2. 四川农业大学农学院，成都 611130;
3. 贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081
2. College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;
3. Guizhou Academy of Tobacco Sciences, Guiyang 550081
转录因子是一类能够调控下游基因转录的关键DNA结合蛋白，它能够特异地结合在真核生物基因的启动子顺式作用元件区域，从而激活或者抑制基因的表达[1]。高等植物中，有众多的转录因子，其中，AP2/ERF类转录因子较为古老，为植物所特有且植物中最大的一类，。从结构上看，AP2/ERF类转录因子均含有1-2个高度保守的AP2结构域，含有1个结构域的为ERF亚家族，含有2个结构域的为AP2亚家族[2]。
AP2/ERF家族转录因子在植物的生命活动过程中发挥着十分重要的作用，参与了细胞增殖、花器管发育、植物次生代谢、植物激素应答等重要过程[3-6]。同时，越来越多的研究证明，AP2/ERF类转录因子还参与了干旱、高渗、低温、高盐等非生物胁迫和抵御微生物侵染等生物胁迫响应[3-4, 7-13]。正因为该类转录因子的多重功能，所以其在植物中的数量巨大。随着植物基因组测序工作的不断推进，以及生物信息学技术的不断进步与完善，极大地促进了AP2/ERF转录因子超级家族的研究工作。目前，模式植物拟南芥、水稻中，分别鉴定出了122、139个AP2/ERF转录因子[1]；在玉米中有167个AP2/ERF转录因子[14]；在辣椒中发现了123个成员[15]；在葡萄、番茄、马铃薯中分别鉴定出了149、167、246个AP2/ERF类转录因子[16]。
花烟草是属于茄科烟草属的一年生草本观赏花卉，其花色种类繁多、花期较长，是优美的花坛、花镜材料，是我国许多城市的重要的绿化美化材料。研究其ERF转录因子的定位、表达模式及功能等，对于探索花烟草的生长发育的机制具有重要意义。因此，本研究利用同源克隆的方法，克隆了一个花烟草的ERF基因，采用生物信息方法对该基因进行了鉴定，并分析了其组织表达及响应非生物胁迫的表达模式，以期为花烟草ERF基因的功能研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料以花烟草（Nicotiana alata）为试验材料。
1.2 方法 1.2.1 植物材料的培养及非生物胁迫处理材料培养：挑选籽粒饱满且大小一致的种子，用次氯酸钠溶液表面消毒后，用无菌水清洗数次，随后播种于MS培养基上，并置于恒温培养室中生长（光照：16 h光/8 h暗；温度：25℃）。
非生物胁迫处理及取材：种子萌发后，在MS培养基上生长至2片真叶时，取10株幼苗，在液氮中速冻，用于目的基因的克隆。同时，挑选长势一致的烟苗，分别进行低温（4℃）、干旱（5% PEG6000）、高盐（200 mmol/L）、低钾（10 μmol/L）、ABA（1 μmol/L）及H2O2（10 mmol/L）处理。进行低温处理时，将烟苗置于4℃光照培养箱中；进行其它非生物胁迫处理时，将烟苗分别移至含有5% PEG6000、200 mmol/L Nacl、10 μmol/L钾、1 μmol/L ABA及10 mmol/L H2O2的MS培养基上，然后置于25℃光照培养箱中。每个处理设3个重复，每重复15株烟苗。在处理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，分处理、重复进行整株取样，并置于液氮中保存，用于总RNA的提取。
低钾MS培养基（钾离子终浓度为10 μmol/L）的配制，参照张雪微等方法进行[17]。
此外，采用上述种子处理方法，将种子消毒后，播种于塑料盆中进行培养。待烟苗发育到4叶1心时，分别取烟苗的根、茎、叶及开花期的烟花，保存于液氮中，用于目的基因的组织表达分析。
1.2.2 目的基因克隆总RNA的提取及反转录：采用Trizol法提取烟苗的总RNA[18]，然后，参照cDNA合成试剂盒的方法，进行反转录及cDNA合成。
目的基因的克隆：参照植物的ERF基因序列，利用Primer Premier 5软件设计兼并PCR引物。在预试验的基础上，设计特异引物进行PCR扩增。引物序列如下：ERF1-F：5'-GCCCATGGAACAAGAACAAGTATATGA-3'，ERF1-R：5'-GCCCTAACTAGGACAAAACATTTG-3'。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序为：98℃ 5 min；94℃ 30 s；53℃ 30 s；72℃ 1 min；35个循环；72℃ 10 min；12℃终止。PCR反应体系为（25 μL）：cDNA模板1 μL，Taq Buffer（10x）5 μL，2.5 mol/L dNTP 2 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1μL，ddH2O 14 μL。PCR反应结束后，将产物进行凝胶电泳，回收并纯化目的片段，连接pEASY-Blunt Simple克隆载体，转化Trans1-T1感受态细胞，在含有氨苄青霉素抗性平板上筛选，挑取阳性单克隆进行菌液PCR验证后，送至上海生工生物工程技术有限公司测序。
1.2.3 生物信息学分析利用DNAMAN 8软件对测序正确的序列进行分析，并翻译成氨基酸序列。用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对其基本理化性质进行分析，用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）预测蛋白亲/疏水性。用CDD（http://smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白结构域。用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行亚细胞定位分析，用NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点，用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）和Phyre2分别进行目的蛋白的二级结构和三级结构预测；利用MEGA7软件构建系统进化树。
1.2.4 目的基因的组织表达及响应非生物胁迫的诱导表达分析引物设计：采用Primer Premier 5软件，进行引物设计，用于目的基因的组织表达及响应非生物胁迫的诱导表达分析。正向引物：ERF1-qF：5'-GCCTCTGAACCTATTGCC-3'，反向引物：ERF1-qR：5'-TGCCACGATAAAGGACTG-3'；内参为18S rRNA，引物序列为18S-F：5'-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3'；18S-R：5'-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3'。
目的基因的组织表达及受诱导表达分析：按上述方法提取样品的总RNA，并进行反转录合成cDNA。以花烟草18S rRNA为内参，以cDNA为模板，采用qRT-PCR的方法，进行目的基因片段的PCR扩增。目的基因相对表达量的计算，采用2-△△Ct的方法进行，并利用EXCEL软件进行统计分析及做图。
2 结果 2.1 目的基因的克隆以烟草幼苗为材料提取总RNA，反转录后进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳，在750 bp-1 000 bp之间有一条清晰明亮的条带（图 1）。条带经回收纯化后送样测序。将测序结果用DNAMAN8进行分析并翻译成蛋白序列。同时，在NCBI网站上分析其ORF序列。结果显示，该基因ORF长度为819 bp，编码272个氨基酸。
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| 注：M：DNA Marker；1：目的基因片段 图 1 NaERF1基因克隆 |
在NCBI上，用BLAST对目的基因的CDS序列进行比对，结果表明该基因对多个物种的ERF基因同源性较高。于是，将目的基因命名为NaERF1。
2.2 NaERF1蛋白的生物信息学分析 2.2.1 理化性质分析利用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/）对NaERF1蛋白的理化性质进行了分析，结果显示，NaERF1编码272个氨基酸，该蛋白的分子式为C1339H2064N376O431S13；分子量为30 742.16 Da；理论pI值：6.07；脂肪系数为57.72，带负电荷的残基（Asp+Glu）总数为31个，带正电荷的残基（Arg+Lys）总数为27个。NaERF1蛋白的平均亲水系数（GRAVY）为-0.659，在该蛋白氨基酸组成中丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）含量较高，分别占氨基酸总数的10.7%和9.2%；半胱甘酸（Cys）和色氨酸（Trp）含量较低，分别占氨基酸总数的1.5%和1.8%。
2.2.2 亲/疏水性分析利用ExPaSy网站的ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/），选择Hphob./Kyte & Doolittle算法，对NaERF1蛋白的亲/疏水性进行了分析，结果如图 2所示。NaERF1蛋白序列中第13位氨基酸最高分值为1.144，第266位氨基酸最低分为-2.322。总体上看，亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且平均分值大于疏水性氨基酸，可推测NaERF1蛋白属于亲水性蛋白。
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| 图 2 NaERF1蛋白亲/疏水性分析 |
采用ExPASy提供的TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件，在线对NaERF的跨膜区进行预测，结果如图 3所示。预测结果表明，NaERF1蛋白没有跨膜区，不属于跨膜蛋白。
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| 图 3 NaERF1蛋白跨膜区分析 |
利用在线软件Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/），选用Plant-mPLoc，对NaERF1蛋白进行了亚细胞定位分析。结果显示，该蛋白位于细胞质的可能性为41.5%，位于过氧化物酶体（Peroxisome）的可能性为28%，位于线粒体基质（Mitochondrial matrix space）的可能性为10%。因此，推测该蛋白可能定位于细胞质中。
2.2.5 磷酸化位点预测利用在线软件NetPhos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/），对NaERF1蛋白进行磷酸化位点预测，结果如图 4所示。NaERF1蛋白含有21个丝氨酸（Ser）位点，9个苏氨酸（Thr）位点，4个酪氨酸（Tyr）位点，这些位点均有可能是磷酸化位点。由此说明，NaERF1蛋白能被激酶所磷酸化，从而参与花烟草的各种生理生化过程。
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| 图 4 NaERF1蛋白磷酸化位点预测 |
通过CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）网站，对NaERF1蛋白进行了保守功能域预测。结果（图 5）显示，NaERF1蛋白的第22-83位氨基酸，存在一个典型的ERF转录因子保守结构域（AP2）。表明NaERF1蛋白属于植物的AP2/ERF家族，推测能够行使植物AP2/ERF基因的功能。
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| 图 5 NaERF1蛋白功能域的预测 |
通过SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件，对NaERF1蛋白信号肽进行预测，结果（图 6）显示，该蛋白不含有信号肽。
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| 图 6 NaERF1蛋白的信号肽预测 |
利用SOPMA在线软件，对NaERF1蛋白的二级结构进行了预测，结果如图 7所示。NaERF1蛋白主要由51.10%的无规卷曲（random coil，139个氨基酸参与），38.97%的α-螺旋（alpha helix，106个氨基酸参与），7.72%的延伸链（extended strand，21个氨基酸参与），2.21% β-转角（beta turn，6个氨基酸参与）所构成。同时，利用Phyre2软件预测了NaERF1蛋白的三级结构。
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| A：二级结构预测；B：三级结构预测 图 7 NaERF1蛋白的二级结构与三级结构预测 |
利用NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线工具，在数据库中，搜索并选取与NaERF1序列相似度大于70%以上的37个同源基因，采用MEGA7软件，选用邻位相连法、Bootstrap method选择1000进行计算，构建了系统发育树（图 8）。从分析的结果可以看出，NaERF1与茄科植物的ERF基因亲缘关系较近，而与其它植物的ERF基因亲缘关系较远。其中，同源性最高的为普通烟草（Nicotiana tabacum）的ERF基因（XP 016476774.1），同源性最低的为橡胶树的ERF基因（XP 021640270.1）。
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| 图 8 NaERF1蛋白的同源性分析 |
采用qRT-PCR的方法，对NaERF1在花烟草不同组织与器官中的表达量进行了分析。结果（图 9）显示，NaERF1基因的表达具有组织特异性，其在花中表达量最高，茎中次之，根和叶中表达量较低。该结果说明，NaERF1广泛参与了花烟草的生理生化过程，并有可能主要在花中发挥作用。
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| 图 9 NaERF1在花烟草不同组织器官中的表达分析 |
为了探究NaERF1在花烟草适应非生物逆境中的作用，分析了NaERF1在PEG、高盐、低钾、低温、ABA和H2O2处理下，0 h、3 h、6 h、12 h及24 h的表达情况。结果（图 10）显示，NaERF1基因的表达对这6种非生物胁迫均有所响应。但其响应表达的模式，有明显不同。例如，随着胁迫时间的推移，对低温的响应呈现出先降低后升高的趋势（图 10-A）；对低钾及ABA呈现先升高后降低的模式（图 10-B-C）；对PEG胁迫表现为先升高再降低再升高（图 10-D）；对H2O2的表现为先降低再升高又降低（图 10-E）；而对高盐胁迫，NaERF1的表达则表现为持续降低（图 10-F）。本结果表明，NaERF1可能参与了花烟草对干旱、低温等非生物胁迫的响应过程。
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| 图 10 NaERF1在非生物胁迫下的表达模式 |
植物ERF家族基因，不但数量众多，而且所行使的功能也较为复杂，例如参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫的应答反应等[2-4, 16, 19-20]。其功能的行使，依靠其保守的AP2/ERF结构域，该结构域由大约60个氨基酸所组成[16]。本研究所克隆的NaERF1基因所编码的蛋白，也包含了一个AP2/ERF结构域。所以，可以推测，NaERF1隶属于花烟草的ERF家族，能够行使植物ERF家族基因所具有的功能。
在拟南芥[1]、水稻[1]、玉米[14, 21]、辣椒[15]及普通烟草[20]上的研究表明，植物的ERF基因，不但成员众多，而且其亚细胞定位较为复杂，可以在细胞质、细胞核、叶绿体以及线粒体中特异表达。本研究对NaERF1进行的亚细胞定位的预测结果表明，该基因主要定位于细胞质，与前人的研究结果相一致。此外，NaERF1基因具有组织表达特异性，在花中的表达量最高，在茎、根和叶片中也均有表达。该结果与普通烟草ERF的组织表达模式较为一致[20]。这些结果暗示，NaERF1可能广泛参与了花烟草的生长发育及其生理进程。
研究表明，植物的ERF基因广泛参与了植物响应非生物胁迫的响应过程[16, 20]。例如，拟南芥的ERF基因，参与了干旱及冷害的胁迫响应[2]。过量表达TERF2能够提高转基因烟草及番茄植株对低温胁迫的耐受性[22]。对水稻而言，过量表达OsAP37[23]、OsERF48[24]及OsERF71[25-26]，均能够增强转基因植物的耐旱性；而SERF1则参与了水稻耐盐性的调控，当其功能缺失时，水稻植株对盐胁迫更敏感[27]。番茄的TERF2在水稻中过表达，使得转基因水稻的耐冷性得到了提高[28]。此外，羊草LcDREB3a在拟南芥中的过量表达，可提高转基因植物的抗旱和抗盐能力[29]。本研究分析了NaERF1在PEG、高盐、低钾、低温、ABA和H2O2处理下的表达情况。结果显示，NtaERF1基因的表达，受低钾、ABA的强烈诱导；同时，也在转录水平上对PEG、高盐、低温及H2O2的胁迫有较为明显的响应。具体而言，其响应模式可以分为：（1）先降低后升高型，如在低温胁迫下的表达；（2）先升高后降低型，如在低钾及ABA胁迫下的表达；（3）先升高再降低再升高型，如响应PEG胁迫的表达；（4）先降低再升高又降低型，如响应H2O2的诱导表达；（5）持续降低型，如在高NaCl胁迫下的表达。本研究结果说明，与植物的其它AP2/ERF家族转录因子相类似，NaERF1也可能广泛参与了非生物逆境胁迫的生理响应。其中的调控机制，尚有待于进一步的探索。
4 结论花烟草NaERF1基因所编码的蛋白具有典型的AP2家族保守结构域，属于植物的ERF家族。该基因的表达具有组织特异性，并且响应非生物胁迫的诱导，能够在花烟草非生物胁迫响应中行使相应的功能。
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