2. 中国农业大学食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083;
3. 农业部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京 100083;
4. 中粮营养健康研究院有限公司 营养健康与食品安全北京市重点实验室 老年营养食品研究北京市工程实验室 北京市畜产品质量安全源头控制工程技术研究中心，102209
2. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health of China Agricultural University, Beijing 100083;
3. Key Laboratory of Safety Assessment of Genetically Modified Organism(Food Safety), Ministry of Agriculture, Beijing 100083;
4. Nutrition & Health Research Institute, COFCO Corporation, Beijing Key Laboratory of Nutrition & Health and Food Safety, Beijing Engineering Laboratory for Geriatric Nutrition Food Research, Beijing Livestock Product Quality and Safety Source Control Engineering Technology Research Center, Beijing 102209
病原微生物是一种可以导致动物、植物和人类疾病的微生物。常见的病原微生物包括疟原虫、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli，简称E.coli）和沙门氏菌等[1]。食源性疾病每年造成数百万人住院甚至死亡，极大地危害人类和动植物的健康，造成巨大的经济损失。为了预防这种食源性病病暴发和尽量减少其持续流行所造成的影响，需要开发一种快速、灵敏及低成本的检测方法在食源性病病出现的早期阶段准确地识别致病病原体。虽然现在有很多病原体的检测方法，但几乎都无法同时满足以下5个要求：高特异性（只检测目标细菌）；高灵敏度（能检测到单个活细菌细胞），短时间出结果（几分钟到几个小时）；操作简单（不需要冗长的取样过程和使用专门的设备）及较低成本。例如，传统的病原微生物检测方法需要较为复杂的步骤[2]，包括分离培养及一系列生化测试，且检测时间很长（通常是5-7 d乃至更长时间），所以不能很好地应用于现场快速测试[3]。而基于PCR和抗体的技术虽然提供较短的时间（几小时到几天），但需昂贵的试剂和复杂的设备[4-6]。因此，亟待开发新的病原微生物检测方法以满足实际需求。
近年来，生物传感器因其快速、灵敏及高特异性的特性已逐渐被用于病原微生物检测[7]。生物传感器是一类通过生物活性物质间特异性识别产生的生物信息元素结合适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管及压电晶体等）及信号放大装置构成的分析工具或系统[8]。迄今为止，抗体因其在生物传感器中具有高亲和力和高特异性而成为应用最广泛的生物识别元素。然而，但抗体存在如筛选过程复杂，价格昂贵，易变性失活和相对严苛的检测环境要求缺点[9]。例如，现在市面上的显色或者层析表征的微生物快速检测产品，其显色或者层析的方法原理基于抗体的免疫学技术。如酶免疫检测（Enzyme immunoassay，EIA）法，分为均相法及非均相法，其分类依据为检测中抗原体反应是否需要对酶标记物进行分离结合及游离。非均相法是目前常用的酶免疫检测方法，其代表方法为酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技术，固相载体吸附抗体或抗原后进行免疫酶染色，待底物显色后对有色产物进行定量或定性分析，从而确定样品中是否含有目标微生物及其数量[10]，检测迅速，但试剂昂贵和设备的复杂；免疫层析技术（IC），其原理为利用毛细管作用，在条状纤维所制膜上（含有相应配体）使样品泳动，目的在于使样品与膜上特定区域配体结合，利用酶促显色反应或直接着色标记物获得直观结果[11]，该方法目前已开发出针对性的试纸条应用于食品微生物检测中，快速但无法进行定量检测；免疫荧光（Immunofluorescence，IFT）法，在抗体或抗原上标记荧光色素，待相互结合后于荧光显微镜下利用荧光反应观察结果[12]，此方法也需要昂贵的试剂，而且所用荧光色素对待检样品中目标微生物活性造成影响；酶联荧光免疫法（Enzyme-linkedfluorescent immunoassay，ELFIA），将酶免疫与荧光免疫结合，利用合适的荧光底物代替生色底物后进行酶免疫分析，可有效扩大检测范围及减少试剂使用量，但试剂昂贵和设备复杂[13]。因此，仍需要探索新的具有高度特异性和克服的微生物抗体缺点的生物识别元件来进行微生物检测。已有研究表明，核酸切割酶作为一种新型分子探针正好可以很好地克服微生物抗体的缺点[14]。
核酸切割酶是一类具有酶活性的功能核酸[15]，可通过富集配体系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术（体外筛选技术是一种从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体）得到，与靶物质有很高的特异性响应[16-17]。从核酸的随机序列文库中分离出来后[18]，以不同的靶标以及各种各样的结合条件在序列库中进行筛选[19]。
指数富集（SELEX）相对于蛋白酶、核酸切割酶不仅具有很高的催化活性，且稳定性好、易于修饰、合成价格便宜、对环境影响小。核酸切割酶在靶物质存在的情况下可水解RNA底物磷酸二酯键[20]，以适当的理化换能器进行信号输出，如荧光法[21-23]、电化学法[22]及比色法[24]等。然而，这些方法大部分需要对核酸切割酶或底物链进行标记或修饰，增加了检测成本与操作复杂程度。此外，实际样品中的复杂基质容易引起较高的背景信号而影响检测的灵敏度。所以，将核酸切割酶介导的生物传感体系与相对成熟的等温信号放大技术结合，建立简便、高灵敏度的检测新方法无疑成为了一种趋势。
1 微生物介导的核酸切割酶介绍核酸切割酶是一种DNAzymes（又称脱氧核酶），是具有催化活性的单链DNA分子。DNAzymes在自然界中不存在，但可以通过SELEX技术从随机序列的核酸文库（ssDNA或RNA）中分离出来。目前为止，关于DNAzymes催化的各种化学反应已有报道。尤其是“核酸切割酶”，其活性高度依赖于给定的化学或生物刺激，所以可以结合配体反应的DNAzymes设计生物传感器。同时作为DNA分子，核酸切割酶能与DNA扩增完全相容，最终提高检测灵敏度[25]。据此综述了几种生物传感器，对其中的核酸切割酶与微生物的结合原理进行分类总结，并阐述近年来微生物介导的核酸切割酶的发展，以期为实现微生物快速检测提供方法依据。
微生物切割酶是通过体外SELEX筛选技术获得可以特异性识别微生物样品中靶标的一类核酸。SELEX技术5个步骤：组合、分离、洗脱、扩增和调节。首先将1013-1015个随机序列的核酸文库与靶分子一起孵育，然后分离结合的ssDNA或RNA。洗脱和收集复合物，通过聚合酶链反应（PCR）扩增生成用于下一循环的ssDNA或RNA。对于每个靶标，进行6-20个连续循环后测序以获得所需的微生物切割酶[26]，然后分析序列得到共有基序，并对应于靶特异性结合筛选所需的最小序列[27]。SELEX技术选择的微生物切割酶不仅可以与具有高亲和力和特异性的分子结合，还能进行化学修饰，通过调控其结合特性以捕获更多的目标分析物，可更好地应用于病原微生物检测[28]。
但是由于病原微生物构成复杂，所以实际应用中微生物切割酶SELEX筛选多采用完整的细胞作为靶标，但这种靶标通常会出现靶位点多、不易筛选出高特异性的核酸切割酶等问题。为了解决这些问题，在正筛选同时增加使用两种或多种同源微生物细胞进行负筛选，以得到针对目标微生物的具有高特异性的切割酶[29-33]。DNAzyme选择和特异性是通过使用细胞外粗混合物（Calcium-enriched mixture，CEM）作为阳性选择步骤中的靶标和来自一种或多种非预期细菌的CEM作为靶标进行的[34]。SELEX技术的优势在于：第一，以来自细菌病原体未纯化的生物样品作为衍生配体响应切割酶的靶标，以此确保复杂生物样品中所选切割酶的功能；第二，双重筛选具有更好的特异性（图 1）。Cao等[30]以金黄色葡萄球菌作为靶标，同时使用链球菌和表皮葡萄球菌进行负筛选，结果证明负筛选能很大程度地提高筛选特异性。
1.1 微生物切割酶结构
如图 2所示，微生物切割酶与它相互作用的RNA底物通过形成两个Watson-Crick双面绑定臂在结合靶标后可以轻松实现底物链断裂（即RNA切割核酸切割酶）[31]。核酸切割酶切割底物链产生两个短片段，在各自的短链上进行化学修饰可以表征链分离，或者还可以通过凝胶电泳对裂解后混合物进行胶表征分析切割产物。
1.2 微生物切割酶机制与产物
核酸切割酶一般分为全DNAzyme及具有RNA切割位点的DNAzyme（rDNAzyme）。但现有的大多数文献报道是基于RNA切割DNAzyme的研究，据此推测其原因如下：一是RNA切割DNAzyme应该具有催化效率，因此生物传感器的响应这些DNAzyme进行工程改造的时间相对较短[35]；二是RNA将含RNA的底物链条分成两部分，需要设置一种较为简单的方式来耦合选择信号的的生物传感平台。
首先核酸切割酶是金属离子依赖性RNA切割DNAzyme，用SELEX技术从随机序列DNA库中分离（图 3）[36]。这是因为带有带负电荷的糖-磷酸二酯骨架[14]和富含电子的核碱基的DNA能很好地与带正电的金属离子相互作用[37]。
微生物依赖RNA切割DNAzymes也逐渐被发现，这些微生物切割酶可以被微生物样品中极为复杂的靶标激活（图 4）[38]，其靶分子通常为病原微生物细胞表面的分子[39]，细胞的特异性蛋白裂解物[40]，或全细胞[26]。
这种DNAzyme实现RNA切割活性实质上是切割单个核糖核苷酸的磷酸二酯键，然后以2'-OH基团裂解磷酸二酯作为亲核试剂作用磷酸二酯中的5'-氧，靶分子作为辅因子嵌入DNA序列导致两次裂解片段，一个片段具有2'-3'环状磷酸酯末端；另一个具有5'-OH末端（图 5）[31]。
1.3 微生物切割酶的靶标
RFD-EC1仅在大肠杆菌产生的CEM存在时（CEM-EC）实现切割[41-42]，其序列为CACGGATCCTGACAAGGATGTGTGCGTTGTCGAGACCTGCGACCGGAACACTACACTGTGTGGGATGGATTTCTTTACAGTTGTGTGCAGCTCCGTCCGACTCTTCCTACCFRQGGTTCGATCAAGA。RFD-CD1则针对艰难梭菌Clostridium difficile（C.difficle）未纯化的分子反应混合物实现切割[43]，其序列为GATCTGAGTGGATTGGGGCCTGCGCGGAGTCGGGACTATT。
细菌病原体大肠杆菌分泌蛋白的检测模型DNA索烃生物传感器如图 6所示[44]，借鉴RFD-EC1得到其活性序列：ACTCTTCCTACCFRQGGTTCGATC。
ATP特异性的变构RNA切割DNAzyme pH6-ET4及其同源靶标转换成为肉眼可见的比色信号，RNA裂解变构DNAzyme如图 7所示[45]。阮病毒蛋白（PrPC）特异性的切割DNAzyme与靶标结合，RNA裂解茎环结构DNAzyme如图 8所示[46]。
1.4 微生物切割酶产物的表征 1.4.1 荧光表征
微生物切割酶应用在生物传感器领域的表征方式除了最传统的以核酸片段大小进行鉴定产物的凝胶电泳法表征方法之外，最常见的就是将核酸切割酶与具有荧光特性的物质结合，最终实现对靶标的荧光信号检测[31]。首先，基于荧光的检测实现高灵敏并且提供实时报告，然后将RNA酶切DNAzyme与荧光传感器结合。RNA切割DNAzymes与底物形成两个Watson-Crick双面绑定臂，切割底物链后产生两个短片段脱离DNAzyme。荧光团和猝灭剂在各自的链上分离，裂解后混合物产生荧光（图 9-1）。
事实上，生物传感器只依靠受体-配体相互作用不足以在极低浓度下检测目标分析物，如人类的早期疾病诊断或检测痕量的污染毒素或食物和水中的病原体。为了有更好的灵敏性和稳定性以适应真实样品检测[47-48]，Li团队[31]认为这种生物传感方法应该有更强大的释放信号的机制：使用扩增策略。例如，RCA能在短时间等温扩增大量DNA分子[49]并且不需要特殊设备[25]。RCA反应通过DNA聚合酶复制环状模板[50]，需要使用phi 29聚合酶，DNA引物和环状模板，然后将DNAzymes与环状模板（图 9-2-B）或引物（图 9-2-C）混合起来就可以发生扩增：当环状DNA模板被设计为互补序列时，RCA反应将产生大量与环状模板互补的串联重复长单链DNA[51]（图 9-2-A）。
设计两个单链DNA环拓扑连接在一起，由于强连接双链体拥有显着的拓扑约束，DNA组装防止每个组件环充当模板RCA。但是，当其中一组分环被设计成RNA切割DNAzyme的底物，DNAzyme可使该环线性化，从而消除拓扑结合并启用RCA（图 9-3）。这个设计用来进行大肠杆菌灵敏检测[45]。
切割DNAzymes和RCA也可组装成交叉放大系统编码MgZ的模型[31]。两个DNA复合物都包含相同的圆形模板，但是线性DNA分子不同（图 9-4-A）[52]。线性复合物Ⅰ上的DNA分子完全互补圆形模板作为RCA引物。线性的复合物Ⅱ上的DNA分子仅与圆形模板部分互补，并且设计为具有两个功能：它被DNAzymes切割并进一步通过phi29 DNA聚合酶后进行RCA，产生了串联重复的MgZ单元。然后产生的MgZ DNAzymes结合并裂解复合物Ⅱ中的底物，裂解产物随后转化为RCA的引物（图 9-4-B）。这种新的放大系统被称为“DNAzymes反馈扩增（DFA）”。DFA成功实现了microRNA（miR-21）和细菌病原体（大肠杆菌）超灵敏检测，检测限比传统RCA方法提高3-6个数量级。对于miR-21检测，microRNA本身用作复合物Ⅰ中的引物。对于大肠杆菌检测，使用修饰的复合物，其中线性DNA分子被设计成为大肠杆菌特异性DNAzyme：RFD-EC1，RFD-EC1为复合物Ⅰ提供所需的引物，使DNA扩增完全依赖于大肠杆菌的存在（图 9-4-C）。
2 微生物切割酶介导的光学传感器 2.1 RNA裂解荧光DNAzymes传感器Li等建立了RNA裂解荧光DNAzymes（RNA-cleaving fluorescent DNAzymes，RFDs）的体外筛选程序；RFDs作为分析工具的作用机理如图 10-1[53-56]。RFDs催化一个嵌合在底物的单独的核糖核苷酸接合点（R）裂解，由于R被荧光团（F）和猝灭剂（Q）包围，所以裂解时F和Q分离，荧光强度的显著增加。用于细菌检测的RFDs是从目标微生物中筛选得到的高特异性的切割酶（过程可能需要数月或数年才能完成）。这些特殊的RFDs会在特定细菌环境或培养基中留下的原始细胞外混合物（CEM）的情况下“发光”（图 10-1），而RFD仅在大肠杆菌产生的CEM存在时（CEM-EC）实现切割[14]，所以这个E.coli传感RFD，命名为RFD-EC1，同时实验确认RFD-EC1对来自其他细菌的CEMs没有反应。同样的方法，获得了一个RNA裂解荧光DNAzyme（RFD），可以识别C.difficle。这种DNAzyme即RFD-CD1不仅与其他细菌没有交叉反应，同时对艰难梭菌具有高度的菌株特异选择性。RFD-CD1也是由体外选择方法偶联消减交叉反应的负筛选获得[57]。
Didar和Yousefi等[58]组装了一种传感器材料，这种材料可用于食品包装，能在特定的情况下针对靶细菌产生荧光信号从而实现监测微生物污染的各类食品，同时无需从包装中取出样品或传感器。该传感器是通过共价连接大肠杆菌特异性RNA切割荧光的微阵列DNAzyme探针（RFD-EC1）在透明的环烯烃聚合物（COP）薄膜（图 10-2）。实验结果证明了（RFD-EC1）-COP表面是特异性的，在各种pH条件下（pH 3-9）能稳定14 d甚至更长时间，并且在肉和苹果汁中的大肠杆菌的检测限低至103 CFU/mL。发达国家的包装实时监测病原体生物传感器检测易腐食品有很高的准确性。这些传感器努力减轻食源性疾病对公共卫生的负面影响，将来有希望为降低食源性疾病发病率作出重大贡献。
另外，RFDs还用于特异性识别肿瘤细胞，与传统的检测方法相比，RFDs检测过程简单、耗时短、且特异性高。如图 10-3所示，He等[59]构建的RNA-cleaving DNAzymes荧光切割核酶用于特异性识别乳腺癌细胞MDA-MB-231，同样DNAzyme特异性识别并结合乳腺癌细胞MDA-MB-231，与DNAzyme形成特定的二级结构，激活DNAzymes切割活性，释放荧光基团产生荧光信号，MDA-MB-231的检测限为0.5 μg/mL。另外，结果表明该RNA-cleaving DNAzymes荧光探针的定向切割作用有望用于乳腺癌的诊断和治疗。
2.2 变构DNAzyme（allostericDNAzyme）传感器有学者通过使用RCA、PNA和DiSC2（5）[46]，将变构RNA切割DNAzyme及其同源靶标转换成为肉眼可见的比色信号[60-66]。如图 10-4所示。3个关键设计实施：RNA裂解变构DNAzyme，RCA，以及基于比色报告机制肽核酸（PNA）和有机染料在靶标存在的情况下，变构酶切割一种特殊的含RNA的底物并释放出一种可用于phi 29 DNA聚合酶的DNA分子引发RCA反应的引物，用于产生α长ssDNA分子。因为PNA分子与其互补DNA序列形成高度稳定的双链体结构，蓝色的DiSC2（5）结合DNA/PNA双链体后颜色变化为紫色[67-71]，所以检测RCA产物与PNA和DiSC2（5）（3，3'-二乙基硫代二羰基菁）互补杂交后颜色变化。
2.3 索烃（Programming a topologically constrained DNA nanostructure in to a sensor）传感器Liu等[44]设计的DNA纳米结构使用机械互锁拓扑结构连接各个DNA组件形成强连接双链体。这种结构的存在也构成了一个显着拓扑约束的组件环。实验确认具有强连接双链的DNA索烃可防止组分环作为RCA的扩增模板。但是，通过使用含有RNA的DNA索烃具有强连接双链体，实验表明促发RNA切割DNAzyme可以使一个组分环线性化，从而实现RCA（图 10-5）。本研究中DNA索烃生物传感器是应用于细菌病原体大肠杆菌分泌蛋白的检测限为10个细胞/mL，为将来机械互锁DNA纳米结构的进一步应用建立了一个新的平台。
2.4 茎环结构酶传感器Xiao等[46]采用茎环结构酶组装的荧光传感器检测阮病毒蛋白（PrPC）（图 10-6）。在茎环结构的5'端修饰荧光体，3'端的3个DNA碱基G（鸟嘌呤）实现76.6%的荧光猝灭率。当阮病毒蛋白（PrPC）与茎环结构酶结合时构象发生改变，3'端的鸟嘌呤远离5'端的荧光体，释放荧光，从而完成对阮病毒蛋白的检测。该茎环结构酶组装的荧光传感器的检出限为0.3 μg/L。
3 结语与展望核酸切割酶与生物传感器结合不仅限于比色试验。例如，Xiang等[71]已经发现核酸切割酶与口袋大小的个人血糖仪（PGM）量化非葡萄糖的目标检测物。该方法的核心特征是目标诱导的转化酶释放（一种可以将蔗糖转化为葡萄糖的蛋白质酶）固定转化酶/DNA缀合物。DNA可以是配体响应性核酸切割酶，如UO22+依赖性核酸切割酶：当存在UO22+时，DNAzyme切割其与转化酶缀合的底物，释放的转化酶转向随后是蔗糖转化为葡萄糖，并可由PGM检测到。荧光结合核酸切割酶与生物传感器结合后会不断发现不同的RNA切割DNAzymes，这扩展的PGM可以用作低成本家庭护理或便携设备检测一系列和医学或环境相关的目标物。
另一种被大家所熟悉的家庭护理设备是简单的家庭妊娠试验条带（HPT），一种用于检测人绒毛膜促性腺激素（hCG）-a怀孕荷尔蒙的侧向流动装置。2017年，Du等[72]提出使用HPT检测DNA的想法：使用环介导的等温扩增（LAMP）和可编程的立足介导的链交换，与含有hCG的融合报告蛋白结合，完成信号转导。这种商业化的妊娠试纸最终可以实现DNA检测。虽然尚未完全证明，但相信通过使用配体响应性RNA切割DNA酶，可以扩展该方法以进行其他靶标检测。
由于核酸切割酶高稳定性、可循环催化、易合成、易功能化修饰的优点，以及可特异性识别金属离子、中性分子、细菌等辅因子的特性，核酸切割酶被广泛用于金属离子和生物分子的检测。虽然已有研究实现EC1 DNAzyme体系中切割FS28产生荧光信号的核酸切割酶固定在3D DNA纸张传感器[73]，但是目前基于核酸切割酶的金属离子和病原微生物等检测体系的应用还是相当有限，而对于实际现场操作，批量市场化仍有很长的一段距离。同时DNA天然性质是水溶性且生物相容，意味着其可被用于生物医学和生物技术领域的内置应用[74]，但是实际应用于生物体内的检测仍需进一步的探索与验证。因此要提高检测体系的抗干扰能力及提高核酸切割酶在生物体内的稳定性仍需更深入的研究工作。此外，虽然可修饰RNA序列已较好地应用于病原感染诊断和肿瘤基因治疗领域[75-76]，但是核酸切割酶在人类疾病的研究领域属于起步阶段，包括核酸切割酶如何导入细胞与表达；核酸切割酶引入细胞后的稳定性；核酸切割酶结构的设计，特别是选择合适长度的侧翼和底物以及如何提高核酸切割酶的活性等方面均有待进一步探索和解决。可以借助快速发展的水凝胶技术，现已证明捕获微米级长链DNA可被包埋在二氧化硅材料的大孔内，使其能更充分地与高分子量靶标如蛋白质相互作用[77]，将来会进一步利用水凝胶材料和核酸切割酶结合构建药物递送体系，以高效地传递基因药物到达肿瘤组织。
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