2. 宁夏大学化学化工学院，银川 750021
2. College of Chemistry & Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021
随着全球经济的快速发展，人类对能源的需求量不断上升，以当前的能源消费速度预计到2050年世界石油储量将消耗殆尽[1]。另外，大量化石燃料消耗带来的温室效应、大气污染、酸雨、臭氧层空洞等环境问题也成为人类亟待解决的问题。因此，引发了全球对可再生和绿色可持续生物燃料生产的研究热潮。生其能满足当前和未来燃料需求的原料，由生物质生成的生物燃料包括生物柴油、生物乙醇、生物氢和生物甲烷。其中，生物柴油生成转化的脂肪酸甲酯（Fatty acid methyl ester，FAME）无毒、可再生及生物降解，与石化柴油的理化性质相似[2]。同时，与传统燃料相比，生物柴油能量密度高、润滑性能好、运输储存安全、且含氧量高，燃烧更充分，CO2、CO、硫化物和颗粒物质的排放量低[3]，是一种优质的绿色替代燃料。
目前，用于生物柴油生产的可再生原料分为3种类型：食用油、非食用油和废弃油脂。食用油如大豆油、菜籽油和棕榈油等，作为生物柴油原料，生产成本高，与粮食产业竞争，容易导致食品供应和需求的不平衡[4]。特别是对于人口密度高的东亚国家可食用油脂供应紧张，不适合以大量食用油做原料生产生物柴油。而非食用油，废弃油脂和微藻油廉价易得、可以解决食用油衍生的生物柴油生产问题，是目前主要的可持续性替代原料[5]。
然而，非食用油和废弃油脂具有高含量的游离脂肪酸（FFA）[6]，可以与碱发生皂化反应，不能直接通过传统的碱催化酯交换路线用于生产生物柴油。脂肪酶能够催化酯化反应和酯交换反应，可以使用相对便宜的高FFA和水含量的这类油品作为生产生物柴油的原料油[7]。因此，与传统化学催化过程相比，脂肪酶催化制备生物柴油具有低能耗、后处理成本低、原料更广泛的特点，表现出更好的环境和经济优势[8-9]。但是，在大多数情况下，不可再生催化的高成本限制了酶催化过程的工业化应用。
酶的固定化技术可以有效地提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低其成本，是目前广泛使用的技术[9]。此外，固定化脂肪酶比游离脂肪酶更利于产品的分离纯化，在pH耐受性，底物选择性，热稳定性和回收使用性等方面表现出优越的性能[10-11]。
目前，使用各种载体固定化的酶在各个领域均有重要的应用，包括生物传感器、生物燃料生产和药物释放等[10]。然而，基于传统固相载体的固定化酶也存在一些不可避免的技术问题，如酶蛋白质结构的改变，空间位阻和低扩散速率[12]。为了解决这些问题，各种纳米材料被广泛应用于酶的固定化。纳米材料高的比表面积提高了酶的负载率和传质效率，作为固定化载体具有显著优势[13]。本文回顾和讨论近几年酶固定技术的研究进展，并阐述了纳米载体的结构及固定化方法的选择对脂肪酶在催化生物柴油反应中的活性差异的影响，旨在为开发高效的固定化脂肪酶过程中载体和方法的选择，以及工业化酶促生产生物柴油体系的建立和应用提供依据。
1 纳米载体固定化脂肪酶研究脂肪酶广泛存在于真菌、细菌、动物和植物中[14]，通常在水/油界面上催化甘油三酯水解成甘油和游离脂肪酸。除了水解反应，脂肪酶还可以催化酯化反应和酯交换反应[15]。因此，在化妆品、有机合成、洗涤剂、食品、制药工业及生物柴油领域中均有广泛的应用[15-16]。目前常用于脂肪酶固定化的纳米材料主要可分为3类：纳米粒子、碳纳米管和纳米静电纺丝。
1.1 纳米粒子载体 1.1.1 非磁性纳米粒子纳米颗粒相对于其他无机材料的最大优点是它们能够显著降低质量扩散限制。同时，酶分子附着在高比表面积的无孔颗粒表面，提高了催化活性位点与底物的结合效率，从而表现出更高的酶活保留[17]。酶分子固定化在非磁性纳米颗粒上可以很好地分散在反应液中，利于反应的传质效率，但小粒径的纳米颗粒需要长时间的高速离心才能实现固定化酶的重复使用，因此也限制了固定化酶的工业化应用。目前，粒径1-100 nm的纳米粒子在固定化脂肪酶领域已有普遍的应用[18]，常见的非磁性纳米载体包括氧化锆，二氧化硅，聚苯乙烯，壳聚糖和聚乳酸（Polylactic acid，PLA）等。
一般情况下，脂肪酶分子中存在覆盖活性中心的特殊疏水性多肽链结构-“盖子”，使得脂肪酶在亲水性无机载体表面上表现出较差的结合能力[19]。Chen等[20]将洋葱假单胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacia lipase，PCL）共价固定化在修饰了各种羧酸（戊酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和1，10-癸二羧酸）的氧化锆（ZrO2）纳米颗粒上。由于硬脂酸疏水性长链的界面活化作用[19]，PCL固定化在硬脂酸修饰的ZrO2载体上表现出更高的活性和对映选择性，初始活性分别比未修饰的ZrO2-PCL和游离脂肪酶高10.5和16.6倍。类似的，Miletić等[21]通过吸附法将南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CAL-B）固定在聚苯乙烯纳米颗粒上，由于载体的疏水性作用其活性比广泛应用的商品化固定化酶Novozyme 435高1.16倍，比游离酶高1.81倍。在另一项研究中，米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML）被共价固定在由辛基三乙氧基硅烷（Octyltriethoxysilane，OTES，界面活化作用）和3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（Glycidoxypropyltrimethoxylsilane，GPTMS，与酶共价结合位点）修饰的二氧化硅纳米粒子上[22]。通过调节GPTMS / OTES的比例改变载体表面疏水性辛基和亲水性环氧基团的量，发现RML在辛基官能化的载体上的活性比游离酶高约1.5-2倍。而这种活性提高随着载体上环氧基团的增加而降低，证明载体的疏水性质对脂肪酶分子与载体的结合至关重要。
1.1.2 磁性纳米粒子在催化反应之后，能否有效地从反应液中分离出来，是固定化酶应用过程中必须解决的关键问题之一。磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticle，MNP）作为固定化载体的使用就是一个有效的解决方案。MNP比表面积大、表面羟基丰度高，易于进行表面修饰以及与酶分子的结合（共价）[23]。同时，纳米级磁性粒子具有超顺磁性的独特性质，可以使用外部磁场简单地从生物催化体系中分离，机械稳定性高、孔隙率低，利于降低反应中的传质阻力，提高固定化酶的重复使用性。
磁性氧化铁由于其价廉易得、低毒性和生物相容性是目前主要用作载体磁性纳米颗粒[23]。Mehrasbi等[24]将CAL-B共价固定化在GPTMS功能化修饰的磁性纳米颗粒上，并用于催化废烹饪油制备生物柴油，固定化酶回收使用6次后仍能保持100%的初始活性。Lee等[25]用十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）作疏水性功能基修饰磁性纳米粒子（尺寸8-12 nm），用于粗猪胰脂肪酶（Porcine pancreas lipase，PPL）的固定化。与游离PPL相比，固定化PPL的活性提高了1.42倍，且热稳定性有明显提高。Lei等[26]通过自由基聚合将聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯）（Glycidyl methacrylate，GMA）接枝到Fe3O4 / SiOx的表面上，用于皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）的固定化。功能化的超顺磁性纳米粒子直径为100 nm，并且显示出更高的饱和磁化强度（8.3 kA /m）。固定化的CRL表现出更高的pH耐受性和热稳定性，并且在重复使用六次后保持初始活性的83%。Zhang等[27]以3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）修饰的Fe3O4为载体与表面活性剂活化的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶聚集体（Thermomyces lanuginosus lipase，cross-linked enzyme aggregates，TLL CLEAs）交联，并将其应用在制备生物柴油中。修饰的磁性纳米粒子的加入，提高了固定化酶的机械稳定性，并且降低了CLEAs中的传质阻力，在生物柴油反应中得到88%的产率，且回收10次以后活性没有明显的降低。Li等[28]将三聚氰胺-戊二醛树枝状聚合物接枝在APTES修饰的磁性纳米载体上，用于固定化洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶（Burkholderia cepacia lipase，BCL）。树枝状聚合物的修饰可以有效提高酶在纳米载体上的负载率。结合生物印迹预处理，将1-苯基乙醇的拆分反应时间缩短至20 min，达到98.8%的ees。Xing等[29]用表面氨基功能化磁性纳米粒子（APTES-Fe3O4）制备了磁性的南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的交联酶聚集体，并用于拆分1-苯基乙醇。在最佳条件下，达到50%的转化率，eep > 99%，ees > 99%，对映体比率（E） > 1 000的选择性。同时，重复使用10次以后活性和选择性均没有明显的降低。
1.2 碳纳米管载体碳纳米管，包括单壁纳米管（Single-walled car-bon nanotube，SWNT）和多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotube，MWNT），是近年来越来越广泛使用的一种新型载体材料。基于石墨片的碳纳米管具有独特的有序无孔结构、表面积大、生物相容性好、易于功能化修饰，同时表现出优异的耐热性，耐化学性和机械稳定性[30]。与其他材料不同，碳纳米管可以增强底物和固定化酶之间的电子转移。因此，最常用于固定氧化还原酶，并应用于生物传感器中。
目前也有一些报道研究了碳纳米管对脂肪酶的固定化[31]。Shah等[32]通过物理吸附法将CRL固定在MWCT上，酶活保留达到97%，并且在正己烷和离子液体[Bmim]PF6中的酯交换初始速率分别提高了2.2倍和14倍。Mohamad等[33]报道了一种简单的吸附方法，将CRL固定在羧基功能化的MWNTs（F-MWNTs）上。MWNT表面上带电荷的羧基部分可以与CRL上的其他极性部分（NH2和OH）结合，与游离酶相比，固定化CRL在MWNT上的活性和热稳定性提高了两倍。Li等[34]将BCL吸附在CNTs上，再利用蛋白和无机金属盐组装的方法制备了具有多级花状的有机-无机杂化纳米结构实现酶的固定化。CNTs的加入可以提高酶的负载率和稳定性，同时降低了纳米花致密结构中的传质阻力。复合的Cu3（PO4）2 / CNT / BCL固定化酶的酯化反应活性比游离BCL和不加CNTs的Cu3（PO4）2 / BCL分别高出68倍和51倍。且在1-苯基乙醇的拆分反应中，10 min可以达到98%的ees。
1.3 纳米静电纺丝载体纳米静电纺丝纤维尺寸均一、组成多样，具有高孔隙率和比表面积，保证酶的高负载率，降低传质阻力。同时，有优异的生物相容性、无毒性、生物降解性、高机械强度和亲水性，作为酶固定化载体的应用有巨大潜力[35]。相比于其他载体的巨大优势在于，各种合成聚合物如聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚氨酯，以及生物聚合物如甲壳质、壳聚糖、藻酸盐和纤维素，均可用于制备静电纺丝载体，可以针对每种酶分子的特性选择相应合适的载体及功能化修饰。并且固定化方法的选择多样，酶分子可以通过吸附作用或共价结合在载体表面，或者在制备载体的过程中包埋在载体内[36]。
Huang等[37]报道了一例共价结合在电纺纤维素纳米纤维膜上的固定化CRL，在最佳条件下活性达到29.6 U / g。Song等[38]考察了BCL包埋在聚己内酯（Polycarprolacone，PCL）纳米纤维中在水中的水解活性和非水介质中的酯交换活性，结果显示BCL固定化在PCL载体上的水解活性明显高于酯交换活性。Weiser等[39]使用PVA纳米纤维通过包埋固定化五种不同类型的脂肪酶，并用于催化酰化反应动力学拆分外消旋仲醇。由于聚合物纳米纤维的结构可以稳定酶分子的活性构象，经过固定化的5种酶活性均有提高。Soti等[40]分别使用PVA和PLA纳米纤维膜对BCL和CAL-B进行吸附固定，用于1-苯基乙醇和1-苯基乙酸酯的动力学拆分。酶在聚合物载体上的均匀分散和纳米纤维大的比表面积使得固定化酶的活性显著提高。其中，固定在PLA纳米纤维膜上的脂肪酶表现出更高的活性、对映选择性和机械稳定性。Dwivedee等[41]通过苯胺的氧化聚合合成了聚苯胺纳米纤维（Polyaniline nanofiber，PANF），并将荧光假单胞菌脂肪酶（Pseudomonas fluorescens lipase，PFL）物理吸附在PANF上。固定化PFL的活性与游离酶高8倍，且动力学常数（Km）降低了5倍，表明纳米结构的固定化酶对底物表现出更高的亲和力。
2 纳米载体固定化脂肪酶在生物柴油中的应用通过各种纳米载体固定化的脂肪酶在酶活保留、稳定性和重复使用性上均有不同程度的改善，可以降低酶的使用成本，提高酶促生物柴油过程的经济性。Raita等[42]研究了固定化在磁性纳米粒子上的TLL在棕榈油制备生物柴油的反应活性，在最佳条件下反应24 h后的产量为97.2%。Zhang等[43]结合界面活化预处理和磁性纳米载体，制备了表面活性剂活化的磁性RML交联酶聚集体，在有机溶剂中的酯交换活性比游离酶提高了20倍。同时，在生物柴油转化实验中得到了的93%的产率，在5次回收实验后保留了超过84%的初始活性。Babaki等[44]考察了GPTMS修饰的中孔SBA-15纳米颗粒分别对CALB、TLL、RML这3种脂肪酶的共价固定化，用于菜籽油的甲醇分解酶促生产生物柴油反应。其中，SBA-RML和SBA-TLL的生物柴油转化率可以分别达到95%和98%。同时，经过修饰纳米颗粒的固定化，酶的热稳定性和甲醇耐受性均有提高。Cazaban等[45]分别使用原位包埋在仿生二氧化硅纳米粒子中和共价偶联在OTES和3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷修饰的二氧化硅纳米粒子上，两种方法固定了TLL，并用于生物柴油反应中。与商品化的固定化TLL和原位包埋的TLL相比，共价偶联的固定化酶得到更高的生物柴油产率。可能是由于原位包埋过程中亲水性聚合物PEI的加入限制了甘油三酯在固定化酶中的扩散，也增加了甘油在固定化酶表面的富集，而降低了原位包埋TLL的酯交换活性。
能源安全、农村发展和气候变化等重大问题[46]促进了生物柴油生产和应用研究的快速发展。目前，原料油的成本仍然是制约生物柴油生产规模化发展的主要问题之一。在过去的20年中，发展了基于不同原料油的不同代生物柴油。其中，第一代生物柴油主要以食用植物油为原料。2015年，全球生物柴油产量的69%来自食用植物油[47]。如此高比例的食用原料的使用影响了食品供给平衡和油料价格，同时食用油的高成本也限制了生物柴油生产的产业化发展。因此，基于非食用油脂（包括非食用植物油，如麻风树果油、桐梓油、蓖麻油等及废弃油脂，包括餐饮废油、动物油脂等）的第二代生物柴油和微生物/微藻油的第三代生物柴油迅速发展起来。
通过餐饮废油的酶促酯交换反应生产生物柴油，不仅能降低生物柴油的原料成本，餐饮废油也得到安全利用。同时也避免了餐饮废油的环境污染问题，是解决环境污染和能源需求问题的有效途径。Fan等[48]将RML固定在聚乙二胺（PAMAM）修饰的磁性多壁碳纳米管（MWCNT）上。固定化的RML显示出比游离酶高27倍的酯化活性，且在最佳条件下，催化废植物油制备生物柴油的转化率达到94%，在10个循环后转化率仍无显著降低。Zhang等[49]将从Candida sp. 99-125分离的脂肪酶共价固定化在环氧氯丙烷修饰的MNP上，用于酸化餐饮废油的生物柴油转化。其中，酸性废油中含有高达96.23%的FFA、1.23%的甘油二酯和2.53%的甘油三酯。在甲醇:FFA摩尔比为1:10，40℃的最佳反应条件下，生物柴油产率为97.11%。Karimi[50]合成了超顺磁性氧化铁纳米颗粒，经硅烷修饰后用于共价固定化BCL。固定化酶在餐厨废油的生物柴油转化反应中，35℃反应35 h后转化率达到91%。
微生物/微藻与油料作物相比，具有单位面积产率高、繁殖速度快、生产周期短的优势，同时油脂脂肪酸组成与植物油类似，又不与油料作物竞争耕地面积，因此是潜在的原料油来源。但是，微藻油中的游离脂肪酸含量高（取决于储存条件，有时可高达70 wt%），不能用于碱催化的酯交换反应[51]。Tran等[52]将长链烷基修饰的Fe3O4-SiO2用于固定化从菌株Burkholderia sp. C20分离纯化的粗脂肪酶，并用于从小球藻Chlorella vulgaris ESP-31一步提取/酯交换制备生物柴油的过程。同时，研究了含水量、脂质含量、溶剂添加量和甲醇/油比对微藻生物质直接酯交换反应的影响。疏水性磁性纳米载体固定化的脂肪酶在高水含量的微藻生物质（水含量高达86%-91%）中表现出较高的催化活性和甲醇耐受性。在最佳条件下，生物柴油转化率超过90%。Picó等[53]以氨基功能化的MNP为载体制备了CALB的磁性交联酶聚集体，并用于小球藻油脂的生物柴油转化，酸催化过程在100℃下反应1 h，获得80.2%±4.4%的生物柴油转化率。而CALB的磁性交联酶聚集体催化的反应在温和的反应条件下，30℃反应3 h，获得了超过90%的生物柴油转化率，并且连续回收使用10次，可以保留90%的初始生物柴油转化率。近年也有报道[54]将TLL用戊二醛共价固定化在APTES修饰的不同晶体结构的纳米沸石上，用于微藻油的生物柴油转化反应中。实验表明，载体表面的功能化修饰提高了酶的负载率和稳定性，并且与物理吸附固定化的TLL相比表现出更高的生物柴油产率。
3 总结与展望与传统固相载体或游离酶相比，脂肪酶固定化在各种纳米材料上，在负载率、酶活保留、传质效率、机械稳定性以及可回收性等方面均表现出许多优势，在催化生物柴油转化中也表现出巨大的应用潜力。但仍需深入研究纳米材料的工艺改进和扩大生产，以充分发挥其在工业水平上的应用，协调固定化酶催化活性和制备成本及工艺，以便在工业水平实现酶促生物柴油生产过程的扩大。纳米固定化脂肪酶在填充床反应器中的应用可以降低搅拌剪切力对固定化酶活性的影响，提高固定化酶的重复使用性，也便于产物的分离纯化，是实现工业化应用的重要途径之一。同时，通过复合纳米载体的设计和构建实现多种酶的共固定化，以便于实现固定化酶对复杂原料进行生物质转化，也对促进绿色可持续生物质生产的发展具有重要意义。
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