巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)是甲醇酵母。甲醇为单一碳源时, P. pastoris胞内的醇氧化酶1(Alcohol oxidase 1, Aox1, EC1.1.3.13)能高效催化甲醇氧化成甲醛, 同时Aox1可达到细胞干重的30%^[1-2]。利用高效的Aox1启动子(aox1 promoter, P_aox1)启动外源蛋白的表达, 成功构建了巴斯德毕赤酵母表达系统, 该表达系统是目前应用最广泛的重组蛋白表达系统之一^[3-4]。然而P. pastoris甲醇的代谢存在碳源阻遏现象, 即葡萄糖、甘油等碳源的存在可以阻遏甲醇的代谢, Paox1在甲醇为唯一碳源时被激活, 在甘油存在时被抑制^[5]。甘油代谢和甲醇代谢之间调控的分子机理尚不十分清晰, Paox1的激活和抑制是其研究的核心。

目前已发现多个调控Paox1的转录因子^[6-7], 其中甲醇表达调控因子1(Methanol expression regμLator 1, Mxr1, GenBank:ABD57365.1)是最重要的Paox1激活因子, Mxr1的缺失会导致P. pastoris无法利用甲醇^[8-9]。研究表明, Mxr1是组成型表达, 但是, 在甲醇为唯一碳源的培养基中转录激活活性; 在甘油培养基无活性^{[3, 10]}。同时发现Mxr1上存在磷酸化的Ser215位点, 能够调控Mxr1转录激活活性^[8]。说明Mxr1功能的发挥主要受磷酸化修饰调节。但是对Mxr1去磷酸化的酶一直尚未发现, 本文在研究与Mxr1相互作用的蛋白中找到了使Mxr1去磷酸化的酶—蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶(Protein phosphotyrosine phosphatase, Ptp), 并发现该酶对Mxr1的磷酸化水平的调节有明显的调控效果。蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶是一种比较保守的低分子量的磷酸酶^[11-12], 而蛋白的磷酸化和去磷酸化对蛋白活性的调节发挥重要作用^[13], 推测蛋白质磷酸酪氨酸磷酸酶调控Mxr1磷酸化, 进而调控Mxr1活性。

1 材料和方法 1.1 材料

LA Taq DNA聚合酶、内切酶(EcoRI、XhoI、SacI)、T4 DNA连接酶、卡那霉素、博来霉素、四环素, 分光光度计(上海美诺达仪器有限公司), 凝胶成像仪, 蛋白质电泳仪(北京六一仪器), PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)。

1.1.1 菌株和质粒

巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)GS115、pGAPZB毕赤酵母表达载体、大肠杆菌E. coli DH5α, E. coli BL21, pSVT7大肠杆菌表达载体(表 1)。

1.1.2 培养基

LB培养基(酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、1×10⁵ Pa灭菌20 min, 固体培养基添加2%琼脂粉)、LLB培养基(酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、1×10⁵ Pa灭菌20 min, 固体培养基添加2%琼脂粉)、BMY培养基(酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸钾缓冲液, pH6.1, 1×10⁵ Pa灭菌20 min, 无菌酵母无氨基酸氮源YNB 13.4 g/L, 无菌生物素0.4 mg/L, 碳源按照实验要求后续添加)、YPD培养基(酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、115℃灭菌30 min, 固体培养基添加2%琼脂粉)。TB/SB培养基酵母提取物13 g/L、胰蛋白胨24 g/L、甘油10 g/L、KH₂PO₄ 23.1 g/L、K₂HPO₄ 12.55 g/L, 1×10⁵ Pa灭菌20 min。

1.1.3 引物

本研究所用到的引物(表 2)由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 磷酸酶Ptp高表达载体的构建及宿主转化

以GS115基因组为模板, PCR扩增ptp片段, 纯化, 用Kpn I, Not I分别双酶切片段和pGAPZB质粒, 分化纯化回收, 用T4连接酶链接片段和载体, 得到ptp高表达载体PGAP-PTP, 转化感受态E.coli DH5α, 然后用含有博来霉素的LLB平板筛选和PCR菌落鉴定, 并送苏州金唯智生物科技有限公司测序, 保存测序正确的菌株。挑选重组子单菌落接种于YPD液体培养基培养24 h, 提取基因组, 用引物zecin-f, zecin-r扩增博来霉素基因。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳, 检测PGAP-PTP在P.pastoris染色体的整合情况。筛选到的重组子命名为PTP-GS115。

1.2.2 利用CRISPR/Cas9系统敲除磷酸酶ptp及构建Mxr1S215A定点突变菌株

利用本实验室构建好的基因编辑系统, 设计3条sgRNA, 电转cas9-GS115感受态, 经过PCR, 测序验证, 在48碱基处成功敲除1个碱基, 命名为ΔPTP-GS115。构建定点突变的上下游500 bp同源臂, 通过融合PCR, 形成上游同源臂定点突变下游同源臂序列, 在突变位点上下200 bp左右设计3条sgRNA, 构建sgRNA质粒, 电转Cas9-GS115通过PCR验证敲掉的碱基数和定点突变。培养P.pastoris细胞、提取基因组及总蛋白质参照Invitrogen公司操作手册。

1.2.3 荧光定量PCR检测Mxr1不同突变体下游基因表达量

将保存于YPD平板的突变菌株GS115和野生型GS115接种于YPD液体培养基进行过夜活化, 统一OD₆₀₀=0.5用无菌PBS洗3次, 接种与含有1%甲醇为碳源的BMMY培养基, 在30℃、230 r/min下培养24 h, 36 h收集菌体, PBS清洗1次, 提取RNA, 反转成cDNA, 荧光定量检测下游基因表达量。

1.2.4 Ptp诱导表达

通过NCBI数据库报道的ptp基因序列, 由苏州金唯智生物科技有限公司对ptp序列进行密码子优化, 6His-PTP连到pSVT7载体, 转化感受态E.coliBL21, 保存菌株。接种LB(15 μg/mL四环素)的液体培养基, 37℃, 230 r/min培养过夜(14 h)。测定OD₆₀₀, 并按照初始0.1接种于TB/SB(含15 μg/mL四环素)培养基中, 30℃, 230 r/min培养5 h, 然后加入不同体积的IPTG进行诱导23℃, 230 r/min培养16 h, 收集菌体。超声波破碎细胞, 提取总蛋白, 磷酸酶的Ptp Western blot检测, 总蛋白SDS-PAGE电泳后, 使用电转仪将蛋白条带转移至PVDF膜上, TBST清洗3次, 每次5 min。使用5%的脱脂奶粉封闭1 h, 加入HRP标记的鼠抗His6抗体(1:10 000), 室温孵育1 h, TBST清洗3次, 每次5 min, 使用化学发光的方法显影, 曝光时间1 s^[14-15]。

1.2.5 Ptp蛋白纯化

将pSVT7PTP-BL21(DE3)按照最优的发酵条件进行诱导表达, 5 500 r/min收集菌体, 加入与培养基等体积的上样缓冲液(20 mmol/L NaH₂PO₄·2H₂O、50 mmol/L NaCl, pH = 8.0)重悬。冰上预冷后进行超声破碎, 破碎时间25 min, 8 800 r/min离心收集上清。将上清用0.22 μm针头式滤器进行过滤, 作为待纯化的样品。实验采用AKTA-purifier蛋白纯化仪进行纯化, 将滤出液经过Ni agarose蛋白纯化柱进行亲和层析, 使用上样缓冲液平衡5CV以洗去未结合的杂蛋白质, 再用洗脱缓冲液(20 mmol/L NaH₂PO₄·2H₂O, 50 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑, pH8.0)洗脱, 收集洗脱峰。将收集的蛋白质进行SDS-PAGE检测。将最优条件下发酵纯化的Ptp分装保存于-80℃^[16]。

1.2.6 蛋白磷酸酶Ptp酶活验证

磷酸化多肽为底物, 在蛋白金属磷酸酶(PMP)缓冲液。添加1 mmol/L MnCl₂, 反应缓冲液, 30℃温育30 min, 反应体系如表 3, ELISA检测反应产物, 反应液包板4℃过夜, 使用1%BSA的PBST室温封闭1 h, PBST洗板5遍, 孵育相对应的磷酸化抗体, 室温2 h, PBST洗板5次, 室温孵育HRP标记的兔抗二抗1 h, PBST洗板5遍, 加入TMB室温20 min, 1 mol/L硫酸终止反应, 多功能酶标仪检测结果。

1.2.7 Mxr1磷酸化检测

YPD过夜活化, OD=0.5转接BMMY和BMGY, 24 h, 按照1.2.3的方法取样, 统一OD₆₀₀=4收集菌体, 提取蛋白, 经过Bradford法蛋白质定量, 之后进行SDS-PAGE电泳后, 使用电转仪将蛋白转移至PVDF膜上, TBST清洗3次, 每次5 min。使用1%的BSA封闭1 h, P215磷酸化抗体(1:2 000), 4℃孵育过夜(14 h), TBST清洗3次, 每次5 min, 室温孵育HRP标记的兔抗二抗1 h使用化学发光的方法显影, 曝光时间1 min。

2 结果 2.1 Ptp与Mxr1相互作用

为了寻找与Mxr1相互作用的蛋白, 我们将Mxr1前400氨基酸与GST标签蛋白, 表达纯化, 将靶蛋白- GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上, 用分别在甲醇和甘油培养的GS115蛋白溶液过柱, 可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳, 切胶, 经过质谱分析, 得到其中一个蛋白为Ptp(图 1)。

2.2 验证Ptp功能

为验证Ptp的去磷酸化功能, 在大肠杆菌表达, 诱导表达纯化脱盐后, 经BCA法测得蛋白浓度是0.98 mg/L, 以不同浓度pNPP为底物, 相同体积酶反应30℃, 10 min, 1 mol/L硫酸钠终止反应, 405 nm测吸光强度, 测得Ptp米氏常数K_m= 2.023 mmol/L, 最适酶促反应温度40℃, 最适pH4.5(图 2)。

通过ELISA检测酶促反应结束后底物剩余量, 将酶促反应的底物包板, 每孔包被5 mg磷酸化抗原多肽, 或非磷酸化抗原多肽, 孵育磷酸化抗体(稀释比例是1:2 000;1:4 000;1:8 000), 通过加入纯化的Ptp蛋白和只加入蛋白洗脱液对比(图 2-E), 同样的反应条件, 发现加入Ptp的样品几乎没有磷酸化抗原多肽剩余。说明纯化出的Ptp蛋白有去磷酸化的蛋白活性。

2.3 Mxr1磷酸化情况

按照1.2.4的方法取样, 收集菌体, 统一OD₆₀₀=4收集菌体, 提取蛋白, 经过BCA法蛋白质定量, 之后进行总蛋白SDS-PAGE电泳后, 使用电转仪将蛋白转移至PVDF膜上, 孵育P215磷酸化抗体(1:2000)使用化学发光的方法显影, 如图 3野生型GS115在甘油培养基里没有发生磷酸化, 在甲醇培养基里发生磷酸化, 而Ptp高表达无论在甘油还是甲醇培养基都不发生磷酸化。

2.4 Mxr1定点突变和敲除在甲醇培养基中对与甲醇代谢相关基因的调控

敲除Mxr1后在BMMY培养基中Aox1几乎不转录, 与甲醇代谢相关的酶的转录水平严重下降, 将磷酸化位点定点突变后, 与甲醇代谢相关酶的基因表达量也有所下降, 说明Mxr1的磷酸化修饰调控下游基因的表达, 尤其是与甲醇代谢相关的基因的表达(图 4)。

3 讨论

Aox1启动子受甲醇诱导, 但是其诱导机制到目前为止还没有完全揭示清楚, 而Mxr1是毕赤酵母Aox1启动子的必要转录激活因子, 为了研究甲醇的激活机理, 先研究Mxr1激活机理, 通过PULL-DOWN发现与Mxr1相互作用的磷酸水解酶Ptp, 并对Ptp进行了高表达和敲除, 发现在甲醇培养基中, 高表达菌株Mxr1磷酸化程度远远高于敲除菌株。说明Ptp调控Mxr1磷酸化修饰。

本实验用Mxr1特定位点磷酸化多肽作为底物, 发现Ptp识别Mxr1S215位丝氨酸位点的磷酸化, 并将该位点磷酸基团去除。将Mxr1S215位丝氨酸突变成丙氨酸后, 通过荧光定量PCR检测Mxr1野生型, 敲除, 定点突变菌株的下游基因表达量, 发现与甲醇代谢相关的基因转录水平发生了改变, 其中Aox1、Aox2、Das1、Das2定点突变菌株转录量相对于野生型的下降接近60%。以上说明Mxr1 S215位磷酸化修饰, 影响与甲醇代谢相关基因的转录水平。蛋白的磷酸化修饰与蛋白的结构, 亚细胞定位, 功能息息相关^[17-18]。Mxr1磷酸化修饰对其蛋白活性的影有可能是通过影响Mxr1空间结构, 进而影响Mxr1蛋白活性。

在酿酒酵母中, Ptp作为一个高度保守的小分子蛋白磷酸酶, 在AMPK途径发挥重要作用^[12], 根据小分子磷酸酶的特性推测其底物有可能不止Mxr1一个, 需要通过PULL-DOWN找与Ptp相互作用的蛋白。寻找在甲醇代谢通路中Ptp底物, 从这些底物磷酸化修饰入手, 揭示甲醇诱导代谢途径所在的细胞信号通路。需要进一步验证Mxr1第215位丝氨酸磷酸化与其亚细胞定位是否相关, Mxr1磷酸化修饰是否控制Mxr1进出细胞核, 还是调控Mxr1的活性, 同时寻找Mxr1其他磷酸化位点, 进而揭示Mxr1激活Aox1转录的分子机理, 以及甲醇诱导Aox1转录机理。最终减少甲醇的用量, 提高利用Aox1启动子表达外源蛋白生产工艺的优化及表达量。

4 结论

本研究发现与Mxr1相互作用的磷酸酶Ptp, 验证Ptp的功能是去除Mxr1S215位丝氨酸位点的磷酸基团。将Mxr1S215位丝氨酸突变成丙氨酸后, 发现Aox1、Aox2、Das1、Das2定点突变菌株转录量相对于野生型的下降约60%。以上说明Mxr1 S215位磷酸化修饰, 影响与甲醇代谢相关基因的转录。