L-色氨酸（L-Trp）作为人和动物体所必需的3种芳香族氨基酸之一，广泛应用于医药、食品、饲料和化工领域[1-2]。L-Trp的生产方法主要包括化学合成法、转化法及微生物发酵法。由于化学合成法和转化法存在工艺复杂、副产物多、得率较低及成本较为昂贵等缺点，如今通常采用微生物直接发酵法来实现L-Trp的生产。大肠杆菌作为氨基酸发酵的重要平台微生物，在氨基酸发酵工业中有着极其重要的地位。大肠杆菌细胞可直接利用葡萄糖合成L-色氨酸，从葡萄糖出发，经过碳中心代谢过程，包括各种磷酸化系统（Phosphotransferase system，PTS）、糖酵解过程（Embden meyerhof parnas，EMP）以及磷酸戊糖途径（Hexose monophosphate pathway，HMP），合成L-色氨酸的前体物磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）和4-磷酸-赤藓糖（4-phosphate-D-erythrose，E4P），之后经过芳香族氨基酸共有的7步莽草酸途径合成分支酸，最后由分支酸经芳香族氨基酸的分支代谢途径合成L-色氨酸[3-4]。其中，丙酮酸不仅作为色氨酸合成重要的前体物，同时也是细胞合成L-丙氨酸的直接供体。在发酵过程中L-丙氨酸大量合成，丙酮酸的消耗势必增加，使得前体物DAHP的合成较少，L-色氨酸的积累也受到影响。
微生物体内L-丙氨酸的生物合成是比较容易实现的，其含量也较为丰富[5-6]。但是，在氨基酸发酵生产中L-丙氨酸的大量合成不仅会造成碳源的过度消耗，过量的积累还会对发酵液中目标产物的纯化以及回收带来困难[7-8]。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌都是产L-Trp的代表性微生物。在谷氨酸棒杆菌中，研究人员通过敲除合成L-丙氨酸的关键酶来提高L-缬氨酸以及L-丝氨酸等氨基酸的产量[7-9]。Marienhagen等[7]分析了谷氨酸棒杆菌中与L-丙氨酸合成相关的两种转氨酶：AlaT和AvtA，通过敲除活性最高的转氨酶AlaT来减少L-丙氨酸的含量以及增加L-缬氨酸在胞外的积累。但与谷氨酸棒杆菌相比，大肠杆菌在L-丙氨酸的合成过程中具有更复杂的丙氨酸转氨酶，不仅包括已被鉴定的丙氨酸转氨酶AlaA、AlaC和缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶AvtA在内最主要的3种丙氨酸转氨酶，还包括另外8种潜在的转氨酶可能合成L-丙氨酸[10-12]。目前在大肠杆菌中还鲜见L-丙氨酸合成调控下的L-色氨酸的相关研究。
本研究以大肠杆菌E. coli FS-T0为出发菌，利用Red重组技术分别修饰不同丙氨酸转氨酶基因，构建系列L-丙氨酸转氨酶突变工程菌株，并探究各基因修饰后各工程菌在细胞生长、L-丙氨酸含量以及L-色氨酸产量等方面的差异。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌E. coli FS-T0由实验室前期通过代谢工程手段及多轮化学诱变获得的多类芳香族氨酸类似物抗性（5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸和对氟苯丙氨酸抗性）的高产L-色氨酸工程菌株。本研究基因修饰所用质粒pKD46、pKD13和pCP20由工业微生物教育部工程研究中心保藏，具体菌株见表 1。
根据GenBank中大肠杆菌E. coli str. K-12 substr. MG1655的基因alaA、alaC和avtA序列信息，利用Red重组的方法敲除菌株E. coli FS基因组中alaA、alaC和avtA基因，分别设计含同源臂序列的敲除引物，设计如下（下划线部分为目的基因序列，其余为同源臂序列）：F1-（5′-ATGTCCCCCATTGAAAAATCCAGCAAATTAGAGAATGTCGTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3′），R1-（5′-TTACAGCTGATGATAACCAGAAAGGAAACGCGCGAACTTCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）、F2-（5′-ATGGCTGACACTCGCCCTGAACGTCGCT TTACGCGCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R2-（5′-AGCGAACATGCGTATCAC CATAGTCGCCAAAGCCAATCCCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）以及F3-（5′-ATGACA TTCTCCCTTTTTGGTGACAAATTTACC-CGCCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R3-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCAGGCTCTTTCTATCTCTTCCGCCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）。同时设计鉴定引物如下：F1-F-（5′-ATGTCCCCCATTGAAAAATCCAGC-3′），R1-R-（5′-TTACAGCTGATGATAA-CCAGAAAGG-3′）、F2-F-（5′-TAAACCGTCGGCACGGAACATCGC-3′），R2-R-（5′-TTAGCTACGGCTGAGCACGC-3′）以及F3-F-（5′-ATGAC ATTCTCCCTTTTTGG-3′），R3-R-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCAGG-3′）。
1.1.3 主要试剂和仪器PrimeStar DNA聚合酶和PCR试剂：TaKaRa宝生物公司产品；引物合成、质粒小量提取试剂盒、sanPreP柱式胶回收DNA试剂盒、胰蛋白胨和酵母粉，琼脂糖，L-阿拉伯糖等：生工生物工程（上海）股份有限公司产品；其余试剂均为国产或进口分析纯级别。
电转仪：Eppendorf 2510，艾本德中国有限公司；PCR仪：ABI产品；高效液相色谱仪：LC-2030C，岛津中国；紫外分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。
1.1.4 培养基和培养条件LB培养基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉20。
SOC培养基（g/L）：蛋白胨20，酵母粉5，葡萄糖3.9，NaCl 0.58，KCl 0.185，MgCl2 0.95。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏11，L-苯丙氨酸0.75，L-酪氨酸0.60，硫酸铵3，柠檬酸钠0.25，硫酸镁3，磷酸氢二钾0.65，磷酸二氢钾0.35，七水硫酸亚铁0.02，氯化镁0.05。
上述培养基pH值均需调至7.0，筛选所需的卡那霉素和氨苄青霉素终浓度为50 μg/mL和100 μg/mL。
1.2 方法 1.2.1 PCR片段的制备以质粒pKD13为模板、含同源臂的序列为引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性1 min；94℃变性40 s，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min，之后用Dpn I酶对PCR产物进行处理，胶回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。
1.2.2 含pKD46电转化感受态的制备将含有pKD46质粒的菌株接种于终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素LB培养基中，30℃过夜培养。取0.5 mL至含50 mL LB培养基中（含100 μg/mL的氨苄青霉素），30℃，250 r/min培养至OD600=0.15-0.2，加入终浓度为10 mmol/L的L-阿拉伯糖诱导剂。待细胞OD600在0.7左右时，菌液于4℃预冷30 min，6 000 r/min离心10 min，弃上清。之后用预冷的10%的甘油重悬离心洗涤2次。收集后的细胞进行后续试验或者-80℃保存。
1.2.3 电转化取上述PCR产物10 μL加至感受态细胞中，混合后加至电转杯，于1 800 V，25 μF，200 Ω条件下进行点击。电击后迅速加入800 μL的SOC培养基，37℃，100 r/min培养约1.5 h后取200 μL涂布于含卡那霉素抗性的平板上，筛选含卡那霉素重组子的阳性转化子。
1.2.4 抗性基因及pCP20质粒的消除将pCP20质粒电转入含卡那霉素抗性的重组子中，30℃复苏1.5 h后，涂布于含氨苄青霉霉素的平板上，30℃培养。使用验证引物筛选阳性转化子，之后将阳性转化子接种于LB培养基中，30℃培养3 h后42℃过夜培养，取少许菌液划线分离并对单菌落就行抗性检测，从而得到已消除pCP20的重组菌株。
1.2.5 摇瓶发酵培养种子培养：在冷冻管中分别取少许出发菌株和改造后菌株接种于LB斜面中，培养约15 h后，用无菌生理盐水洗下接种于装有50 mL种子培养液的500 mL三角瓶中，35℃，250 r/min培养12 h。
摇瓶发酵培养：将上述培养好的种子液以10%的接种量接种于含30 mL的发酵培养基的250 mL的三角瓶中，37℃，250 r/min培养约40 h。
1.2.6 50 L罐补料分批发酵种子罐培养工艺：将1.2.5中培养好的种子液以0.5%的接种量接种于装有10 L发酵培养基的30 L的种子罐中，罐温35℃，初搅拌300 r/min，溶氧（DO）自然下降后通过搅拌控制在20%-50%，OD600≥10（约13 h），移种。
发酵罐培养工艺：以20%的移种量将上述种子罐中的种子液转入含有25 L发酵培养基的50 L发酵罐中，初搅拌300 r/min，通气比为1:0.8，生物量（OD600）在10之前罐温控制在35℃（大约6 h），之后升温至37℃培养，全过程通过流加25%的氨水控制pH在7.0左右，调节搅拌控制溶氧在15%-35%，并在发酵过程中流加70%的葡萄糖维持发酵液中葡萄糖浓度在5.0-10.0 g/L。发酵过程中每隔2 h取样检测残糖及菌体生物量。发酵结束前2 h停止流加葡萄糖，整个发酵周期约50 h。
1.2.7 发酵产物检测分析利用分光光度计在600 nm下测定菌体浓度；SBA-40D生物传感分析仪测定葡萄糖的含量；氨基酸的含量采用HPLC法测定[13-14]。
2 结果 2.1 alaA、alaC和avtA基因缺失株的构建利用Red重组技术，以pKD13质粒为模板含同源臂的序列为引物，分别扩增出与alaA、alaC和avtA基因同源、中间为卡那霉素抗性且在卡那霉素两端含FRT位点的片段。转化后使用验证引物及测序的方法验证其与目标长度一致，筛选转化后的阳性转化子。
pCP20属温度敏感型质粒，具有氯霉素和氨苄青霉素抗性，同时在30℃下可产生翻转酶重组酶FLP，FLP重组酶可与FRT位点结合，在FLP重组酶的作用下FRT位点自身发生同源重组，从而消除抗性基因及一个FRT位点，在温度升至42℃时pCP20质粒自行丢失。pCP20质粒消除抗性基因及其丢失后使用验证引物及测序结果筛选阳性转化子，结果经DNAMAN软件比对后与实际序列一致，表明已经对E. coli FS的alaA、alaC和avtA各基因成功敲除，敲除后菌落PCR结果如图 1。
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| M：200 bp Ladder DNA marker；1：alaA基因PCR片段；2：alaC基因PCR片段；3：avtA基因PCR片段 图 1 alaA、alaC和avtA各基因敲除后菌落PCR结果 |
为了验证各丙氨酸转氨酶的修饰对工程菌生产L-色氨酸的影响，对出发菌株及各修饰后的工程菌进行摇瓶初步实验。利用高效液相色谱以及分光光度计等方法对各工程菌中各组分变化情况进行比较分析。
结果（表 2）显示，从最大生物量来看，除3种丙氨酸转氨酶全部缺失的工程菌E. coli FS-T7的生长受到较强抑制外，其它各工程菌株与出发菌株的细胞浓度基本一致，说明单独或任意两种丙氨酸转氨酶的缺失对于菌体的正常生长代谢不会造成明显影响；在L-丙氨酸的积累和L-色氨酸的合成方面，各丙氨酸转氨酶缺失工程菌相比于出发菌株L-丙氨酸的积累均有所降低、L-色氨酸的合成均有所提高，其中L-丙氨酸的积累中工程菌E. coli FS-T4和E. coli FS-T7最为明显，分别减少了91.0%和97.2%，而对于L-色氨酸的合成工程菌E. coli FS-T4产量最高，可达6.08 g/L，相比于原始菌提高了26.7%，而L-丙氨酸积累最少的E. coli FS-T7工程菌仅能合成5.36 g/L的色氨酸。实验结果表明，敲除AlaA和AlaC两种L-丙氨酸转氨酶对工程菌株的生长和发酵生产L-色氨酸最为有利。
从摇瓶发酵试验结果得知，所修饰的各工程菌中，缺失AlaA和AlaC的两种L-丙氨酸转氨酶的工程菌E. coli FS-T4的产色氨酸能力最高。因此，为了检验其在高密度发酵中的产酸能力，以出发菌株E. coli FS-T0为对照，在50 L罐中对菌株E. coli FS-T4进行补料分批发酵实验，发酵过程代谢曲线见图 2。工程菌株E. coli FS-T4最高可积累L-色氨酸41.9 g/L，糖酸转化率可达20.5%，分别较出发菌株提高了13.8%和5.1%。在细胞生长和耗糖方面，发酵0-6 h，温度控制在35℃，出发菌株与丙氨酸转氨酶缺失工程菌均处于发酵环境适应期，细胞增长较慢，但耗糖速率有一定差别，工程菌E. coli FS-T4的耗糖速率明显更高；发酵6 h后，温度升至37℃，二者工程菌均进入对数生长期，菌株E. coli FS-T4在发酵12 h时开始进行补糖，32 h时菌浓达到最大值，最大菌浓OD可达90.2，相比于出发菌株工程菌E. coli FS-T4补糖时间和菌株生长至最大菌浓时间均提前了4 h，最大菌浓也与出发菌株基本一致，说明AlaA和AlaC两丙氨酸转氨酶的缺失对菌株的正常代谢生长并未有明显影响。在L-色氨酸生产方面，0-16 h，酸值较低，二者产酸基本一致；发酵16 h后，工程菌E. coli FS-T4 L-色氨酸的积累速率明显加快，在46 h时产酸达到最高值，相比于出发菌株达到最大酸值提前了2 h，随着发酵时间的进行，二者工程菌L-色氨酸的积累量分别在48 h和50 h时降低，因此，发酵在50 h终止。
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| 图 2 E. coli FS-T4工程菌株在50 L罐中的补料分批发酵 |
关于与L-丙氨酸合成途径相关的转氨酶及其敲除后对其它产物的影响已经在谷氨酸棒杆菌中取得一定的研究进展[9, 15]。在谷氨酸棒杆菌中，合成L-丙氨酸的转氨酶为AlaT和AvtA。Marienhagen等[7]分析了谷氨酸棒杆菌中与L-丙氨酸合成相关的转氨酶在酶学和细胞水平及对产物形成等方面产生的差异，敲除活性最高的转氨酶AlaT使得胞外L-丙氨酸的积累量减少了80%，同时增加了L-缬氨酸的产量。Zhu等[8]对谷氨酸棒杆菌的丙氨酸转氨酶全部敲除并引入乙酰羟酸合成酶的减毒突变体，获得了一株高产的L-丝氨酸生产菌株且副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的积累分别降低了87%和60%。尽管在谷氨酸棒杆菌中已经证实，减少L-丙氨酸的合成能够增加诸如L-缬氨酸、L-丝氨酸等氨基酸的合成，但与谷氨酸棒杆菌不同的是大肠杆菌具有更复杂的L-丙氨酸转氨酶酶系[8, 10]。在谷氨酸棒杆菌中，谷氨酸棒杆菌缺失某一种（如AlaT）或缺失全部的L-丙氨酸转氨酶都可以获得L-丙氨酸含量大幅减少及目标产物产量明显提高的工程菌株。而与谷氨酸棒杆菌相比，大肠杆菌在缺失任意一种甚至两种（除缺失ΔAlaAΔAlaC外）的L-丙氨酸转氨酶所获得的工程菌在L-丙氨酸含量及目标产物产量方面并没有显著变化。尽管L-丙氨酸转氨酶AlaA、AlaC和AvtA全部缺失的菌株E. coli FS-T7发酵过程中L-丙氨酸含量最低，但其在目标产物L-色氨酸的产量方面却表现平平。因此，在大肠杆菌中还鲜见L-丙氨酸合成调控下的L-色氨酸的相关研究。
目前已经证实负责L-丙氨酸合成的3种最主要的L-丙氨酸转氨酶分别是AlaA、AlaC和AvtA，尽管这些酶在任意一种存在的情况下都能实现最佳生长，但AvtA与另外两种酶的活性却存在显著差异，其中AlaA和AlaC具有更高的通向L-丙氨酸合成的通量效率且二者活性的总和占据了大肠杆菌中总的L-丙氨酸转氨酶活性的90%，缺失其中任何一种的情况下都能够促进另外一种酶的表达[5, 10]。因此，由于AlaA和AlaC二者L-丙氨酸转氨酶的互补作用，在单独敲除其中任何一种时，L-丙氨酸含量并不会大幅降低。Kim等[10]研究发现在大肠杆菌体内当以丙酮酸作为碳源时可能还会存在其它几种转氨酶可以促进L-丙氨酸的合成。本实验摇瓶结果也验证了这一点，在3种酶全部缺失的情况下，尽管菌体生长明显受到影响且其最大生物量与亲本菌株相比大幅下降，但还会有少量的L-丙氨酸产生（约占3%）。然而尽管如此，摇瓶结果也表明在缺乏这3种最主要的转氨酶的情况下，工程菌的生长明显受到了抑制，其最大生物量也仅为亲本菌株一半。因此，AlaA、AlaC和AvtA三种酶的存在一起赋予了大肠杆菌L-丙氨酸合成的灵活性。即使对于AvtA来说，在大肠杆菌体内表现出很低的L-丙氨酸转氨酶活性且仅能够积累少量的L-丙氨酸，但相对于3种酶全部缺失而表现出巨大生长缺陷，单独存在的AvtA也能保证与亲本菌株相比相似的生长速率和生物量。
氨基酸稳态维持并调节细菌微生物群中细胞氨基酸库的平衡，丙氨酸通过可逆转氨反应的途径，从而连接关键的代谢网络，如发酵（通过丙酮酸）和氮代谢（通过天冬氨酸和谷氨酸）[5-6, 16-17]。在大肠杆菌体内合成L-丙氨酸的前体物是丙酮酸，同时也是细胞合成L-丙氨酸的直接供体。在发酵过程中L-丙氨酸的大量合成，丙酮酸的消耗势必增加，使得前体物DAHP的合成较少，L-色氨酸的积累也受到影响。因此，为了保证大肠杆菌工程菌正常生理代谢且最大化降低L-丙氨酸的积累，敲除AlaA和AlaC两种L-丙氨酸转氨酶，仅保留AvtA一种酶。当AlaA和AlaC两种酶被同时敲除后，与亲本菌株相比，被修饰后的工程菌在保持其正常生长代谢不变的情况下，L-丙氨酸的浓度大幅降低且L-色氨酸含量明显提高，表明L-丙氨酸的合成碳流被重新定向形成L-色氨酸。
本研究成功构建了两种L-丙氨酸转氨酶AlaA和AlaC缺失的工程菌株E. coli FS-T4，该工程菌并非L-丙氨酸转氨酶完全缺失型菌株，因此不需要额外添加L-丙氨酸就能保证菌株的正常生长代谢且一定程度地提高了目标产物L-色氨酸的产量，既节约了成本又避免了培养基的复杂化，也为后续工业化生产L-色氨酸提供了理论基础及应用价值。丙氨酸作为细胞内氨基酸池的重要氨基供体，L-丙氨酸合成的减少也可能对其它代谢产物产生一定影响。因此，在后续的研究工作中，我们将通过转录组及代谢组学的手段对胞内相关酶的转录及主要产物进行分析以探究代谢修饰对其产生的影响，并以此为理论基础有针对性的通过系统生物学的策略进一步提高L-色氨酸的产量。
4 结论本研究以大肠杆菌工程菌E. coli FS为出发菌株，利用Red重组技术成功敲除与L-丙氨酸合成相关的两个关键L-丙氨酸转氨酶基因alaA和alaC，摇瓶结果显示L-色氨酸产量可达6.08 g/L，提高了26.7%；丙氨酸含量0.16 g/L，降低了91.0%；最终菌体生物量与原始菌株基本一致。在50 L罐中补料分批发酵试验，结果显示L-色氨酸产量及糖酸转化率最高可达41.9 g/L和20.5%，分别较出发菌株提高了13.8%和5.1%。L-丙氨酸的积累大幅下降的同时，L-色氨酸的含量大幅提高。
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