2. 江苏奥赛康药业股份有限公司，南京 211112
2. Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing 211112
核因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)是由Sen和Baltimor首次从B淋巴细胞核提取物中发现的一种蛋白因子，能够与免疫球蛋白κ轻链的κB序列相结合[1]。NF-κB蛋白家族包括5个亚基: NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)、RelA(P65)、Rel(c-REL)和RelB，这些亚基能够形成同源或异源二聚体存在于细胞质中，其中以P50-P60形式最为常见。这些二聚体通常与抑制因子IκB(Inhibitor of NF-κB)结合，形成复合物，处于非激活状态。当受到刺激因素如肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、病毒、氧自由基、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)等刺激时，复合物被激活，解离出NF-κB并转移至细胞核中与相应的位点结合启动基因转录[2]。此外，NF-κB参与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)[3]、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)[3]、神经生长因子受体(Nerve growth factor receptor，NGFR)[4]、白介素-1受体(Interleukin-1 receptor，IL-1R)[5-6]、CD40[7]等受体或受体家族信号转导过程，是众多信号通路的交汇点，能够与多种细胞因子基因的启动子或增强子相结合，参与调控细胞增殖、分化、炎症和凋亡等过程。
报告基因(Reporter gene)是指编码易于被检测的酶或蛋白的基因，通常插入到表达调节序列当中，或与目的基因相连接形成嵌合序列。由于报告基因法作用迅速，往往只需要几个小时即可获取到检测结果，在体外药物筛选中可实现高通量操作，因此备受关注[8]。常用的报告基因包括荧光素酶(Luciferase)、荧光蛋白和β-半乳糖苷酶等。荧光素酶是指来源于自然界能够发光的生物体内，可以催化荧光素氧化发光的一类酶的总称，具有非放射性、灵敏度高、反应迅速、半衰期长等优点。截至目前，应用最为广泛的是来自于萤火虫和发光海肾的荧光素酶。萤火虫荧光素酶是一个单亚基蛋白，稳定性好且不需要进行翻译后修饰，可用于报告基因系统[9]。
在本研究中，构建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293单克隆细胞系，由于NF-κB涉及细胞内多条信号转导通路，因此可用于NF-κB激活相关的药物活性检测，可进行改造和应用。本研究中以FGFRⅡ为例，对其扩展应用进行了初步验证。
1 材料与方法 1.1 材料Plentivirus-NF-κB-RE-Luc2P，购买于QIAGEN公司; Plentivirus-FGFRⅡ，购买于Cyagen公司; HEK293细胞，购买于中科院细胞库; TNF-α，购自R & D公司; 生长培养基，DMEM(GIBCO)+10%FBS(GIBCO)+1%青链双抗(GIBCO)，工作培养基，DMEM+1%FBS; 选择培养基:生长培养基+2 μg/mL Puromycin(GIBCO)，生长培养基+2 μg/mL Puromycin+300μg/ml Hygromycin(GIBCO); SURE-entry，荧光素酶显色剂(One-Glo)，购自Promega公司; RNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司; 反转录试剂盒，SYBRGREEN I matrix，购自Takara公司; Palifermin®购自Amgen公司。
1.2 方法 1.2.1 HEK293细胞培养病毒感染前1 d，采用0.25%胰酶消化，将处于对数生长期的细胞制备成单细胞悬液并计数，以1.6×104/mL细胞浓度接种24孔培养板，细胞数目为8×104/孔，在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中过夜培养。
1.2.2 病毒感染HEK293细胞根据病毒感染使用说明，取一支病毒悬液于4℃解冻。移除24孔培养板中培养基，依次缓慢加入相应体积10%FBS+DMEM培养基，完全解冻的病毒悬液，感染辅助试剂SURE-entry(终浓度=8 μg/mL)，轻轻摇匀，37℃、5% CO2细胞培养箱中放置6-8 h，镜下观察细胞生长状态良好，继续培养72-96 h。
1.2.3 加压筛选及单克隆细胞株分离培养培养72-96 h后，更换为选择培养基继续培养，间隔每2-3 d换液，筛选时间约2-3周，细胞融合度达到约90%时扩大培养至75 cm2细胞瓶，冻存多克隆细胞系。多克隆细胞复苏培养后进行单克隆筛选，以5/mL细胞浓度接种96孔培养板，每孔细胞数目为0.5个，24 h后镜下观察，挑选只含有单个细胞的细胞孔，间隔3-4 d换液，筛选时间约3周，细胞融合度达到约90%时消化细胞并逐渐扩大培养至75 cm2细胞瓶，冻存单克隆细胞系。
1.2.4 RT-QPCR取1×106个FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞提取RNA并测定RNA浓度。RNA反转录形成cDNA，反应体系为1 μg RNA，4 μL 5× prime script buffer，1 μL Oligo DT primer，1 μL Oligo DT primer Random 6mers，补H2O至20 μL。QPCR反应体系为12.5 μL SYBRGREEN I matrix，1 μL正向引物，1 μL反向引物，5 μL cDNA，补H2O至25 μL。引物序列:目的基因FGFRⅡ-F/R，CTCAAGCACTCGGGGATAAA/ CTGTTTTGGCAGGA-CAGTGA; 内参基因Beta-actin-F/R，CATCGAGCA-CGGCATCGTCA/ TAGCACAGCCTGGATAGCAAC。反应程序为95℃，15 s，40个循环; 60℃，15 s，70℃，10 s。2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。
1.2.5 细胞系荧光素酶活性检测取对数生长期的NF-κB-RE-Luc2P HEK293或FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞，消化计数，用工作培养基1%FBS+DMEM稀释至4×105个/mL，转移100 μL到96孔板中，细胞数目4×104个/孔，过夜培养。TNF-α刺激NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞，生长培养基2倍梯度稀释TNF-α(100 ng/mL，共12个浓度梯度，每孔100 μL加入96孔板中; FGF融合蛋白刺激FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞，工作培养基4倍梯度稀释FGF融合蛋白(50 ng/mL)，共10个浓度梯度，每孔100 μL加入96孔板中; 37℃、5% CO2孵育6 h后，每孔加入One-Glo 50 μL，室温反应5 min，放入酶标仪读数，实验结果采用四参数拟合。
1.2.6 统计分析每组实验均重复3次或3次以上，所获得的数据均以平均值±标准差形式进行表示，数据均采用Graph-pad Prism5软件进行分析，不同数据间对比采用t检验法，当P < 0.05时差异显著(*)，当P < 0.01时差异极显著(**表示P < 0.01，***表示P < 0.001)。
2 结果 2.1 病毒最佳感染效率(MOI)确定在NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染HEK293实验中，MOI分别设置了0、5、10、15和20等5个梯度，实验结果(图 1-A)表明，MOI为10-20时转染效果较好，其中又以MOI=15转染效率最高。当MOI=15时，用NF-κB-RE-Luc2P慢病毒感染细胞，所获得的多克隆细胞接种于96孔板中，进行功能验证。加入20 ng/mL TNF-α刺激6 h后，采用One-Glo化学发光法进行检测，信噪比可达到20.2倍(P=0.007 3)(图 1-B)，结果表明NF-κB-RE-Luc2P慢病毒已成功感染HEK293细胞。
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| 图 1 MOI及病毒感染验证 |
为了进一步得到稳定传代的细胞系，多克隆细胞NF-κB-RE-Luc2P HEK293采用有限稀释法进行单克隆分离培养，使用Puromycin加压筛选。经过加压与分离培养，成功地获得了NF-κB-RE-Luc2P HEK293单克隆稳定表达细胞系。将获取的单克隆细胞铺到96孔板，进行功能验证。TNF-α(100 ng/mL起始，2倍梯度稀释)刺激6 h，采用One-Glo化学发光法进行检测。数据显示(图 2-A)，响应值与TNF-α浓度可拟合成剂量依赖的“S”型曲线，当TNF-α浓度为20 ng/mL时与对照组相比，信噪比可达到113.7倍以上(P < 0.001)(图 2-B)。结果表明，本研究成功获得NF-κB-RE-Luc2P HEK293单克隆细胞系。
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| 图 2 NF-κB-RE-luc2P HEK293细胞系TNF-α刺激实验 |
为了证明NF-κB-RE-Luc2P HEK293单克隆细胞系改造后可用于药物活性检测，将此细胞系感染FGFRⅡ受体，按照同样的单克隆筛选流程，使用Puromycin和Hygromycin加压培养，获得单克隆细胞FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293。RT-QPCR检测FGFRⅡ mRNA表达水平，其表达水平显著高于对照组细胞，比值可达到204倍(204.2:1)(图 3-A)，结果表明，FGFRⅡ成功导入到NF-κB-RE-Luc2P HEK293，并可稳定表达。
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| 图 3 FGFR II/NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞系鉴定 |
为了进步验证此细胞系的药物检测功能，选用FGF7类蛋白药物Palifermin®，梯度稀释后加入到此细胞系中，结果(图 3-B)显示，响应值与Palifermin®浓度呈剂量依赖型S曲线，表明该细胞系可用于FGF7蛋白药物活性检测。
3 讨论随着生物技术药物的发展与检测手段的不断革新，荧光素酶报告基因法凭借其灵敏度高、简便可靠等技术优点越来越受业内关注，已逐渐成为药物筛选及体外活性检测的发展趋势。然而，针对不同生物靶点的药物筛选及药物活性检测，往往需要对其适配的工程细胞系进行单独构建或定制，人力、物力及时间成本投入较大。因此，在一定程度上具备通用性的细胞系就显得尤为必要。
NF-κB信号通路与机体免疫、炎症反应和细胞生长及分化紧密相关，以NF-κB及其信号通路为靶标的药物可用于肿瘤和炎症的预防与治疗。如NF-κB特异性抑制剂药物(Dehydroxymethylepoxyquinomicin，DHMEQ)，在肺癌[10]、肝癌[11]、乳腺癌[12]和多发性骨髓瘤[13]的体内外研究中均取得了理想的研究结果，又如地塞米松、阿司匹林和舒林酸等抗炎药物，也是通过阻断NF-κB通路发挥其抗炎效果[14]。除此之外，NF-κB还广泛参与TNFR、FGFR、EGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受体或受体家族的调节过程，是众多信号通路的交汇点[15-16]，因此该细胞系在这类靶点相关药物的筛选及检测中，具备通用性。
细胞系构建及筛选是一个复杂而又繁琐的实验过程。在本研究中，以慢病毒为载体，携带目的基因进行感染HEK293，由于病毒感染的过程对细胞具有一定损伤作用，因此实验时必须保证HEK293维持在较好的细胞状态，如待用培养基必须37℃预热、病毒及SURE-entry的添加必须轻柔避免细胞脱落等。在单克隆筛选实验中，本研究采用的是有限稀释法进行分离培养，因此在克隆挑选时必须在细胞发生分裂前进行，此时细胞孔内仅有单个细胞，从而可以保证所获得的细胞系均为单一克隆。
在本研究中，以NF-κB-RE-Luc2P慢病毒为载体，经感染、抗生素加压与单克隆分离培养成功获得了NF-κB-RE-Luc2P单克隆细胞系，该细胞系可直接用于以TNF-α或其受体家族为靶点的药物筛选及活性检测，如类风湿性关节炎靶向治疗药物Humira®及其生物类似药等[17]。同时本研究还奠定了以NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞系为基础，针对不同的研究需求继续进行改造和完善的方案，继续引入EGFR、FGFR、NGFR等受体，可用于后续的相关药物活性检测。如本研究成功导入了受体FGFRⅡ，获得了FGFRⅡ/NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞系，进行了体外FGF类药物验证实验，结果表明该细胞系可用于FGF类药物的活性检测。
4 结论在本研究中，采用慢病毒感染方法成功构建了NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞系，该细胞系可直接用于以TNF-α或其受体家族为靶点的药物筛选及活性检测。同时，由于NF-κB还涉及EGFR、FGFR、NGFR、IL-1R和CD40等受体或受体家族介导的多条信号转导通路，以此细胞系为基础感染FGFR家族的受体FGFRⅡ，并进行了初步确证，结果表明响应值与药物Palifermin®呈现浓度依赖型“S”型曲线，可用于该类药物活性检测。综上所述，本研究成功获得了稳定表达的NF-κB-RE-Luc2P HEK293细胞系。由于NF-κB是细胞内多个信号转导通路的交汇点，因此该细胞系具备通用性及进一步改造的潜力，具有研究及应用价值。
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