-PLC可以水解甘油磷脂结构类似物对硝基苯酚磷酸胆碱（p-NPPC）产生对硝基苯酚（有色基团），对硝基苯酚在410 nm处有最大吸收峰，可以用p-NPPC为底物测量PI-PLC酶的酶活^[13]。首先绘制对硝基苯酚标准曲线：用浓度为25 mmol/L Tris-HCl（pH7.2）分别配置8 nmol/mL、12 nmol/mL、20 nmol/mL、40 nmol/mL、60 nmol/mL浓度的对硝基苯酚，取200 μL上述溶液并利用酶标仪测量其在410 nm处的吸光值。

在含有浓度为25 mmol/L的Tris-HCl（pH7.2）、10 mmol/L浓度的p-NPPC的反应体系中加入20 μL发酵酶液，37℃条件下反应30 min后立即用酶标仪测量反应液在410 nm处的吸光度，通过吸光值计算反应产生的对硝基苯酚进而计算PI-PLC酶的活性。酶活定义为：在pH7.2、37℃的条件下，每分钟水解p-NPPC产生1 nmol的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

利用BCA法绘制标准蛋白浓度曲线并测定纯化后酶的蛋白浓度，进而计算出比酶活。

1.2.6 诱导表达条件的初步优化

此实验在方法1.2.4的基础上通过改变诱导时间、诱导剂IPTG浓度、诱导试剂、接种量等单因子进行诱导表达条件优化。根据方法1.2.5测定单位体积发酵液的酶活，每个因素做3个平行。

1.2.7 细胞培养与处理

KK47细胞在含10%体积分数胎牛血清、1%体积分数青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、5%体积分数CO₂环境下培养。

细胞生长至80%融合度后，用生理盐水清洗细胞，加入200 μL PI-PLC纯化液37℃处理1 h，处理后用PBS缓冲液清洗细胞表面。 

1.2.8 PI-PLC处理细胞并用Western blot技术进行检测

用RIPA缓冲液（1%体积分数NP-40、0.5%体积分数脱氧胆酸钠、1%体积分数SDS、0.1%体积分数PMSF）裂解细胞，BCA法测定样品蛋白浓度进行定量，SDS-PAGE电泳，转膜，3%体积分数胎牛血清蛋白封闭，CD59抗体（用PBS 1:1 000稀释）4℃杂交过夜，PBST洗膜后加入适量HRP标记的二抗室温温育1 h，进行ECL显色。

1.2.9 流式检测

将细胞分为阴性对照组（细胞用4%质量分数多聚甲醛固定，用二抗孵育）、PI-PLC处理组（细胞用4%质量分数多聚甲醛固定，用100 μL PI-PLC纯化液于37℃条件下处理30 min，孵育CD59抗体，孵育二抗）、未用PI-PLC处理组（细胞用4%质量分数多聚甲醛固定，孵育CD59抗体，孵育二抗）流式细胞术分析PI-PLC对细胞表面的CD59的酶切情况。

2 结果 2.1 目的片段与基因表达载体的获得与鉴定

根据NCBI数据库中来源于蜡样芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因成熟肽部分为模板，根据大肠杆菌密码子的偏好性对基因进行密码子优化，并合成优化序列。以合成基因为模板，利用PCR对目的基因进行扩增，并利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，发现在1 000 bp处有明显条带（图 1-B）。

2.2 基因表达载体的构建

利用重组质粒的酶切位点BamH I和EcoR I来鉴定目的基因PI-PLC是否在质粒上正确连接。提取质粒并酶切处理后，利用琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条1 000 bp左右目的基因片段和一条5 000 bp左右的载体片段，与预期相符，结果如图 1-A所示。载体测序结果正确。

2.3 PI-PLC在大肠杆菌中的表达

将重组质粒转入大肠杆菌感受态表达菌株BL21（DE3）中，根据1.2.4的方法诱导大肠杆菌表达PI-PLC。构建的重组菌成功表达出分子量约为61 kD带有GST标签蛋白的重组蛋白（图 2）。

2.4 利用GST标签蛋白纯化PI-PLC

使用GST蛋白纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化，利用SDS-PAGE对纯化结果进行检测。发现目的蛋白主要存在于诱导后的重组菌裂解液上清中，纯化过程中目的蛋白损失较少，得到的目的蛋白纯度较高（图 2）。

2.5 诱导表达条件的初步优化及比酶活测定

诱导时长、接种量、诱导时机、诱导时诱导剂浓度的不同对单位体积发酵液酶活的影响如图 3所示。根据1.2.6的方法改变不同单一变量并测定单位体积发酵液酶活的变化从而确定最佳诱导表达条件。不改变其他条件，选取发酵时长分别为12 h、24 h、36 h、48 h，当诱导时长为24 h时单位体积发酵液的酶活达到最高值1 039.77 U/mL（图 3-A）；保持其他条件不变，分别选取发酵液接种体积分数1%、3%、5%、7%、9%，当发酵液接种体积分数为5%时，单位体积发酵液的酶活最高，可以达到1 807.67 U/mL（图 3-B）；不改变其他条件，菌体在600 nm下吸光值分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7时开始诱导，当菌体在600 nm下吸光值为0.5，单位体积发酵液的酶活最高，可以达到900.67 U/mL（图 3-C）；保持其他条件不变，诱导剂浓度分别选取0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、0.9 mmol/L，当诱导剂浓度为0.3 mmol/L时，单位体积发酵液的酶活最高，为1 353.28 U/mL（图 3-D）。综合上述结果，本研究以接种体积分数5%接种，待菌体生长OD_600nm达到0.5，以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h为最佳诱导表达条件。

在最佳条件下发酵PI-PLC并纯化，纯化后酶的质量浓度为0.52 mg/mL，20 μL纯化酶液含有酶活为14 U，经计算比酶活为1 322.5 U/mg。

2.6 用PI-PLC处理膀胱癌细胞

CD59是一个典型的GPI锚定蛋白，普遍存在于哺乳动物细胞表面，可以通过检测CD59的表达情况衡量PI-PLC对GPI锚定蛋白的酶切效果，实验设计如图 4-A所示。将培养过夜的膀胱癌细胞KK47经PI-PLC酶液处理后，提取细胞蛋白，经SDS-PAGE和Western blot检测，结果（图 4-B）显示经PI-PLC酶处理后，细胞样品中GPI锚定蛋白CD59的表达明显减少。同样，将酶切处理的细胞上样至细胞流式仪，可以明显观察到经酶切处理细胞的GPI锚定蛋白CD59的表达显著减少（图 4-C）。由此证明本文表达的PI-PLC可有效地将GPI锚定蛋白从细胞膜上释放下来。

3 讨论

国外对磷脂酶C的基因序列、结构、功能、酶学性质及应用等相关研究开始较早，对细菌来源的磷脂酶C在不同体系内的克隆表达和其在工业和医学方面的应用也有报道^[14-15]。相比较而言，国内对细菌来源的磷脂酶C尤其是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的研究较少，主要集中在磷脂酶C在油脂脱胶、饲料抗虫等方面的应用研究。2016年，汤先泽^[16]对磷脂酰肌醇进行了异源表达，并对其粗酶液的抗鸡球虫效果进行了初步分析；2019年，邹全等^[17]对磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在枯草芽孢杆菌中进行表达，并利用其粗酶液对两种酶的酶学性质进行了分析并应用于油脂脱胶，然而，对磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的纯化及其酶活性研究较少。同时，GPI锚定的形式可以使细胞膜表面结合更多蛋白^[18]，其中哺乳细胞中的一些细胞粘附分子、淋巴细胞分化抗原、补体调节蛋白等具有一定功能性的蛋白通过GPI锚定的形式存于细胞膜表面^[19]，这些蛋白和哺乳动物的很多生理过程息息相关^[20]，然而对GPI锚定蛋白的研究还远远不够。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C可以专一作用于GPI锚定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯键，进而使GPI锚定蛋白从细胞膜上释放下来。表达和纯化高效的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，从而将其更好地应用于对GPI锚定蛋白的研究与鉴定中，可为研究GPI锚定蛋白的生物学功能等提供有效帮助。由于本实验中PI-PLC来源于蜡状芽孢杆菌，其结构与哺乳动物体内切割GPI锚定蛋白的酶结构具有相似性，且不作为毒力因子^[21]，因此后续工作可把磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C在细胞生物学实验中进行应用。

4 结论

本实验实现了来源于蜡样芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的可溶性表达。最终该带有GST融合标签的重组磷脂酶C在最佳诱导表达条件下发酵并纯化后的质量浓度为0.52 mg/mL，比酶活为1 322.5 U/mg。实验结果表明，所获PI-PLC可将GPI锚定蛋白从细胞表面释放下来。