2. 南开大学环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300350
2. Ministry of Education Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Nankai University, Tianjin 300350
聚丙烯酰胺(Polyacrylamide，PAM)以其相对高分子量、高黏度的特性，在石油工业、水处理、造纸业和化学工业等具有广泛的应用[1-3]，其中石油行业是我国PAM使用量最大的领域[4]。PAM作为三次采油的驱油剂注入地下后，产生大量含有高浓度聚合物的产出水，严重影响了后续油水分离过程[5]。虽然PAM本身无毒，但其单体丙烯酰胺能损伤人和动物神经系统[6]。
PAM在水环境中的迁移和积累对生物及人体健康具有潜在影响，因此亟待开展PAM的高效降解研究[7]。微生物降解是自然环境中有机污染物完全矿化的主要方法。微生物可通过利用或合成酶类、非蛋白质类和胞外其他物质等分解PAM[8-9]。PAM可作为氮源被微生物利用[10]。PAM也可作为碳源进行微生物生长[11-12]。本实验从受PAM污染的污泥中筛选出一株能以PAM作为唯一碳、氮源的降解菌株，研究了该菌株的降解特性，相关结果可以为受PAM污染环境的修复提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品及试剂菌种来源：陕蒙交界地区的大牛地油田含聚丙烯酰胺污泥。聚丙烯酰胺：分析纯，购自成都科龙化工试剂厂，分子量3×103 kD。
1.1.2 培养基营养培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，调pH为7。基础培养基：聚丙烯酰胺，酵母浸粉0.05 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，琼脂15 g/L(固体培养基)，调pH为7。富集培养基：聚丙烯酰胺0.3 g/L，酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15 g/L(固体培养基)，调pH为7。聚合物培养基：聚丙烯酰胺1.2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，pH为7。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L(固体培养基)，调pH为7。
实验所用试剂均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂。
1.2 方法 1.2.1 降解菌株的驯化及分离取3 g污泥样品接种于100 mL营养培养基中，在30℃、140 r/min的条件下培养48 h，富集污泥中微生物。后取5 mL菌液接种于100 mL基础培养基中，其中PAM浓度按梯度依次为0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、1.8 g/L和2.0 g/L逐渐增大，在相同条件下培养7 d后吸取5 mL驯化液转接到新的基础培养基培养，驯化周期为7 d，连续驯化3个周期后，分别吸取1 mL菌液涂布到富集培养基平板上，30℃下倒置培养24 h-48 h，挑取平板上长出的不同菌落进行划线纯化，保存分离菌株。
在基础培养基的前提下，去掉酵母浸粉，分别加入葡萄糖、氯化铵和不加营养物质配置出限制氮源培养基、限制碳源培养基、限制营养源培养基。
1.2.2 菌株鉴定将纯化后菌液均匀涂在牛肉膏蛋白胨培养基上恒温培养24 h-48 h后，选择分布适中的单菌落进行观察：大小与形状、隆起、边缘、表面、硬度、透明度等。
使用TIANGEN细菌基因组DNA试剂盒提取菌株DNA，利用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCC-TGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGT- TACGACTT-3')对细菌16S rDNA基因进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃下预变性4 min；94℃变性1 min，53℃退火90 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物送至上海生工生物公司进行测序，所得结果经NBCI数据库比对后，挑选相关序列，采用MEGA 5.0软件构建系统发育树。
1.2.3 PAM浓度的影响将聚合物培养基中PAM的浓度依次调整为0.3 g/L、0.6 g/L、1.2 g/L、2.4 g/L、3.6 g/L、4.8 g/L、7.2 g/L和9.6 g/L。将挑选出的菌种接种至培养基中，放入摇床中(30℃，140 r/min)震荡培养48 h后，分别测定细菌浓度和PAM降解率。利用淀粉-碘化镉测定PAM浓度[13]。
1.2.4 培养温度的影响将菌种接种至聚合物培养基中，分别在20、25、30、35和40℃水浴恒温振荡器中培养，140 r/min，震荡培养48 h后，分别测定细菌浓度和PAM降解率。
1.2.5 培养基初始pH的影响将聚合物培养基初始pH值分别调节为3.5、4.5、5.5、6.8、7.5、8.5和9.5，并接种菌种至培养基中，放入摇床(35℃，140 r/min)震荡培养48 h后，分别测定细菌浓度和PAM降解率。
1.2.6 降解曲线的测定在上述所测量的最适PAM初始浓度和pH基础上，PCX接种到以PAM为唯一营养源的培养基中，放入摇床(35℃，140 r/min)震荡培养48 h后，分别测定细菌浓度和PAM降解率。
1.2.7 PAM降解产物分析将降解后的培养液6 000 r/min离心5 min，弃沉淀保留上清液，然后上清液和无水乙醇以1:2体积比震荡混合均匀，静置10 min后以3 000 r/min离心15 min，收集沉淀。沉淀物真空干燥后即得待测样品。凝胶渗透色谱测定降解产物的分子量，采用安捷伦PLGPC220色谱分析仪，以四氧呋喃(THF)为流动相，测定样品的分子量。利用傅里叶变换-红外光谱仪对PAM及其降解产物进行分析，分析波长介于400-4 000 cm-1之间。本实验采用费氏弧菌(Vibrio fischeri NRRL B-11177)测定聚丙烯酰胺降解产物的生物急性毒性，利用发光细菌分析仪BioFix® Lumi-10测定细菌光强度的变化，用SPSS软件的Probit工具计算PAM降解产物的半数效应浓度(EC50)。
2 结果 2.1 降解菌株的分离筛选从分离菌株中筛选出3株菌，分别命名为PCS、PCX、PW，为了研究3株菌对PAM的利用，将3种细菌的菌悬浮液分别接种到限制氮源培养基、限制碳源培养基、限制营养源(碳源、氮源)培养基。当PAM作为唯一氮源时，如图 1所示，PCS、PCX、PW对PAM的降解率分别为42%、37%和31%，普遍高于PAM为碳源和PAM为唯一营养源的降解效果；同时3株降解菌的细菌浓度分别为2.13×108 CFU/mL、2.69×108 CFU/mL、2.44×108 CFU/mL，同样高于PAM为碳源和PAM为唯一营养源的培养基。当PAM作为唯一碳源和唯一碳、氮源时仅剩菌株PCX生长情况最好，细菌浓度大于108 CFU/mL，对PAM的降解率仍大于30%，因此选择PCX作为后期实验菌种。
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| 图 1 PAM为碳源、氮源、同时为碳氮源条件下3株菌的降解率 |
由菌落形态和个体形态观察发现，该细菌菌落形态特性呈现为：圆形、乳白色、有光泽、整齐、光滑及不透明；个体形态特性为：短杆状、革兰氏染色G-、无芽孢和无荚膜。进一步通过对PCX的16S rDNA检测发现：PCX的16S r DNA序列(GenBank登录号MK571603)，与Klebsiella sp. NBRC 100048(登录号AB681138.1)有99.9%的相似度；根据测序结果，利用NCBI提供的Blast工具，经过16S rDNA测序及同源性对比，通过MEGA 5.5邻接法(Neighbour-joiningmethod，NJ)构建出系统发育树如图 2所示，因此鉴定菌株PCX为克雷伯氏杆菌属。
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| 图 2 降解菌PCX基于16S rDNA序列的系统发育进化树 |
如图 3所示，当PAM初始浓度在1.2 g/L时，培养48 h后，PCX对PAM的降解率最高，达到35%。但当PAM的浓度大于3 g/L时，PAM的降解率受到抑制，基本低于20%。
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| 图 3 PAM浓度对菌株生长和降解率的影响 |
培养温度对降解效果和菌体的生长的影响如图 4所示。在20-35℃条件下，随着温度的升高，PAM的降解率升高。在35℃时，PCX生长状况和降解效率最好，分别达到了2.44×108 CFU/mL和43%。因此选取35℃作为PCX的最适培养温度。
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| 图 4 温度对降解的影响 |
如图 5所示，初始pH值的不同对PAM溶液中的PCX的生长产生了一定的影响，同时过高或过低的pH值都不利于PAM的降解，对于本实验的菌株PCX，适宜降解PAM的pH值范围是5.0-7.0，最适pH为7.0。
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| 图 5 初始pH值对降解的影响 |
PCX接种到以PAM为唯一营养源的培养基中，随时间变化的生长曲线和降解曲线，如图 6所示。PCX在接种后2 h进入对数增长期，菌体数量不断增加，PAM降解率也随之明显升高，说明PCX能以PAM作为唯一营养源生长，同时使得PAM发生降解。培养40 h后细菌进入稳定期，细菌代谢产物不断积累，细菌繁殖速度下降，PAM降解率趋于平缓，降解率达43%左右。
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| 图 6 降解菌PCX的降解曲线 |
聚丙烯酰胺经过降解菌PCX降解后的产物的凝胶色谱结果如表 1所示，降解产物的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和峰位分子量(Mp)分别为0.602 kD、0.647 kD和0.619 kD。聚丙烯酰胺降解前的分子量为3×103 kD，表明在微生物的作用下，PAM主碳链发生断裂，被降解成为小分子物质。
对微生物降解前后的PAM进行了红外光谱分析，如图 7所示，与生物降解前PAM样品的光谱中的峰相比，生物降解后的PAM样品的光谱中的C=O伸缩振动峰由1 665 cm-1移动到更高波数的位置1 672 cm-1处，2 925 cm-1为亚甲基反对称伸缩振动的特征吸收峰，2 854 cm-1为亚甲基对称伸缩振动的特征吸收峰。红外光谱分析表明C-N伸缩振动峰(降解前吸收峰在1 405 cm-1处)和N-H弯曲振动(降解前吸收峰在1 452 cm-1处)消失，3 300-3 500 cm-1波长范围内变成了一个宽大的吸收峰，表明PAM的酰胺基从PAM主链上剥落并被微生物利用，酰胺基通过微生物的降解完全转化为羧基。
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| 图 7 PAM降解前后的红外光谱图 |
半数效应浓度(EC50)是导致发光细菌发光强度产生50%变化时的测试样品的浓度。用SPSS软件计算PAM降解产物的生物急性毒性，软件分析结果表明聚丙烯酰胺降解产物在30 min内对费希尔弧菌的EC50为106 mg/L，其95%置信区间为28-489。根据欧盟指令(Directive93/67/EEC)给出的化学品水生生物急性毒性分类规则，降解产物的半数致死浓度大于100 mg/g无毒性[14]，可以判定克雷伯氏菌降解PAM的产物对水生生物无毒害作用，表明降解产物中可能无丙烯酰胺单体。
3 讨论从若干分离菌株中筛选出3株菌(PCS、PCX和PW)，PAM作氮源时，降解菌的生长状况和对PAM的降解率普遍优于PAM做碳源和PAM为唯一营养源时；说明PAM更易于被微生物作为氮源利用。但对于PAM来说，只有当它作为碳源被利用时才更有利于聚合物的解链和彻底降解。在本研究中当菌株生长在限制碳源和限制营养源培养基中时，菌株PCX生长情况最好，细菌浓度大于108 CFU/mL，对PAM的降解率仍大于30%，说明该菌株可以将PAM既作为氮源又作为碳源而进行利用。
PCX对PAM的适宜浓度是1.2-2.4 g/L，当培养基中PAM浓度较高时，体系的黏度也会上升，影响PCX菌体的扩散，同时PAM自身的絮凝、架桥作用使得微生物更难利用[15-16]。在高PAM浓度下，PCX需要更长的时间来适应环境。相反地，当PAM的浓度低于1.2 g/L时，PCX菌体的增殖速率略缓，最终菌体数量较低。温度对PAM降解率的影响较大。随着培养温度上升使酶促反应加快，有助于菌株PCX的代谢生长，利于微生物对底物PAM的降解[17]。不同的微生物在其不同的生长阶段和生理、生化过程中，最适宜的pH值也不同[18]。pH在5.0-7.0范围内，还原酶、胞外酰胺酶活性最好，对于底物的利用率最高，从而对PAM的降解效果最好[19-20]。
通过对PAM降解产物的生物急性毒性评价发现，降解产物对水生生物无毒害作用。红外光谱分析表明聚丙烯酰胺在降解菌PCX的作用下，酰胺基已经转化为羧基被PCX作为氮源利用。PAM可同时被降解菌PCX作为碳源和氮源加以利用，将其分解代谢为小分子物质。克雷伯氏菌属在降解聚丙烯酰胺聚合物上具有一定的应用前景，为后续处理难降解聚合物提供新的思路。
4 结论本研究从聚丙烯酰胺污染的污泥中初步筛选出3株好氧的PAM降解菌种，其中PCX在限制碳源和氮源的培养基中生长情况最好，对PAM的降解率达到了43%。PCX的形态特征、生理生化鉴定和16S rDNA序列鉴定的结果表明，PCX为克雷伯氏菌属，命名为Klebsiella sp. PCX。
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