DNA甲基化修饰是基因表达调控的主要表观遗传机制之一^[1]，TET2是TET家族（TET1、TET2、TET3）的一员，TET蛋白利用α-KG、Fe²⁺及O₂将DNA中5mC氧化为5hmC，并继续通过TET蛋白酶催化5hmC氧化化为5fc和5caC，5mC氧化衍生物，5caC可由脱羧基或者碱基切除完成去甲基化^[2-5]。越来越多的研究表明，TET2是血细胞形成的主要调控因子，与血液瘤密切相关。TET2突变和缺失发生在急性髓细胞白血病（AML）、慢性粒单核细胞白血病（CMML）、骨髓增生障碍综合征（MDS）和骨髓增生性肿瘤（MPN）中^[6-7]，TET2的突变导致Tet2蛋白功能缺失，至使5hmC含量降低，无法抑制甲基化DNA与相关蛋白结合产生沉默作用，导致骨髓造血干细胞加快增殖^[8]。近期研究发现，TET2的缺失可改变细胞的表观遗传环境，改变了细胞的分化状态和增殖能力，导致早期干细胞获得克隆性生长优势，促进了人类记忆CAR-T细胞的发育，提高CAR-T细胞的疗效和持久性，使其能够引发有效的抗肿瘤反应^[9-11]。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌体内的获得性免疫系统，被用来对抗侵略细菌的外源DNA，质粒和噬菌体。Cas9蛋白是一种DNA内切酶，拥有两个核酸酶结构域，因此可以同时对双链DNA进行切割。其具体过程是Cas9先和crRNA、tracrRNA结合形成复合体，然后在PAM序列的引导下侵入外源DNA，进而形成RNA-DNA中间结构，再对靶DNA进行切割，使其双链断裂。此时机体通过同源末端修复或非同源末端修复来填补断裂的缺口^[12-14]。

目前，由于T细胞用化学试剂转染效率低，CAR-T技术采用重组慢病毒载体对T细胞进行基因编辑，然而重组病毒随机整合基因组有着不可预估的风险^[15-17]。细胞电转染（Electroporation），是把外源大分子物质DNA、RNA、siRNA、蛋白质等以及一些小分子导入细胞膜内部的重要方法，电转过程对细胞毒性很小。使用体外表达的Cas9蛋白与转录的TET2 gRNA孵育形Cas9/gRNA核糖核蛋白复合物通过电转染的方式导入T细胞内，能快速高效的对目的基因进行编辑，避免了随机整合的问题，且敲除效率高，Cas9蛋白半衰期短，因此也能大限度的减少脱靶和镶嵌现象^[18-20]。

本工作以人T细胞为对象，优化T细胞电转条件，利用电转Cas9 RNP对TET2基因高效敲除，并探究了该基因对T细胞增殖的影响，旨在为CAR-T细胞治疗奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

人新鲜外周血来自实验室同学捐献。X-VIVO15（LONZA）、Ficoll（GE Healthcare）、IL-2、CD3、CD28均来自北京同立海源生物科技有限公司。

大肠杆菌E.coli BL21和DH5α感受态购自于北京全式金生物科技有限公司，pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0和pET28a+来源于Addgenes，pET28a-Cas9-NLS-6xHis质粒由上述两质粒构建而成（图 1-A）。TET2基因敲除sgRNA序列相对应的寡核苷酸由擎科生物科技有限公司合成，Agarose琼脂糖、异丙基硫代半乳糖苷Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、蛋白酶抑制剂Phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF）、咪唑均购自美国Sigma公司；质粒小提试剂盒、基因组提取试剂盒、片段纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；T7体外转录试剂盒购自唯尚立德生物科技有限公司；T7E Ⅰ酶切试剂盒购自NEB公司；Ni-NTA亲和树脂购自德国QIAGEN公司；BamH Ⅰ限制性内切酶购自Thermo Fisher公司

1.2 方法 1.2.1 Cas9蛋白表达与纯化

以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0为模板通过体外PCR扩增方式获得Cas9蛋白CDS区，所设计的上游引物为5'-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCGACAAGAAGTACAGCATCGGC-3'；所设计的下游引物为5'-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGC-3'。产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小是否正确以及单一，纯化回收PCR产物-20℃保存备用。Fast Digest Bam HI Enzyme（Thermo Fisher）对大肠杆菌蛋白表达载体pET28a+进行酶切纯化。不依赖于连接反应的高效克隆方法（Ligation-independent cloning，LIC）将Cas9蛋白CDS区与酶切后的pET28a+载体通过同源重组的方式进行构建连接。将重组载体转化进行一代测序，BioEdit软件分析重组载体是否成功构建以及是否基因突变，成功构建pET28a-Cas9-NLS-6xHis后-20℃保存待用。

在大肠杆菌蛋白表达系统中进行Cas9蛋白表达纯化，选择Rosetta（DE3）大肠杆菌作为表达菌株。首先将pET28a-Cas9-NLS-6xHis载体转化至Rosetta（DE3）感受态细胞中，转化后涂板挑取单克隆加入无抗性LB培养基37℃震荡培养。取部分菌液测序验证转化是否成功，继续活化扩培菌液，将种子液按照1:100的比例加入至含卡那霉素抗性的LB培养基中37℃震荡培养，当大肠杆菌长至对数生长期既OD₆₀₀为0.6-1.0时将培养温度调为18℃，加入1 mmol/L IPTG进行Cas9蛋白诱导表达12 h。诱导完毕后离心收集菌泥，以裂解液重悬菌泥进行超声破碎菌体，离心收取菌液上清。Ni填料能与HIS标记蛋白螯和在一起，使用Ni填料能够将Cas9蛋白从蛋白上清液中分离出来。Ni填料与蛋白上清液4℃摇床孵育2 h后，用分别含20、50 mmol/L咪唑的清洗液洗去镍填料中携带的杂蛋白，含300 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱镍填料结合的Cas9目的蛋白，收集洗脱样品进行SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色和His抗体蛋白印记检测Cas9蛋白纯度。以不含咪唑的洗脱液为置换液使用蛋白超滤浓缩管置换出洗脱液中的咪唑，测定蛋白浓度保存至-80℃待用。

1.2.2 sgRNA体外转录

设计人类TET2基因CRISPR/Cas9基因敲除sgRNA序列（表 1），以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0为敲除载体构建pX459-h-TET2重组载体，测序验证载体是否构建成功。设计T7-gRNA引物以pX459-h-TET2模板进行体外扩增，得到1个由crRNAs和tracrRNAs共同组成gRNA长约110 bp的片段。将获得的PCR产物纯化回收，取1 μg产物用T7体外转录试剂盒转录，完成后加入DNase I 37℃反应40 min，纯化回收后测RNA浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，-80℃保存待用。

1.2.3 sgRNA及Cas9蛋白活性验证

将表达纯化的Cas9蛋白取5 μg，sgRNA 0.5 μg，TET2片段模板1 μg（HEK-293细胞基因组PCR获得，所设计的上游引物为5'- AGTAGATCAGGAGGAGGCACA-3'；下游引物为5'- ATTCTGGCTTCCCTTCATACA-3'），在Fast digest buffer中37℃反应1 h，酚氯仿异戊醇纯化回收，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Cas9蛋白切割效率开。

1.2.4 PBMC细胞中分离T细胞培养

使用Ficoll-Paque在人新鲜全血中分离获得外周血单核细胞（PBMC），X-VIVO15（LONZA）培养基对分离后的PBMC进行培养。Human T cell Isolation Kit试剂盒（Miltenyi）分离纯化PBMC细胞中的T细胞，分离得到的T细胞在体外使用X-VIVO 15培养基培养。人类T细胞进行电转染后培养基中需加入抗人CD3单克隆抗体与抗人CD28当克隆抗体200 ng/mL、白细胞介素2（IL2）40 ng/mL刺激T细胞活化生长，电转染48 h后培养基中只需加入IL2刺激生长即可。

1.2.5 T细胞电转Cas9-TET2gRNA核糖核蛋白

按照3:1的比例将Cas9蛋白与TET2 gRNA进行体外孵育形成Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物（RNP），将3×10⁶ T细胞使用20 μL电转缓冲液重悬，加入Cas9-TET2 gRNA复合物（Cas9 3 μg，TET2 gRNA 1 μg）进行电转染，电转条件为850 V、20 ms，以电转绿色荧光蛋白GFP作为阳性对照，电转后加入X-VIVO15（LOZA）培养基培养。

1.2.6 TET2基因敲除验证

T细胞电转染48 h后，提取细胞基因组，在sgRNA对应基因组位置设计验证引物进行体外片段扩增，将目的片段进行测序验证是否造成基因突变，并且使用T7E Ⅰ核酸内切酶进行敲除效率验证。

1.2.7 TET2基因缺失对T细胞增殖的影响

在T细胞中对TET2基因敲除之后，验证TET2的缺失是否会对T细胞的生长增殖产生影响。使用台盼蓝细胞计数法检测T细胞存活率以及细胞数量。通过流式细胞分析仪检测不同时间点CD4、CD8阳性T细胞的比例。

2 结果 2.1 Cas9蛋白表达

通过原核表达系统在Rosetta（DE3）大肠杆菌中诱导表达Cas9蛋白，成功的获得带有核定位信号的重组Cas9蛋白，其分子量大小为160 kD。Ni填料与His标签特异性亲和层析纯化，50 mmol/L咪唑的洗液能够去除Ni填料上杂蛋白，含300 mmol/L咪唑洗脱液将Cas9蛋白从Ni填料上洗脱下来。纯化后的蛋白通过考马斯亮蓝染色与蛋白印记孵育His标签抗体检测表达纯化后的蛋白条带单一无杂带，得到纯度较高的Cas9蛋白（图 1）。

2.2 Cas9蛋白活性及TET2 gRNA靶点切割效率鉴定

表达纯化的Cas9蛋白以阳性gRNA与基因片段为模版进行体外酶切实验，表达纯化的Cas9蛋白能够将基因片段在sgRNA位置处对目的基因片段进行切割，琼脂糖凝胶电泳观察目的基因片段被切割成两条小片段，大肠杆菌诱导表达Cas9蛋白具有酶切活性。表达的Cas9蛋白与TET2 gRNA形成核糖核蛋白复合物后能够可以高效的切割TET2基因片段（746 bp），Cas9蛋白酶切后产生大小为490 bp和256 bp的片段（图 2），设计的TET2 gRNA在体外能够识别靶标基因并引导Cas9蛋白对靶标序列进行切割。

2.3 T细胞电转染效率及TET2基因敲除效率检测

将Cas9 TET2 gRNA核糖核蛋白复合物通过电转染的方式导入T细胞中，绿色荧光蛋白GFP作为阳性对照。通过流式细胞仪分析结果显示44.1%的T细胞通过电转染导入绿色荧光蛋白细胞发出绿色荧光，使用Lipofectamine2000转染效率较低，只有1%的T细胞通过脂质体转染发光，常规化学转染方式不能有效的将外源蛋白和质粒转染进入T细胞内，电转染的方式能够高效率的将外源蛋白或质粒带入T细胞内（图 3）。T7核酸内切酶（T7E Ⅰ）能够识别不完全配对的双链DNA，T7E Ⅰ能够在非配对处对DNA链进行切割。通过T7E Ⅰ酶切能够检测基因敲除效果，T7E Ⅰ能够在TET2基因靶位点处将基因片段切割成两条片段，表明在sgRNA对应的基因组位置碱基序列发生了基因突变。将TET2基因组上sgRNA序列特异性体外扩增测序发现，在sgRNA位置后TET2基因发生移码突变，表明T细胞中的TET2基因被成功敲除（图 4）。

2.4 TET2敲除对T细胞增殖的影响

PBMC中分离纯化的T细胞在电转染2 d内，细胞由于电穿孔损伤会使部分细胞死亡，活细胞数量统计显示死亡率为42.1%，在培养基中加入IL-2、CD28等细胞因子的刺激下T细胞培养2 d后开始增殖。之前研究表明T细胞在体外生长一段时间，随着时间的延长T细胞会逐渐死亡。在T细胞中敲除去甲基化酶TET2后，T细胞的生存时间及增殖速率发生变化。野生型T细胞在体外培养至20 d左右时细胞活率逐渐下降细胞数减少且状态变差。T细胞缺失TET2基因后细胞在体外培养20 d依然表现出良好的生长状态，细胞活率与数量明显高于野生型细胞。台盼蓝作为一种细胞染料能够特异性的将死细胞染成蓝色，通过台盼蓝计数的方式能够检测细胞增殖数量。在T细胞中敲除TET2基因后，敲除型T细胞比野生型T细胞细胞数量增殖显著加快（图 5）。CCK能够与活细胞线粒体内的脱氢酶形成还原性可溶物甲臜，甲臜的检测数与活细胞细胞数成正比，从而间接检测出随着培养时间的延长细胞增殖情况（图 6）。CCK结果显示当T细胞缺失TET2后细胞的增殖速率以及体外培养时间长于野生型T细胞，野生型T细胞体外培养活力逐渐降低的同时缺失TET2的T细胞还保持着良好的生长状态。实验结果显示在T细胞中缺失TET2基因后能够延长T细胞在体外培养时间，同时在电转16 d后流式细胞术检测T细胞表面CD4和CD8分子，结果（图 7）显示野生型与敲除型无明显差异，表明TET2的敲除使T细胞的功能并未受到影响。但是TET2基因是如何调节T细胞在体外培养时间的还并未详知，也许TET2作为去甲基化酶调节细胞周期活动具有相关性。

3 讨论

T淋巴细胞作为人体细胞免疫的重要成分，T细胞在淋巴细胞中数量最多，其由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，为功能最复杂的一类细胞。T细胞行使正常功能对人类抵御疾病非常重要，2012年美国科学家以HIV病毒为载体将T细胞进行改造使其可以杀伤人体内白血病细胞。CAR-T免疫细胞治疗主要以慢病毒载体对T细胞进行基因改造，由于常规的化学转染试剂对于T细胞转染效率较低，在T细胞中基因编辑的研究相对较少且具有一定难度，且还未有在T细胞基因组原位插入嵌合抗原受体（CAR）的CAR-T细胞出现。CRISPR/Cas9基因编辑技术发现与古细菌天然免疫防疫机制，是继锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）与类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）之后的流行性较广使用方便的基因编辑技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术以sgRNA作为向导对靶基因进行特异性的指向，然后在Cas9蛋白作用下将DNA双链切割导致断裂，然后在非同源末端修复时产生碱基的插入或者缺失形成错配而将目的基因敲除，造成基因功能的缺失。

通过向宿主细胞输运CRISPR Cas9/gRNA核糖核蛋白复合物（Cas9 ribonucleoprotein complexes，Cas9 RNP）是进行各种基因编辑、基因表达调控、是进行基因编辑的重要方法。由于快速高效、脱靶率低、不需要优化密码子和启动子等，该方法易应用于进一步的基因治疗和临床研究中。电转染（Electroporation）是一种简单高效的蛋白转染方式。应用该技术，不仅能将Cas9 RNP直接导入细胞质，而且能够使其穿过核膜进入细胞核，从而快速高效地目标基因进行编辑。因此，在基于电转技术的Cas9 RNP基因编辑研究中，通过电转染对该复合物基因编辑效率的影响具有十分重要的意义。

本研究构建了携带有核定位信号的Cas9蛋白表达载体，在大肠杆菌蛋白表达系统中诱导Cas9蛋白表达。由于大肠杆菌蛋白表达系统均有操作方便快捷、时间周期短、获得蛋白量大等特点，能够在短时间内获得大量的Cas9蛋白。人为在Cas9蛋白C端融合表达了6个组氨酸，His标签能够特异性的与Ni填料结合，含不同浓度梯度咪唑的洗脱液将杂蛋白和目的蛋白洗脱下来，从而特异性的分离纯化Cas9蛋白。考马斯亮蓝染色与anti-His蛋白印记结果显示得到纯度较高且条带单一的目的Cas9蛋白。在pX459敲除载体上构建pX459-H-TET2重组敲除载体，体外扩增的方式获得靶标目的基因的tracrRNA/crRNA DNA片段，在T7转录酶的作用下将片段转录为RNA。通过体外酶切实验，诱导表达的Cas9蛋白能够在以TET2 sgRNA序列指引下对靶标基因片段特异性的切割，验证了Cas9蛋白以及TET2 gRNA的有效性，这也有助于体外基因诊断试剂的开发。

之前的研究表明TET2缺失对造血系统发育有影响，TET2缺失的小鼠表型出现骨髓增生，包括脾肿大、单核细胞增多和髓外造血，造血干细胞增多，干细胞自我更新加快和髓外造血功能增强，这提示TET2功能不全可能有助于体内造血转化^[21]。在TET2缺失小鼠模型上对T细胞的研究表明TET2促能进CD4+Th细胞分化^[21]。TET2与TET3能协同稳定调节性T细胞中Foxp3的表达，且在急性病毒感染期间，体内缺乏TET2的CD8+T细胞中细胞因子的产生和效应分子的表达增加。缺乏TET2的记忆细胞具有完整的扩张和效应反应，并具有更强的病原体清除能力^[22-23]。2018年5月，Carl H.June团队^[24]报道了一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者在2013年接受CAR-T治疗，第一次接受CAR-T治疗发生了细胞因子风暴（CRS），给予IL-6阻断剂后得到缓解。随后又接受第二次CART治疗，第二年骨髓内慢性淋巴细胞白血病（CLL）为阴性。第三年骨髓中仍可检出CAR-T细胞，到第五年CLL并未复发。检测发现患者的TET2基因有一个拷贝发生突变并将Anti-CD19 CAR序列插入到TET2基因上。正常情形下，TET2基因调节血细胞的形成，并限制这些细胞的生长。一旦TET2基因被破坏，单个CAR-T细胞大量增殖并消灭这名患者所患的白血病细胞。因此，CAR-T细胞中TET2缺失足以在晚期白血病中介导强大的抗肿瘤作用。目前对于T淋巴细胞基因编辑主要还是以慢病毒载体与“睡美人”转座子载体为主，上述载体的作用原理均是通过不同作用方式随机整合在细胞基因组内，可能会造成宿主基因突变导致肿瘤的形成，或者是整合致死等风险。CRISPR/Cas9技术在靶标基因位点进行基因编辑能够有效避免慢病毒载体造成的不利影响。然而常规的化学转染试剂对于T淋巴细胞转染效率很低，采用电转染的方式将外源DNA或者蛋白质导入到T淋巴细胞内是主要的研究方法。由于RNP具有较高的基因编辑效率，在体外将Cas9蛋白与TET2 gRNA形成Cas9 RNP复合物电转染进入T淋巴细胞内，通过T7E Ⅰ体外酶切与靶基因组测序结果显示，将Cas9蛋白与TET2 gRNA电转进入T细胞内能够实现对宿主细胞TET2基因高效率的敲除，T淋巴细胞在缺失TET2基因后，T细胞能够表现出无限增殖的能力，细胞数量随着培养时间延长而逐渐增多。这些结果与上述TET2基因的功能相一致，有可能加强CAR-T的免疫治疗效果。

4 结论

本研究中使用核糖核蛋白复合物通过电转染方式在T细胞中成功敲除TET2基因，T细胞缺失正常TET2蛋白表达后，细胞增殖速率加快且在体外培养时间延长。