荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens，Pf）是一种革兰氏阴性可动杆菌，广泛分布于土壤、水等自然环境中^[1]；其最适生长温度和最适生长pH分别为4-32℃和4-8，具有广泛适应性、营养多样性和代谢复杂性的特点^[2]。一方面，Pf是生防菌株的重要一员并参与生物降解与工业生物转化^[3]，其产生的丰富次级代谢产物，如2，4-二乙酰基间三苯酚、吩嗪和藤黄绿菌素等^[4-5]，及多样的代谢机制已被广泛研究。另一方面，Pf对环境中多种有害化合物的响应机制也备受关注，尤其是多样的抗生素抗性基因，很可能成为基因水平转移的储库^[6-7]。

研究表明，Pf对多种抗生素的耐受性常由外排系统介导。外排泵是一种膜转运蛋白，广泛存在于许多微生物基因组中，它不仅参与正常物质运输和代谢，还能转运抗生素、重金属、有机溶剂、去污剂等毒性分子，调节微生物对不同环境的适应能力^[8]。EmhABC是荧光假单胞菌2P24中最主要的RND（Resistance nodulation division）家族外排泵，其基因缺失菌株对氨苄西林、卡那霉素、庆大霉素等多种毒物的耐受性大幅下降^[9]，可见EmhABC能够显著影响细菌对外界有毒物质的抵抗能力，但目前对EmhABC的调控机制并不清楚。本研究中，我们鉴定了荧光假单胞菌2P24中一个新的OmpR家族转录因子RstA，证实RstA能够直接调控外排泵基因emhABC的表达并影响细菌多重耐药性。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒

野生型荧光假单胞菌2P24菌株由中国农业大学张立群教授惠赠；大肠杆菌DH5α、Wm3064及BL31（DE3）感受态细胞购自美国Novagen；表达载体pET28b、敲除载体pK18mobsacB及报告基因载体pRG970由本实验室保存；本研究中所使用的引物见表 1。

1.1.2 试剂与仪器

细菌基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，Taq MIX购自北京佳兰生物科技有限公司，T4连接酶、限制性内切酶NdeI和XhoI、定量PCR相关制品购自大连宝生物工程有限公司，氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、洛美沙星、氨苄霉素、四环素、强力霉素、IPTG购自百灵威科技有限公司，美罗培南、BSA购自索来宝生物，o-nitrophenol、咪唑购自美国Sigma-Aldrich。DU530 UV/Vis分光光度计购自美国Beckman Coulter，NanoDrop2000购自美国Thermo Fisher，凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.2 方法 1.2.1 共适应性分析

Cofitness Browser Database（http://fit.genomics.lbl.gov/cgi-bin/myFrontPage.cgi）由美国加州大学伯克利分校研究组建立，通过构建随机转座子插入突变体库并联合全基因组测序（Random Bar Code Transposon-site Sequencing，RB-TnSeq），评估了32株来自不同种属菌株突变体对多种生长环境的适应度。每个菌株内都涉及上千种基因缺失突变；生长条件设置包括94种碳源、45种氮源及34-55种抗生素或金属离子。具体评估过程如下：将某菌种所有转座子突变株的混合体在某一生长条件下培养4-8代后，采用DNA Barcode Sequencing技术对比所有突变体培养前后各自标记基因的丰度，并以培养前后该基因突变体丰度比值的对数表征菌株适应度（Strain fitness）；基因适应度Gene fitness为不同菌株适应度的加权平均值，并通过计算t值评估每个基因的菌株适应度值的一致性（|t| < 4时无参考意义），即：

在Cofitness Database中，参数Fitness即指上文中的Gene fitness，Fitness < 0表示某基因对某特定生长条件的适应很重要，Fitness > 0则表示某基因对增殖有害，突变体具有生长优势。一般当Fitness < -2或 > 2时表示对生长影响明显。而数据库中的Cofitness值则指同一细菌中一对基因的所有适应度值具有Pearson相关性，即具有相似的适应度模式。通常，Cofitness值> 0.75，提示两基因可能在相同的通路中发挥作用；Cofitness值> 0.6，且它们的直系同源物Cofitness值也 > 0.6，即保守共适应性（Conserved Cofitness），则亦证实紧密功能关系^[10-11]。本研究中分别BLAST EmhA、EmhB、EmhC蛋白序列后分析其共适应蛋白及共适应条件。荧光假单胞菌2P24基因组数据取自NCBI，同源序列比对采用软件MEGA7.0完成。

1.2.2 rstA基因缺失菌株的构建

本研究中采用两步同源重组法构建基因缺失菌株^[9]，即以荧光假单胞菌2P24基因组为模板，分别用引物rstAkoU-F/rstAkoU-R和rstAkoD-F/rstAkoD-R扩增出rstA上下游同源臂，并利用重叠延伸PCR技术融合^[12]，随后采用同源重组的方法将该片段构入pK18mobsacB质粒。重组质粒先转化入大肠杆菌Wm3064感受态细胞，过夜培养后经接合转入荧光假单胞菌2P24中，经Kan、Amp各50 µg/mL的双抗King’s B（KB）培养基^[13]（蛋白胨20 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，K₂HPO₄ 1.97 g/L，丙三醇10 mL/L）28℃过夜培养后，筛选出载体rstA删除序列与基因组序列发生第一次同源重组成功的菌株并采用引物RstA-F/RstA-R加以验证，随后该菌株于无抗KB培养基28℃培养8 h后利用10%蔗糖无抗KB平板筛选，获得第二次同源重组成功的菌株，经引物RstA-F/RstA-R验证得到rstA基因缺失菌株。

1.2.3 抗生素最小抑制浓度测定

将荧光假单胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1:100接种至新鲜KB无抗培养基，28℃过夜培养后测定OD₆₀₀，以1 OD₆₀₀ ≈ 10⁹ CFU/mL计数并稀释。准备无菌96孔板，采用2倍稀释法准备不同浓度的抗生素培养基，取100 μL分别加入96孔板第1至第12孔，之后于每孔中加入100 μL稀释后菌液，确保每孔约10⁴-10⁵个细胞，每种抗生素设置三次平行试验，每板设置一个阴性对照组，即以双蒸水代替抗生素，其余操作步骤均相同。将平板置于28℃摇床培养16-18 h后用酶标仪测定每孔的吸光值OD₅₇₀，获得抗生素对细菌的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）^[14]。

1.2.4 emhA及emhC转录水平检测

荧光假单胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1:100接种至新鲜无抗KB培养基，于28℃摇至OD₆₀₀ = 0.3。按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，确定RNA浓度及纯度后按反转录试剂盒说明获得cDNA并于-20℃保存。设计靶基因emhA（引物AQ-F/ AQ-R）、emhC（引物CQ-F/CQ-R）及参照基因16S rRNA（引物16s-F/16s-R）的qRT-PCR引物，以cDNA为模板，采用Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒完成qRT-PCR。最后以ΔΔC_T法进行目的基因表达量分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶实验

在pRG970半乳糖苷酶表达基因上游融合emhABC基因的调控序列（引物emhAlacZr-F/ emhAlacZr-R）^[15]，将构建的pRG970-pemhABC报告质粒经供体菌（大肠杆菌WM3064感受态细胞）接合转入荧光假单胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株。上述质粒转入成功的菌株以1:100接种至新鲜无抗KB培养基，28℃培养至OD₆₀₀ = 0.6后检测β-半乳糖苷酶活性^[16]。

1.2.6 rstA基因的克隆

以荧光假单胞菌2P24基因组为模板，采用引物RstA-F/RstA-R扩增出rstA全基因序列，将该扩增产物与表达载体pET28b分别使用限制性内切酶NdeI和XhoI进行同步双酶切，凝胶回收后T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α，挑选双酶切验证成功的重组表达载体pET28b-rstA送至金唯智测序。

1.2.7 RstA蛋白的表达与纯化

将重组质粒转化到表达宿主BL21（DE3），并转接于50 mL含Kan（50 µg/mL）的LB液体培养基中37℃过夜培养。过夜培养物按1:50转接到1 L含Kan（50 µg/mL）的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，16℃诱导表达20 h后通过离心收集菌体（8000×g，10 min），而后用30 mL悬浮液（20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬菌体并超声破碎，经4℃，12 000×g，30 min离心得上清液并采用Ni-NTA亲和柱纯化目标蛋白，挂载的His-RstA蛋白由洗脱液（20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脱后采用超滤法进行溶液置换，使咪唑浓度低于5 mM，最终将蛋白浓度浓缩至4 mg/mL冻存于-80℃待用。

1.2.8 凝胶阻滞实验

利用引物FAM-emhAp-F/FAM-emhAp-R扩增emhA基因启动子区域，并用NanoDrop2000测定其浓度，将纯化后的DNA片段（0.225 pmol/L）与不同浓度纯化后的His-RstA蛋白在EMSA结合缓冲液中混合，反应的体系为20 μL，于常温下孵育30 min后加入5 μL上样缓冲液，通过6%的非变性PAGE电泳检测结合活性^[17]。

2 结果 2.1 转录因子RstA与外排泵EmhABC共适应性分析

采用Cofitness Browser Database数据平台对Em-hABC的共适应蛋白进行预测分析。分别对荧光假单胞菌外排泵EmhABC不同组件EmhA、EmhB、Em-hC在该数据库中BLAST后，选择匹配度高且注释显示同为RND外排泵家族的Pf6N2E2_2823（98.1% identity）、Pf6N2E2_2824（98.9%）、Pf6N2E2_2825（99.4%）作为emhABC的功能同源蛋白^[11]（表 2），分别预测其共适应蛋白后结果显示：Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825三者之间互为最强共适应关系，Cofitness值及Conserved值均大于0.9；同时，三者共适应物列表中均可见Pf6N2E2_463（注释为转录因子蛋白RstA），共适应强度排名分别为9^#、9^#、11^#（图 1-A），Cofitness值分别为0.5、0.53、0.53，且Conserved值均大于0.6。同时在Pf6N2E2_463共适应物列表中Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825分别位于列表的11^#、7^#、8^#位，Cofitness值及Conserved值同上。对比Pf6N2E2_463与Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825在多种生长条件的适应度（Fitness）数据，发现它们的基因缺失突变株对多种有害物质胁迫环境的适应度下降，其中夫西地酸、四环素、洛美沙星、壮观霉素及氯霉素等是它们有着共同适应度改变的胁迫条件，Fitness值均在-1 - -6之间（图 1-B）。

2.2 荧光假单胞菌中rstA同源序列比对

以荧光假单胞菌2P24基因组为检索对象，将Pf6N2E2_463基因序列BLAST后得到序列C0J56_12295，经序列比对明确C0J56_12295（rstA）是Pf6N2E2_463在荧光假单胞菌2P24中的同源序列，序列匹配度（Identity）大于90%。rstA编码序列全长702 bp，编码多肽含有233个氨基酸。RstA蛋白预测分子量为26.30 kD，理论等电点为5.53。

2.3 rstA基因缺失菌株的鉴定

经编码框内删除的方式构建rstA基因缺失菌株（ΔrstA），框内删除后剩余序列约250 bp。如图 2（左）示单交换菌落筛选结果，即相比野生型荧光假单胞菌2P24菌株，以引物RstA-F/RstA-R扩增后分别在700 bp和250 bp显示条带，说明pK18mobsacB载体上包含的rstA编码框内删除后序列已同荧光假单胞菌2P24基因组发生第一次同源重组。随后，经10%蔗糖固体培养基筛选后得到发生第二次同源重组的菌株，如图 2（右）示双交换菌落筛选结果，即由引物RstA-F/RstA-R扩增得到两种长度的单一片段，其中若第二次同源重组后回复为野生型菌株，则条带位于700 bp；若位于250 bp附近，则表明rstA编码框内删除后序列已在基因组水平完全取代原序列，ΔrstA菌株构建成功。

2.4 RstA直接影响荧光假单胞菌多重耐药性

抗生素最小抑制浓度（MIC）测定显示，相较于荧光假单胞菌2P24野生型菌株，ΔrstA菌株对多种抗生素敏感性增加，其中氯霉素、卡那霉素及庆大霉素对ΔrstA的MIC值均降低4倍，强力霉素降低8倍；而氨苄霉素、四环素、洛美沙星和美罗培南对ΔrstA的MIC值下降不显著，降低2倍或不变（表 3）。可见RstA能够直接影响荧光假单胞菌2P24对多种抗生素胁迫环境的耐受。

2.5 RstA正向调节emhABC的表达

ΔrstA菌株中emhA与emhC基因的mRNA水平较野生型下降超过3倍（图 3）；同样，β-半乳糖苷酶报告基因实验也显示，ΔrstA菌株中β-半乳糖苷酶的活性较野生型下降3倍（图 4）。该结果表明RstA对emhABC有正向调控作用。

2.6 RstA蛋白的表达与纯化

构建pET28b-rstA重组质粒并转化至表达宿主菌BL21中，经IPTG诱导，如图 5可见27 kD处有一明显条带，说明目标蛋白His-RstA已成功表达。经固定金属离子亲和色谱的方法对His标签蛋白纯化后得到如图所示高纯度His-RstA蛋白。

2.7 凝胶阻滞实验

凝胶阻滞实验结果（图 6）显示：随着RstA蛋白浓度的升高，emhABC基因上游调控区内长度为0.225 pmol/L DNA片段的迁移速率逐渐降低，当蛋白质终浓度达到4 μmol/L时，反应体系中大部分DNA的迁移被阻滞，表明RstA能够特异性地结合在emhABC启动子区域。

3 讨论

荧光假单胞菌2P24最早分离自山东省小麦根际周围的土壤中^[18]，目前大多研究主要针对其次级代谢产物2，4-二乙酰基间三苯酚的产生与调节^{[16, 19]}、群体感应效应对其在植物根际定植的影响^[20]、抗生素合成调节^[21]及三型分泌系统结构功能^[22]等方面展开。EmhABC是目前报道荧光假单胞菌2P24中最重要的RND家族外排泵，张立群课题组研究发现，EmhABC不仅参与调控次级代谢产物2，4-二乙酰基间三苯酚的产生，还显著影响细菌对多种毒性小分子的耐受性^[9]。为了进一步明确荧光假单胞菌2P24对该重要外排泵的调控机制，我们借助Cofitness Browser数据库及序列比对，发现OmpR家族转录因子RstA同EmhABC存在共适应性，二者对多种抗生素胁迫环境的适应贡献相似。因此，我们推测RstA很可能同EmhABC位于同一调控通路。为了证实这一猜想，我们首先构建了rstA基因缺失菌株，明确RstA直接影响荧光假单胞菌2P24对多种抗生素的耐药性。之后，通过对emhA、emhC转录水平及emhABC表达水平的检测，证实RstA能够正向调控emhABC的表达，这也同共适应性预测结果及抗生素敏感性测定实验的结果相一致。

OmpR家族成员均为DNA结合蛋白，属于翼状螺旋转录因子，其蛋白折叠模式很保守，即包含有与DNA大沟相互作用的识别螺旋，及与DNA小沟接触的侧环或“侧翼”，常结合于靶基因启动子区域发挥转录调控作用^[23]。OmpR家族成员几乎均为双组分系统中的反应调节蛋白（Response regulator，RR）组分，常与同源的组氨酸激酶蛋白（Histidine kinase，HK）组分一起参与微生物对外界环境的感受和应答^[24]。RR常经磷酸化后发生构象改变而获得功能活性，并进一步发挥调控作用^[25]。据报道，OmpR家族RR常通过发生二聚体化结合在DNA启动子区的串联重复序列，进而发挥转录激活或抑制功能^[26]。

根据NCBI中的功能预测注释，RstA属于RR，为了进一步明确RstA对emhABC的调控机制，我们表达纯化出RstA蛋白，并通过凝胶阻滞实验证实RstA能够特异性地结合在emhABC上游启动子区域，表明RstA能够直接与emhABC启动子区发生相互作用，但其中更为深入的作用机制，如二者的互作位点、RstA同源HK在其中扮演的角色及RstA的效应模式是否符合OmpR家族RR的常规工作模式等仍需深入研究。当然，RstA是否还参与调控其他生理功能也需要进一步探索。观察ΔrstA与ΔemhABC相较于野生型对各抗生素的敏感性变化不难发现，二者的抗性变化谱存在一定差异，因此我们推断RstA很可能还通过调控其他外排泵影响细菌的多重耐药性。

4 结论

本研究以荧光假单胞菌2P24为研究对象，发现了一个新的OmpR家族转录因子RstA并对其进行功能鉴定。结果表明，RstA通过结合在emhABC上游启动子区域正向调控emhABC的表达，并可能经多个途径影响荧光假单胞菌2P24的多重耐药性。