随着集约化、规模化养殖业的发展，养殖废水中残饵、粪便的增加导致水体富营养化加剧。氮元素作为养殖水体中的污染物，主要以氨氮（NH4+-N）、亚硝氮（NO2--N）、硝氮（NO3--N）的形式存在。氨氮（NH4+-N）、亚硝氮（NO2--N）的存在对水生动物存在一定的危害。氨氮对水生动物的鳃Na+/K+-ATP酶[1]、组织结构[2-3]、血清抗氧化系统[4-5]、肠道微生物菌群[6]等均存在影响，同时亚硝酸盐氮作为硝化和反硝化过程中的中间产物，对水生动物的生长、免疫指标[7]、抗氧化指标[8]等也存在较大的影响。严重制约了养殖业的发展，可见养殖废水中氮的去除变得也更加重要。
目前，在处理养殖废水中，生物法是最常见、最有效的方法。传统的生物脱氮，认为自养硝化和厌氧反硝化是两个独立的过程。由于自养硝化速率低和厌氧反硝化相分离，这种生物处理方法显得耗时。自1983年，Robertson等[9]发现异养硝化-好氧反硝化菌以来，具有该功能的菌群得到广泛的关注。近年来，一些研究发现不动杆菌属（Acinetobacter sp.）[10-12]、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[13]、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）[14]具有高效异养硝化-好氧反硝化的能力。本研究从水产养殖池塘中采集养殖水体污泥样品，分别以氨氮、亚硝氮和硝态氮为唯一氮源富集并筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的酵母菌DW-1，通过形态学观察、26S rDNA序列分析，以及系统发育树构建对菌株DW-1进行鉴定，初步探讨碳源种类、C/N、培养温度、转速、初始pH值对该菌在异养硝化-好氧反硝化能力的影响，以期为皱褶念珠菌DW-1在养殖含氮废水生物处理中的推广应用奠定良好的基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种分离样品菌种分离样品取自湖南农业大学东湖水产养殖池塘污泥，装入灭菌玻璃广口瓶中，立即带回实验室进行菌种富集和分离。
1.1.2 培养基（1）液体种子种子培养基（YPD）：酵母提取粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、H2O 1 L。115℃，30 min灭菌。（2）平板分离培养基：K2HPO4 7 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO4 0.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min灭菌。（3）BM培养基：K2HPO4 7 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO4 0.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min灭菌。（4）反硝化培养基1：K2HPO4 7 g、KH2PO4 3 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaNO2 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min灭菌。（5）反硝化培养基2：硝酸钾10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、H2O 1 L。121℃、25 min灭菌。
1.1.3 主要试剂和药品K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、FeSO4·7H2O、CH3COONa、NaNO2、KNO3、NaCl、NaOH、磺胺、N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐、磷酸、酒石酸钾钠、过硫酸钾（AR，国药集团化学试剂有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（BR，上海盛思生化科技有限公司）；琼脂（BR，北京索莱宝科技有限公司）。
1.1.4 主要仪器设备立式恒温培养箱（ZQPL-200，天津市莱波特瑞仪器设备有限公司）；恒温振荡培养箱（ZQLY-180N，上海知楚仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（SP-752，上海光谱仪器设备有限公司）；高压灭菌锅（G154DWS，至微仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（LD-9123A，上海龙跃仪器设备有限公司）；分析天平（AL204，奥豪斯仪器（上海）有限公司）；高速冷冻离心机（GR-21G，上海赵迪生物科技有限公司）；DNA电泳槽（DYCP-31DN，北京六一仪器厂）；稳压电泳仪（DYY-5，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（FR980，上海复日科技仪器有限公司）；PCR仪（2720 thermal cycler，Applied Biosystems）。
1.2 方法 1.2.1 菌株的筛选分离 1.2.1.1 菌株的富集取10 g养殖池塘污泥加入100 mL的富集培养基中（加入适量的破玻璃珠），置于30℃、170 r/min摇床中培养72 h。
1.2.1.2 菌株初筛取10 mL富集液加入90 mL的无菌水中振荡15 min后，采用10倍稀释法稀释成10-1-10-8，分别取0.1 mL不同梯度的菌悬液涂布于硝化和反硝化固体培养基平板上，倒置于30℃恒温培养箱中培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取不同的单菌落进行分离纯化并编号。
1.2.1.3 菌株复筛将分离纯化的菌种分别接种于种子培养基中，于30℃、170 r/min培养24 h后，将种子液按1%（V/V）接种于硝化培养基和反硝化液体培养基1中，置于30℃、170 r/min的摇床中振荡培养48 h，测定NH4+-N、NO2--N的含量。
按1%（V/V）接种于反硝化培养基2中，置于30℃恒温培养箱中，静止培养24 h后观察产气情况。
1.2.2 菌株形态观察将保存的菌株，在PDA固体培养基平板上进行划线，并倒置于30℃恒温培养箱中静止培养24 h后，观察其菌落形态，并进行简单染色观察其菌体形态特征。
1.2.3 菌株的鉴定用YPD培养基培养菌株DW-1 24 h后，采用上海生工生物工程DNA提取试剂盒（SK8257）进行DNA提取。以提取的基因组DNA为模板，扩增26S rDNA基因片段。正向引物序列：NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物序列：NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。PCR扩增反应体系为25 μL，包括10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、Taq酶0.2 μL、正向引物（10 μmol/L）0.5 μL、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，加双蒸水定容至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性45 s；55℃退火45 s；72℃延伸1 min；72℃延伸10 min；4℃保存。测序由上海生工生物工程有限公司完成。通过BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）将26S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，并提交给GenBank。采用NJ法，用MEGA7.0.26构建系统发育树。
1.2.4 菌株DW-1除氮特性的研究采用单因素试验法，改变BM培养基中的碳源种类、C/N、初始pH、温度、转速等，考察其对菌株DW-1脱氮性能的影响。碳源种类：选取蔗糖、丁二酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠分别替代乙酸钠作为碳源，探究碳源对菌株DW-1除氮性能的影响；C/N比：固定氨氮的浓度为52.29 mg/L，以乙酸钠作为唯一碳源，分别将C/N比调节为10、15、20、25、30；初始pH值：使用5 mol/L的HCl或NaOH溶液调节培养基初始pH为2、4、6、8、10；培养温度：将培养温度设置为20、24、28、32和36℃；为：将培养碳源，130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min。接种量为1%（V/V），装量为100 mL /300 mL三角瓶。重复3次。
1.2.5 测定方法氨氮、亚硝酸盐氮、总氮的测定参照《水和废水监测分析方法》[15]。氨氮（NH4+-N）测定采用纳氏试剂法、硝酸盐氮（NO3--N）测定采用紫外分光光度法、总氮（TN）采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法。
2 结果 2.1 菌株的分离鉴定从富集培养基中分离出20株具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株，通过复筛和产气试验，从中筛选出1株具有对氨氮和亚硝氮去除率较高的菌株，命名为DW-1。其在PDA培养基上的菌落形态特征为（图 1）：圆形，乳白色，表面湿润，不透明；显微形态特征为：椭圆形，出芽生殖，具有典型的酵母菌细胞特征。经26S rDNA序列分析，菌株DW-1序列全长为504 bp，其26S rDNA序列与Diutina rugosa（登录号MG228369.1）有100%的序列相似性（图 2）。结合形态学特征和分子生物学分析，初步鉴定菌株DW-1为皱褶念珠菌DW-1（Diutina rugosa DW-1）。
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| 图 1 DW-1菌株平板菌落形态特征 |
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| 图 2 基于26S rDNA序列同源性构建DW-1菌株的系统发育树 |
试验结果如图 3所示。不同碳源条件下菌株D. rugosa DW-1对氨氮和总氮的去除率存在显著性影响（P < 0.05）。在以乙酸钠为碳源时，36 h内氨氮和总氮的去除率分别达83.99%和53.24%，而以蔗糖、柠檬酸钠、酒石酸钠和丁二酸钠为碳源时，总氮和氨氮去除率均较低，但在所使用的碳源中，亚硝酸盐的积累量均小于0.04 mg/L。所以选择乙酸钠作为唯一碳源进行后续试验。
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| 图 3 不同碳源条件下菌株DW-1除氮特性 |
探究了5种不同的C/N对菌株硝化和反硝化能力的影响，结果（图 4）表明，在C/N为10-30存在显著影响（P < 0.05）。随着C/N的增加，氨氮和总氮的去除率也随之增加。当C/N为25：1时，氨氮和总氮的去除率最高，分别为88.30%和50.31%。但当C/N大于25：1后，氨氮和总氮去除率均有所下降。原因为C/N过低，培养基中氮素含量高，导致微生物生长繁殖所需碳素营养的供应受到限制；而C/N过高，培养基中碳素含量高，影响碳素的利用以及改变菌株的代谢途径甚至抑制细胞中氨氮加氧酶、羟胺氧化酶、硝酸盐还原酶或亚硝酸还原酶的活性，从而影响氨氮和总氮的去除。
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| 图 4 不同C/N条件下菌株DW-1除氮特性 |
如图 5所示，不同的pH值对菌株DW-1氨氮和总氮的去除率有显著影响（P < 0.05）。在pH值为5-8之间，氨氮去除率均高于80%；但培养基pH值高于7，氨氮和总氮去除率均有所下降。当培养基pH值为6.0时总氮去除率最高，达到56.79%；而氨氮去除率中最高的pH值为7.0，达到88.71%，且pH对亚硝酸盐的积累并无显著的影响（P > 0.05）。
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| 图 5 不同pH值条件下菌株DW-1除氮特性 |
温度对菌株D. rugosa DW-1氨氮和总氮去除率存在显著性差异（P < 0.05）。从图 6结果可以看出，菌株DW-1在20-36℃之间均能去除解氨氮和总氮，且氨氮和总氮去除率随着温度的升高而升高。当培养温度为32℃时，氨氮和总氮去除率分别为89.59%和50.72%。当培养温度超过32℃后，菌株对氨氮和总氮的去除率下降。主要原因是由于温度的升高，游离氨的浓度增加，进而提高了硝化和反硝化速率，且温度对菌株DW-1积累亚硝氮无显著性影响（P > 0.05）。
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| 图 6 不同培养温度条件下菌株DW-1除氮特性 |
通过调节恒温振荡培养箱的转速来调节溶氧量，以探究溶氧对菌株D. rugosa DW-1氨氮和总氮去除率的影响。由图 7结果可知，转速在130-210 r/min之间，对菌株氨氮和总氮去除率均无显著影响（P > 0.05），而菌株D. rugosa DW-1在130 r/min-210 r/min之间，氨氮去除率在87.29%-95.01%，总氮去除率在45.09%-50.59%，且亚硝酸盐的积累量均小于0.01 mg/L。
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| 图 7 不同摇床转速条件下菌株DW-1除氮特性 |
在碳源试验中，菌株DW-1只有在乙酸钠作为唯一碳源时，才具有较高的异养硝化反硝化能力，这与Acinetobacter sp. Y16[10]结果一致；而当蔗糖、柠檬酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠分别作为唯一碳源时，菌株DW-1的硝化能力较弱，且均在20%以下，与P. stutzeri HJ-7[16]以柠檬酸钠为碳源具有最好的脱氮效果，P. putida YH[17]在琥珀酸钠作为唯一碳源时具有最高的脱氮率的试验结果不同，但与Ren等[11]、Chen等[12]试验结论一致。可见不同的碳源对异养硝化好氧反硝化细菌除氮能力存在影响。
菌株DW-1需要较高的C/N才能进行硝化和反硝化，目前报道的大多异养硝化-好氧反硝化细菌在C/N=10-15之间，具有最佳的除氮率[13, 18]。而Huang等[10]和Jin等[19]发现一些菌株能够在低碳氮比下进行异养硝化-好氧反硝化作用，但本菌株当C/N为25：1时，氨氮和总氮的去除率最高。
环境pH值和培养温度也是影响微生物消化和反硝化能力的主要因素。有研究表明，Vibrio diabolicus SF16[20]和Acinetobacter sp. T1[12]在pH值大于7.0时氨氮去除率较好，但也有研究发现有些细菌只能在微碱性条件下进行硝化作用[9]，且大部分菌株均能够在20-40℃之间进行硝化和反硝化作用[21-24]。本研究发现菌株DW-1在微酸性、中性、微碱性和培养温度20-36℃条件下均具有较强的硝化和反硝化能力。
好氧微生物生长和代谢都需要氧气，氧气浓度的高低主要影响微生物细胞中各种氧化酶系如过氧化氢酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等的活力。培养基中氧气浓度主要通过提高摇床转速和搅拌速率等实现。许多研究表明摇床转速对菌株的硝化速率存在显著性影响（P < 0.05）[10, 25-26]，但本研究菌株DW-1的硝化和反硝化速率与摇床转速无显著性差异（P > 0.05）。
4 结论本研究在养殖污泥中筛选出一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的酵母菌，经26S rDNA序列分析结果，菌株DW-1与D. rugosa（登录号MG228369.1）比对有100%的序列相似性，确定DW-1为D. rugosa，并命名为D. rugosa DW-1。在以乙酸钠为唯一碳源，C/N为25，pH值为6、温度为32℃、转速为170 r/min的情况下，菌株DW-1具有最佳的氨氮降解率和总氮去除率，分别为94.94%、48.69%，而整个过程中亚硝氮积累量0.067 mg/L。
| [1] |
胡毅, 黄云, 钟蕾, 等. 氨氮胁迫对青鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响[J]. 水产学报, 2012, 36(4): 538-545. |
| [2] |
陈思涵, 彭瑞冰, 黄晨, 等. 急性氨氮胁迫对虎斑乌贼肝脏、鳃和脑组织结构的影响[J]. 水产学报, 2018, 42(9): 1348-1357. |
| [3] |
张武肖, 孙盛明, 戈贤平, 等. 急性氨氮胁迫及毒后恢复对团头鲂幼鱼鳃、肝和肾组织结构的影响[J]. 水产学报, 2015, 39(2): 233-244. |
| [4] |
任海, 李健, 李吉涛, 等. 急性氨氮胁迫对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)抗氧化系统酶活力及GPx基因表达的影响[J]. 农业环境科学学报, 2014, 33(4): 647-655. |
| [5] |
刘亚娟, 胡静, 周胜杰, 等. 急性氨氮胁迫对尖吻鲈稚鱼消化酶及抗氧化酶活性的影响[J]. 南方农业学报, 2018, 49(10): 2087-2095. DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.27 |
| [6] |
戚晓舟.氨氮胁迫对鲫免疫系统及肠道菌群结构的影响[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2017. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1017091421.htm
|
| [7] |
赵艳飞, 宋志飞, 王贤丰, 等. 亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹相关免疫指标的影响[J]. 广西科学, 2017, 24(4): 382-388. |
| [8] |
胡静, 周胜杰, 杨蕊, 等. 亚硝酸盐胁迫对尖吻鲈稚鱼抗氧化酶活性及皮质醇的影响[J]. 海洋科学, 2018, 42(4): 132-140. |
| [9] |
Robertson LA. Aerobic denitrification:A controversy revived[J]. Archives of Microbiology, 1984, 139(4): 351-354. DOI:10.1007/BF00408378 |
| [10] |
Huang X, Li W, Zhang D, et al. Ammonium removal by a novel oligotrophic Acinetobacter sp. Y16 capable of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification at low temperature[J]. Bioresour Technol, 2013, 146: 44-50. DOI:10.1016/j.biortech.2013.07.046 |
| [11] |
Ren YX, Yang L, Liang X. The characteristics of a novel heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium, Acinetobacter junii YB[J]. Bioresour Technol, 2014, 171: 1-9. DOI:10.1016/j.biortech.2014.08.058 |
| [12] |
Chen S, He S, Wu C, et al. Characteristics of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacterium Acinetobacter sp. T1 and its application for pig farm wastewater treatment[J]. J Biosci Bioeng, 2019, 127(2): 201-205. DOI:10.1016/j.jbiosc.2018.07.025 |
| [13] |
He T, Ye Q, Sun Q, et al. Removal of nitrate in simulated water at low temperature by a novel psychrotrophic and aerobic bacterium, Pseudomonas taiwanensis strain J[J]. BioMed Research Interna-tional, 2018(12b): 1-9. |
| [14] |
Li D, Liang X, Jin Y, et al. Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Klebsiella sp. TN-10[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2019, 188(2): 540-554. DOI:10.1007/s12010-018-02932-9 |
| [15] |
国家环境保护总局. 水和废水监测分析方法[M]. 第4版. 北京: 中国环境科学出版社, 2002.
|
| [16] |
刘淳, 李永红, 刘颖颖, 等. 1株高效异养硝化细菌的分离鉴定及硝化特性[J]. 环境科学与技术, 2019, 42(3): 152-157. |
| [17] |
汪旭晖, 杨垒, 任勇翔, 等. 异养硝化细菌Pseudomonas putida YH的脱氮特性及降解动力学[J]. 环境科学, 2019, 40(4): 1892-1899. |
| [18] |
Duan J, Fang H, Su B, et al. Characterization of a halophilic heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium and its application on treatment of saline wastewater[J]. Bioresour Technol, 2015, 179: 421-428. DOI:10.1016/j.biortech.2014.12.057 |
| [19] |
Jin P, Chen Y, Zheng Z, et al. Evaluation of a novel low-carbon to nitrogen-and temperature-tolerant simultaneously nitrifying-denitrifying bacterium and its use in the treatment of river water[J]. RSC Advances, 2018, 8(48): 27417-27422. DOI:10.1039/C8RA04697B |
| [20] |
Chen M, Wang W, Feng Y, et al. Impact resistance of different factors on ammonia removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Aeromonas sp. HN-02[J]. Bioresour Technol, 2014, 167: 456-461. DOI:10.1016/j.biortech.2014.06.001 |
| [21] |
Zhang QL, Liu Y, Ai GM, et al. The characteristics of a novel heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7[J]. Bioresour Technol, 2012, 108: 35-44. DOI:10.1016/j.biortech.2011.12.139 |
| [22] |
Yang JR, Wang Y, Chen H, et al. Ammonium removal characteristics of an acid-resistant bacterium Acinetobacter sp. JR1 from pharmaceutical wastewater capable of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Bioresour Technol, 2019, 274: 56-64. DOI:10.1016/j.biortech.2018.10.052 |
| [23] |
Guo Y, Zhou X, Li Y, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel Halomonas campisalis[J]. Biotechnology Letters, 2013, 35(12): 2045-2049. DOI:10.1007/s10529-013-1294-3 |
| [24] |
Ye Q, Li K, Li Z, et al. Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification performance of strain Y-12 under low temperature and high concentration of inorganic nitrogen conditions[J]. Water, 2017, 9(11): 835. DOI:10.3390/w9110835 |
| [25] |
Zhang QL, Liu Y, Ai GM, et al. The characteristics of a novel heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7[J]. Bioresour Technol, 2012, 108: 35-44. DOI:10.1016/j.biortech.2011.12.139 |
| [26] |
Liu Y, Ai GM, Wu MR, et al. Photobacterium sp. NNA4, an efficient hydroxylamine-transforming heterotrophic nitrifier/aerobic denitrifier[J]. J Biosci Bioeng, 2019, 128(1): 64-71. DOI:10.1016/j.jbiosc.2018.12.014 |