microRNA（miRNA）是一类大小为20-24 nt、具有调控功能的内源性非编码RNA。众多的miRNA参与了植物对低温的感受、响应、信号转导和适应过程[1-2]。在miRNA研究中，通常需要对miRNA在植物各组织和器官中的表达量进行分析，确定miRNA表达量对于探究miRNA的生物学功能尤其重要[3-4]。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技术具有高灵敏性、特异性、快速简单、低样本浓度需求等优点，是研究基因表达的首选方法[1-2, 5]。然而，qRT-PCR结果中基因表达量的精确和准确性分析依赖于所选择的内参基因[6]。在qRT-PCR中，最常用的植物内参基因包括肌动蛋白（ACT）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、18S核糖体RNA（18S）和F-BOX家族蛋白（FP），但在miRNA定量检测中并不选择这些内参基因[7-8]。研究表明当选用ACT作为miRNA研究的内参时，由于目的miRNA与ACT的大小有较大的差异，在校正miRNA数据时并不理想[9]。不经筛选直接使用常见内参基因会降低试验结果的准确性[10-12]。内参基因的稳定性差导致基因表达量检测的误差，如在研究杂交兰（Cymbidium hybrid）花器官不同部位中八氢番茄红素脱氢酶基因（ChPDS）的表达模式时，以杂交兰泛素蛋白基因（ChUBQ）、杂交兰延伸因子基因（ChEF-1α）、杂交兰微管蛋白基因（ChTUB）、杂交兰肌动蛋白基因（ChACT）及杂交兰泛素蛋白基因（ChUBQ）和杂交兰延伸因子基因（ChEF-1α）组合进行校正的杂交兰ChPDS表达模式均为花瓣 > 唇瓣 > 蕊柱，而以稳定性最差的杂交兰RNA聚合酶β亚基基因（ChrpoB）进行校正时，杂交兰ChPDS相对表达量为花瓣 > 蕊柱 > 唇瓣[13]。因此，针对实际情况筛选内参基因很有必要性[1-2, 5]。
小桐子（Jatropha curcas）是一种有巨大综合开发潜力的多用途能源植物树种，原产热带及亚热带地区，抗寒性较弱，是一种喜温冷敏植物[14-16]。Maes等[17]进行的世界范围内的调查表明，小桐子生长适宜的年均温度为19.3-27.2℃，最低月均温度要高于10.5℃。而随着小桐子栽培的北移和向高海拔山区发展，低温冷害已成为限制小桐子产业的主要环境因素[15-17]。为研究miRNA在小桐子低温胁迫与适应过程中的调控作用，本课题组前期进行了小桐子小RNA-seq分析，初步获得了差异表达与稳定表达的miRNA信息[18]，但要进行进一步qRT-PCR验证，需要筛选合适的内参基因用于miRNA定量分析。但目前尚未见对小桐子miRNA qRT-PCR内参基因筛选的报道。
本研究基于小桐子小RNA-seq数据[18]，筛选低温处理前后表达量相对稳定的10个miRNA以及在其他物种miRNA定量分析中常用的U6作为候选内参，采用qRT-PCR方法对候选内参基因在低温胁迫下的表达稳定性进行分析，以期筛选出可用于小桐子低温胁迫下miRNA差异表达分析的稳定内参基因，为小桐子miRNA表达的定量分析提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料选取饱满的小桐子种子，参照李忠光等[19]方法，用1.5% CuSO4溶液消毒，在恒温培养箱中萌发5 d，将发芽的种子种在营养土中，在相对湿度75%、26/20℃、16/8 h光周期的培养箱中培养21 d，至第3片真叶展开[20]。
1.1.2 低温处理在小桐子长至第3片真叶展开时，转入1℃光照培养箱中低温处理5 d，每天取样1次（LT1d-LT5d，取用第2片及以上展开真叶）。以未处理的小桐子作为对照1（C0d）；另在正常培养条件下第26天取样作为对照2（C5d）。依据前期结果，在1℃处理5 d时，小桐子幼苗死亡率约70%[20-21]。
1.2 方法 1.2.1 样品miRNA提取及cDNA合成参照Plant miRNA Kit（OMEGA公司）说明书提取miRNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测miRNA的质量，NanoPhotometer-N60超微量分光光度仪（Implen，Germany）测定浓度，并通过OD260/OD280和OD260/OD230检测miRNA的纯度。采用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（Tiangen，北京）反转录cDNA。反应体系为Reaction Buffer 10 μL、Enzyme Mix 2 μL、miRNA 2 μL，加水至20 μL。42℃孵育1 h，并在95℃加热3 min失活逆转录酶（RT enzyme mix），进行miRNA加A尾反应以及cDNA第一链合成。cDNA用NanoPhotometer-N60超微量分光光度仪（Implen，Germany）测定浓度，每份样本终浓度为100 ng/µL，取1 µL用于qRT-PCR。
1.2.2 qRT-PCR各供选基因引物设计在11个候选内参基因中，U6 snRNA序列来自于Jatropha curcas Database（JCDB）和NCBI；10个来自小桐子低温胁迫下小RNA-seq[18]中表达稳定的miRNA，按照其序列设计引物，反向引物为：5'-GCTGTCAACGAT-ACGCTACGTAACG-3'。利用DNAMAN 8（Lynnon，USA）进行引物互补检测，减少引物自身延伸或两两互补延伸形成二聚体的可能性（表 1）。
根据TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNase H PLUS）试剂盒说明书配置10 μL反应体系，cDNA模板1 µL（10 ng/µL）、正反向引物各0.4 µL（10 μmol/L）、2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix 5 µL和ddH2O 3.2 µL。所有操作均在冰上进行，3个重复，3次生物学重复。反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环，并在65-97℃进行熔解曲线分析。利用LightCycler® 96 System（Roche，Switzerland）进行qRT-PCR反应。
1.2.4 数据处理记录qRT-PCR分析得出的基因转录水平Ct值，每个基因在不同处理样本中的Ct值测定3个重复。qRT-PCR熔解曲线利用LightCycler 96 SW 1.1（Roche，Switzerland）软件进行作图及分析；利用geNorm（https://genorm.cmgg.be/）、NormFinder（https://www.moma.dk/normfinder-software/）和BestKeeper（https://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html）分析11个候选内参基因的表达稳定性；利用Microsoft Excel 2016进行数据作图。
2 结果 2.1 miRNA质量检测通过2%琼脂糖凝胶电泳检测提取的miRNA样品（图 1）。可见提取的miRNA质量较好；各样品中miRNA的OD260/OD280、OD260/OD230的值均大于1.8（表 2），miRNA质量满足后续实验的需求。
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| M：DNA Marker 100 图 1 提取的miRNA2%的琼脂糖凝胶电泳图 |
以miRNA cDNA第一链为模板进行qRT-PCR扩增，用2%琼脂糖凝胶电泳检测（图 2）。11条内参基因条带单一，通过测序、比对等检测，确定扩增产物为引物特异性扩增产物，符合预期结果。
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| M：DNA Marker 100 图 2 内参基因的qRT-PCR分析 |
经熔解曲线分析，11条候选内参基因的熔解曲线均呈现明显的单一峰（图 3），不存在引物二聚体，并且每个样本的重复性较好，进一步说明引物的特异性，可进行后续实验分析。
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| -dF/dT：荧光信号强度负一次导数 图 3 十一个候选内参基因的qRT-PCR熔解曲线 |
11个候选内参基因在不同温度处理的小桐子叶片中，平均Ct值变化范围为10.53-26.03（图 4），其中U6 Ct值最小，miR2612 Ct值最大（图 5）。
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| 图 4 11个候选内参基因平均Ct值分布 |
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| 图 5 各候选基因在不同处理下叶片组织中Ct值分布 |
利用GeNorm软件对11个候选内参基因在不同处理下叶片组织中稳定性（M值）分析（图 6），M值由高到低为miR5672、miR5040、miR5535、miR1446、miR3624、miR5791、miR2612、miR159、miR3630、U6、miR6448，所选候选内参基因的M值均小于1.5，表明候选基因表达都较稳定，M值最低的是miR6448；其次是U6。可见miR6448在低温胁迫下表达最稳定，其次是U6。
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| 图 6 不同处理下叶片组织中内参基因的GeNorm分析 |
通过对不同处理下叶片组织中内参基因的NormFinder分析（表 3），发现稳定值最小的是miR6448（0.088）；其次是U6（0.134）。这与GeNorm分析得出的结果一致。
由BestKeeper分析标准偏差和变异系数，miRNA6448的标准偏差（0.18）和变异系数（0.78）都是最小的，表明miRNA6448在低温胁迫下的小桐子中表达最稳定。
3 讨论进行qRT-PCR时，对内参基因的筛选非常有必要。内参基因在qRT-PCR中可以降低或校正基因定量过程中存在的误差，选择合适的内参基因对于基因定量表达的结果有重要意义[3, 10]。而在选择内参基因时，除内参基因的稳定性，内参基因的表达丰度也会影响qRT-PCR结果[13, 22-23]。内参基因与所检测基因之间的Ct值差异越小，扩增效率对计算结果的影响也会越小，计算的结果会更加准确[23]。如果目标基因和内参基因表达量（Ct值）过大，用内参基因来衡量目标基因的表达量就不完全可靠[10, 23]。在本研究中，miR6448的Ct值为23左右，丰度适中，可以用于检测qRT-PCR试验中丰度较适中的转录本；U6的Ct值为10左右，可以用于miRNA qRT-PCR实验中丰度较高的转录本检测。
在进行miRNA研究时，提取的miRNA中往往弃除了mRNA等长链RNA，因此，相对链长较长的mRNA无法再用作miRNA定量研究的内参[24]。在qRT-PCR中，最常用的植物内参基因包括ACT、GAPDH、18S和F-BOX家族蛋白，通常在miRNA定量检测中并不选择这些内参基因[7-8]。常用于miRNA荧光定量的内参基因多为一些片段长度相对较短的基因，例如U6[3, 25-26]。在大豆[27]、小麦[28]、龙眼[29]和百合[8]等植物miRNA的qRT-PCR分析中，miRNA的表达水平比最常用的ACT、GAPDH、F-BOX等蛋白质编码基因稳定得多。
在miRNA的qRT-PCR分析时，常常需要根据不同的植物材料和处理条件来选择合适的内参。茶树低温胁迫下，miRNA（PC-3p-222）在不同低温处理以及不同茶树组织中表达最为稳定，可作为茶树低温胁迫下miRNA的qRT-PCR的内参基因[30]。甘蔗芽在低温胁迫下，miR171/18S rRNA和miR171/miR5059表达最稳定[31]。盐胁迫下，U6适合作为大豆根组织miRNA研究的内参[32]。葡萄在盐胁迫和低温胁迫下，U6是表达最稳定的基因[1]。本研究发现，小桐子叶片组织对低温胁迫处理响应的miRNA中，miR6448和U6的表达表现稳定。可见miRNA内参基因除特异性外，像U6这样的基因也表现出一定的通用性。
4 结论低温胁迫下表达最稳定的基因是miR6448和U6。miR6448适用于表达丰度适中的microRNA基因表达定量分析中；U6适用于丰度较高的microRNA的qRT-PCR分析。
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