microRNA（miRNA）是一类在真核生物体内普遍存在的，长度在22 nt左右的单链小RNA分子，自身不具有开放阅读框（Open reading frane，ORF），属于非编码RNA^[1]。miRNA能形成具有分子茎环结构的前体。植物中前体大小变化范围较大，可以从几十到数百个核苷酸，而在动物中前体大小变化范围较小，一般在60-80 nt。植物miRNA基因位于基因间区域或者基因内含子区域，有些miRNA基因相互之间距离很近，从而形成基因簇，他们可以共同转录一个初级miRNA^[2]。随着对miRNA研究的不断深入，研究人员已经鉴定出大量的miRNA。目前，miRNA数据库（miRBase v22.0）中收录了动物、植物、藻类等271个物种，38 589条发夹前体miRNA和48 860条成熟miRNA的相关信息^[3]。其中，研究者从拟南芥、番茄、玉米、水稻、苹果、桃等植物中鉴定了大量的miRNA，部分miRNA被证实参与了植物的生长发育、器官分化、激素应答、信号转导等生物学过程^[4-7]。例如，miRNA156、miRNA165和miRNA319参与植物叶片的发育和形成^[8]；miRNA172、miRNA159参与花的发育^[9]；miRNA390、miRNA393、miRNA166、miRNA167等参与植物激素信号通路^[10]。除此之外，植物在生长过程中会遇到许多生物与非生物的胁迫，包括病原（细菌、真菌和病毒等）的侵染，植物通过某些miRNA的生成与表达来调控编码基因的表达，并通过基因与基因间的相互作用，最终抵抗逆境胁迫^[11-14]。本文就miRNA的作用机制、植物和重要果树miRNA参与病原调控方面的研究进展进行了概述，旨在为miRNA在作物抗病防御方面的深入研究和应用提供理论依据。

1 miRNA作用机制

miRNA可以通过基因剪切或翻译抑制等方式来调控靶基因，精准控制其表达水平^[15]。目前的研究表明，miRNA可通过3种机制介导基因沉默：一是miRNA对靶mRNA的直接剪切；二是miRNA结合靶mRNA，抑制编码基因的翻译；三是在转录水平的另一种调控方式，即miRNA靶向靶DNA，在转录水平沉默基因的表达^[16]。miRNA对靶基因的调控方式取决于miRNA和靶基因的互补程度。其中，植物中的miRNA主要以剪切mRNA的方式调控靶基因的表达^[17]。

在miRNA与其靶mRNA几乎完全互补的情况下，miRNA则介导mRNA特异性切割。miRNA进入细胞质后，能够被装载进AGO蛋白并形成沉默复合体，其中的miRNA能指导沉默复合体识别特异的mRNA位点，随后，AGO蛋白在配对的miRNA的第10-11位碱基处切割mRNA。这种调控方式不仅可以影响mRNA的表达水平，也影响蛋白的表达水平。在这种调控机制中，miRNA与靶基因呈现高度配对，错配数较少^[18]。

当miRNA与靶基因之间的错配数较多时，miRNA更倾向于与mRNA结合但不进行切割，这种方式不会影响mRNA的表达水平，但能使得其靶基因的蛋白翻译过程受阻，但目前这种调控方式的详细机制尚未明确^[19]。

在水稻中，存在一类由DCL3加工形成的长链miRNA（long miRNAs，lmiRNAs），这种长链miRNA可以装配到AGO4蛋白并进入细胞核中，介导靶基因位点的DNA甲基化。另外，miRNA还可以剪切内含子并产生phased siRNA（phasiRNA），这些phasiRNA可能会与AGO4结合并进入细胞核中介导靶基因的DNA甲基化^[20]。

2 miRNA与植物病原侵染

近年，miRNA响应非生物胁迫（干旱、冷热胁迫、盐碱等）的相关研究较多^[21-23]；而生物胁迫和病原侵染等导致的miRNA响应研究结果相对较少。有研究报道，miRNA作为一种重要的转录调控因子参与了多种抗病相关基因的表达调控，例如，miRNA可以通过调控植物病原物的相关分子模式触发的免疫反应和效应因子触发的免疫反应，其作用靶标以NBS-LRR类抗病基因居多^[24]。miR159a、miR172a、miR172b、miR845a在拟南芥等多种植物中参与了抗病反应，并诱导细胞的程序性死亡^[25]。Zhang等^[26]通过对70种陆生植物的抗病基因与大量的miRNA数据的耦合分析，提出了植物miRNA和抗病基因共演化模型，研究表明，不同的miRNA通过靶向抗病基因的保守结构域，对抗病基因的表达进行调控。随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的不断发展（表 1），在玉米、水稻、拟南芥、大豆、葡萄、苹果、番茄等植物中，越来越多的miRNA被发现，这些miRNA广泛参与植物细菌、真菌和病毒等病原侵染的调控。

2.1 miRNA与植物真菌侵染

miRNA可参与植物对真菌的系统防御，Lu等^[27]发现火炬松感染梭型栎柱锈菌后，来自miR156、miR159、miR319等10个家族的miRNA在茎干中显著下调表达。虽然这些miRNAs在根和感染部位上部的茎中无明显变化，但其靶基因的表达量出现了明显的上升，这表明在该病菌侵染后，寄主可能在未感染部分产生了免疫反应，引发了寄主的防御反应。毛杨果被葡萄座腔菌感染后，来自miR172、miR319、miR398、miR408、miR1448等12个miRNA家族的41个miRNA的表达量上调，它们的靶基因包括植物抗病蛋白，过氧化物酶，细胞分裂素氧化酶编码基因、MYB、ARF等，涉及多种生物学途径。对靶基因的分析结果显示，CKX、CSD、POD等靶基因的表达量在真菌处理后出现不同程度的下调^[28]。zma-miR393能响应玉米纹枯病菌的侵染，它通过调控靶基因TIR1的表达量，调节生长素信号转导途径，进而对真菌侵染作出响应^[29]。刘震^[30]研究发现，miRNA表达丰度的提高与玉米抗病性相关，共鉴定到46个抗病相关的miRNA，其靶基因编码WRKY转录调控因子，红素氧还蛋白，AMC1凋亡蛋白，肉桂酸-4-氢化酶，BAX抑制子等均与抗病相关。实验通过RT-qPCR技术验证了zma-miR393与生长素受体F-box2（AFB2），PC732与凋亡蛋白、PC169和硫氧还蛋白之间的相互关系和调控方式，并分析了PC123、PC169这两种miRNA及其靶基因在抗、感病品种中的表达情况。据实验结果推断，PC732和PC169可能分别通过调控凋亡蛋白和硫氧还蛋白来抵御新月弯孢菌的侵染。研究表明，与水稻-稻瘟病菌互作相关的miRl60a和miR398b的靶基因表达与相应miRNA累积量呈负相关性，过表达miRl60a和miR398b的转基因水稻对稻瘟病的抗性明显增强^[31]。

2.2 miRNA与植物细菌侵染

miRNA393是最早报道的参与植物病原相关分子模式触发的免疫反应的miRNA。对紫丁香假单胞菌侵染拟南芥的miRNA研究表明，与miRNA393过表达植株相比，野生型植株中细菌效价高5倍，且miRNA393可以被flg22诱导表达，并通过靶向生长素受体基因TIR1、AFB2、AFB3，负向调节植物生长素，在植物抵御细菌侵染方面有重要作用^[32]。Ehya等^[33]发现，‘Candidatus phyplasma aurantifolia’侵染墨西哥柠檬树后，在柠檬树内检测到较高水平的生长素，并且柠檬树内miRNA159、miRNA160、miRNA166、miRNA167表达量也出现明显变化，它们的靶基因对应ARF、MYB，均在植物激素代谢途径中发挥重要作用。拟南芥中，细菌鞭毛蛋白缩氨酸肽段可引起miRNA156、miRNA160、miRNA398、miRNA391等多种miRNA及其靶基因表达量的变化，miRNA通过调控靶基因参与生长素信号转导、活性氧代谢和DNA甲基化等途径，对flg22进行响应调控。该实验结果表明，miRNA响应细菌侵染是一个复杂的过程，涉及多种生物学过程^[34]。Dunoyer等^[35]发现，当烟草受到可致瘤的农杆菌感染时，烟草内miRNA393的表达量下调，而当这些农杆菌无致瘤作用时，其表达量不会发生变化。其研究证明，农杆菌可通过下调miR393的表达量来促进寄主生长素信号途径，从而起到抑制根瘤的生长的作用。

2.3 miRNA与植物病毒侵染

目前，许多研究表明miRNA与病毒介导的病害，以及病毒诱导的基因沉默相关。Bazzini等^[36]发现，烟草花叶病毒属、马铃薯Y病毒科和甲型线形病毒科的植物病毒感染烟草后会影响miRNA166、miRNA169、miRNA171等多种miRNA的积累。另有研究表明，即便在不影响转录后基因沉默的情况下，病毒的侵染和病毒编码的蛋白也会打破寄主体内miRNA的平衡状态，说明病毒的致病性与寄主体内的miRNA通路过程息息相关。2017年，吴建国等^[37]通过构建水稻miRNA528突变株，miRNA528过表达株，以及表达miRNA528com结构的转基因植株，检测这些水稻株系在水稻条纹病毒（RSV）侵染之后的病害发展情况以及病毒CP基因相对表达量，结果表明：水稻miRNA528参与RSV侵染过程，miR528表达水平的调控有助于维持野生型水稻植株对RSV的基础抗性。Kasschau等^[38]通过在拟南芥中过表达病毒HC-Pro基因，使得miR171表达水平降低，其多数靶mRNA水平提高，植物出现受病毒介导的相关病症。Qu等^[39]人工设计了一种靶向黄瓜花叶病毒（CMV）病毒沉默抑制因子2b的miRNA，转入烟草，发现其在瞬时表达系统中能有效的抑制2b基因的表达，赋予了转基因烟草对CMV的抗性。研究者以拟南芥的miR159前体为骨架直接合成amiRNA（artificial miRNA），它靶向了2个基因沉默抑制子，分别是芜菁黄花叶病毒（TYMV）的P69以及芜菁花叶病毒（TuMV）的HC-Pro，分别过表达amiR-P69159和amiR-HC-Pro159的转基因拟南芥呈现出特异性抗TYMV和TuMV的表型，这两种人工miRNA的过表达转基因植株对TYMV和TuMV的侵染均表现出抗性^[40]。Lin等^[41]在拟南芥中对人工miRNA的21个核苷酸位置的影响进行研究，并将其中核苷酸位置分为3个等级，当核苷酸突变发生在重要位置时，寄主的抗病性丧失80%，突变发生在中度位置时抗病性丧失为36%，其余位置抗病性丧失为7%。奥云朝伦^[42]研究发现，在大豆花叶病毒（SMV）侵染大豆之后，大豆中miR168a，miR162b，miR1515a等几种miRNA表达量下调。通过对SMV侵染后的miRNA及其靶基因的实时表达情况分析，对miRNA过表达与寄主内SMV浓度的对应关系分析表明，SMV通过诱导相应miRNA的积累，下调RNAi通路基因和NBS-LRR家族抗病基因的表达，从而抑制大豆的防御反应。

3 重要果树病原反应相关miRNA研究

中国是世界上最大的水果生产国，其中，苹果、柑橘、桃、葡萄和梨等是我国重要的果树。但在果树大面积栽培中，会受到包括真菌，细菌和病毒等果树病原的侵染，严重影响果品的产量和质量。其中一些病原菌的胁迫可能是毁灭性的^[43]，如柑橘黄龙病等，还有一些病原菌会给果树生产带来严重的经济损失，如葡萄霜霉病（Plasmopara viticola）是一种世界性病害，霜霉病菌可侵染葡萄叶、茎和果实，影响葡萄生产的产量^[44]。如前所述，近年来，随着测序技术和生物信息技术的飞速发展，研究者们发现，植物miRNA不仅参与调控植物的生长发育，而且在调节植物免疫应答方面也具有重要作用。miRNA作为一种重要的转录后调控小分子，对其在响应和抵御果树病原胁迫方面的研究，明确寄主miRNA响应胁迫的调控机制，对果树病害防控具有重要意义。

尽管相比于拟南芥、番茄、玉米、水稻等模式植物和大田作物，果树miRNA的研究进展相对缓慢，但果树作为我国的重要经济支柱产业，对其miRNA的研究越来越多，据miRBase v22.0数据库释放数据，目前包含了苹果、桃、葡萄、梨、柑橘和草莓等十几种果树近1 800条成熟miRNA。近年，果树miRNA的研究主要集中在miRNA的鉴定及靶基因预测分析。例如，在欧亚种葡萄中鉴定出146中miRNA及对应的靶基因^[45]，在寒富苹果和桃“Lovell”中分别预测到154个和110个miRNA^[46-47]。在“鸭梨”中预测到299个miRNA，其中276个属于27个保守miRNA家族，新miRNA有23个，预测的靶基因多为植物转录因子、抗逆抗病响应、植物激素信号转导等途径的相关因子^[48]。Barakat等^[49]对桃芽的sRNA测序发现了387种保守和非保守的miRNA，发现miRNA156，miRNA172，miRNA398等响应冷胁迫。Eldem等^[50]发现miR160、miR165/166、miR167，miR395响应干旱胁迫。Pekmezci等^[51]在桃中发现了一些与转座子相关的miRNA能够响应干旱胁迫。冷翔鹏^[52]研究了miR398、miR159、miR164等8个响应铜胁迫的葡萄miRNA的表达模式，其中，miR398的表达下调最为显著，miR398能介导葡萄CSD2裂解，且在烟草中过表达葡萄CSD2能提高植株耐铜性。在miRNA参与果树抗病响应方面，研究发现，葡萄中miRNA171b、NewmiRNA2118等可通过负调控抗病蛋白RPP13来响应白粉病菌的侵染^[53]，苹果中miRNA167a、miRNA395a等可对苹果轮纹病胁迫作出响应^[54]，桃属植物miRNA靶基因中包含多个编码病毒抗性蛋白的基因，对其抗病性具有重要的调控作用^[55]。这里，我们主要对我国重要经济价值的苹果、桃、葡萄和梨的相关响应果树病原侵染的miRNA研究进展进行了总结，与其为果树病原与寄主互作机制的深入研究提供新的思路。

梨树中，刘娟^[56]通过sRNA高通量测序发掘不同温度处理条件下被苹果茎沟病毒感染的沙梨组织部位miRNAs数据，共鉴定了144个新的miRNA，77个miRNA为热处理条件下表达差异显著，其中64个差异表达miRNA预测到693个靶标基因，其靶基因涉及代谢，刺激反应，激素信号转导途径，以及抗病防卫等多种生化过程。研究发现，热处理条件下，梨寄主miRNA表达模式具有组织特异性，且苹果茎沟病毒CP基因在梨茎尖和基部表达量均降低，结果显示miRNA可通过对其靶基因的调控作用降低梨树中的病毒浓度。桃作为蔷薇科研究的模式植物，其基因组测序已经在2010年完成，桃miRNAs最初是通过计算机预测大量数据库中的EST序列获得^[57]，随着新一代高通量测序技术的发展，鉴定到桃属miRNA的靶基因包含多个病毒性抗性蛋白NBS-LRR基因，推测这些miRNA与植物抗病特性有关^[55]。葡萄在果树类研究中处于领先地位，它是第一个完成基因组测序的果树，通过“黑比诺”葡萄构建的基因组草图为在葡萄中挖掘miRNAs序列奠定了良好的基础^[58]。张颖等^[59]研究发现，葡萄白腐病菌侵染葡萄后，44个miRNA的表达在“刺葡萄”和“美人指”间存在差异，其中miRNA159a，miR172a、miR172b、miR845a、novel_81这5个miRNA在“刺葡萄”中特异表达，靶基因功能中包括了糖代谢、能量代谢，与抗病直接相关的基因。韩丽娟等^[53]在中国野生华东葡萄“白河-35-1”筛选出14个与抗白粉病相关的miRNA，对应36个靶基因。在葡萄植株感染白粉病后，发现miRNA171b、NewmiRNA2118、NewmiRNA535、NewmiRNA27都有明显的下调趋势，通过表达模式分析发现该miRNA可以负调控抗病蛋白RPP13。方辉等^[60]利用生物信息学技术对葡萄vvi-miR169基因家族的序列分布、定位特征、二级结构、发育进化树和靶基因调控功能进行生物信息学分析。研究结果表明，vvi-miR169基因家族共预测到21个靶基因，其中多个miRNA靶基因均含有NF-YA转录因子，vvi-miR169基因家族序列保守性较高，家族特征明显，且具有相似的调控功能，NF-YA转录因子是vvi-miR169基因家族最主要的靶基因，也是葡萄生长发育过程中抗逆境胁迫的主要调控元件。苹果树中，Ma等^[61]通过生物信息学分析和构建“金冠苹果”sRNA文库的方法鉴定出146种miRNA，预测到一种新型miRNA（Md-miRLn11）靶向苹果NBS-LRR类蛋白编码基因（Md-NBS），并通过5′RACE测定证实了Md-miRLn11具有切割Md-NBS基因的能力。另外，苹果叶斑病菌侵入寄主后，Md-NBS基因在抗病品种中的表达高于敏感品种，而Md-miRLn11则呈现相反的表达模式，推测Md-miRLn11可以通过调节Md-NBS基因的表达来影响苹果不同品种对斑点落叶病的抗性。都贝贝^[54]利用高通量测序研究了苹果轮纹病菌侵染的富士苹果和湖北海棠的miRNA，鉴定了24个可能与苹果轮纹病菌侵染相关的miRNA，并用qPCR检测了其表达模式。结果显示，miRNA的表达在病菌侵染的不同时期呈动态变化，表达量都在侵染后9 h和24 h时显著增加，研究发现miRNA167a，miRNA395a，miRNA397a，miRNA827a，miRNA2111a会对苹果轮纹病胁迫作出响应，推测其可能对苹果抗病性产生影响。

4 展望

miRNA的发现是RNA研究领域的一项重大突破，它揭示了非编码区提供给宿主的一种调节机制。miRNA作为转录后调控的重要小RNA分子，通过与植物mRNAs的序列互补配对而识别靶基因，降解靶mRNA或抑制基因翻译，最终抑制目的基因表达^[62]，参与植物生长发育，激素信号转导、生物和非生物胁迫等过程的调控。然而就目前而言，其研究主要集中在拟南芥、烟草、水稻、小麦、大豆和玉米等模式作物和大田作物上，在果树上的研究相对较少，大多集中在对miRNA的鉴定和靶基因的预测，研究表明，多数miRNA在植物和果树中是保守的，鉴定的果树miRNA大多属于已知的MIR家族，但还有许多保守与非保守以及果树中特异miRNA有待鉴定和发现。相比于模式作物和草本植物，果树生长周期长、遗传机制复杂，获得转基因植株难度大，因此，对于参与果树生长发育和抵抗胁迫的miRNA的挖掘和研究有待进一步推进。

尽管目前对植物miRNA的研究有较大突破，在miRNA鉴定和靶基因预测，对植物生长，抗逆胁迫等方面有许多研究进展，但仍然有些问题需要解决^[63-64]：（1）特异性miRNA的合成和活性调控机制；（2）miRNA是如何选择对靶标基因进行抑制表达还是基因剪切的；（3）现行的miRNA靶标基因的预测主要通过碱基互补配对原则，具有较大的局限性；（4）miRNA的起源及在生物进化中的意义；（5）miRNA在调节基因过程中存在多重交叉调控机制。基于这些问题，目前，对植物miRNA的功能研究仍然十分有限，相对于全部miRNAs，只发现了其中一小部分的miRNAs的功能。

未来，对miRNA参与其靶基因调控机制，植物抗病相关miRNA的功能鉴定，将成为miRNA研究的重要课题。RNAi介导的基因工程推动了作物育种及植物抗逆的研究，而miRNA的发现补充和完善了人们对之前植物防御等基因调控途径的理解^[65]，研究人员可以从miRNA的代谢调控方面来操纵植物中各类基因的表达，并发展了有效沉默靶基因的一种新方法，即人工合成miRNA（artificial miRNA，amiRNA）技术^[66]，amiRNA技术将进一步推动植物抗逆及育种研究的发展。对miRNA的人工操控可为miRNA在作物生长发育，作物育种，抗病防御，抗逆调控等方面的利用提供重要的理论依据。