2. 中国科学院大学，北京 100049;
3. 中国科学院南海生态环境工程创新研究院，广州 510301;
4. 广州市白云联佳精细化工厂，广州 510412
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049;
3. Institute of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301;
4. Guangzhou Baiyun Lianjia Fine Chemical Plant, Guangzhou 510412
真眼点藻属（Eustigmatos）藻类可以积累超过干重60%的储藏性油脂和长链二十碳五烯酸（C20:5，EPA）等多不饱和脂肪酸，受到国内外科学家的广泛关注。真眼点藻发现之初被划分在黄藻纲，20世纪70年代，Hibberd和Leedale将其分出并设立独立的真眼点藻纲（Eustigmatophyceae），目前已发现14个属、超过30多个种[1-3]。目前发现的真眼点藻属均为淡水种，尚未见适应高盐海水的报道。
本课题组于2017年在宁夏固原市罗洼乡一处荒漠表层基质中分离纯化获得一株真眼点藻类似藻株，经18S RNA序列分析和形态鉴定，发现该藻株与波氏真眼点藻（E. polyphem）具有非常高的相似性，该藻可在的高盐海水中适应生长，其中15‰为最适盐度（结果另行发表）。
研究表明，不同真眼点藻在营养需求、生长情况、油脂积累和脂肪酸组成方面存在较大差异，在众多影响微藻生长和脂类积累的因素中，氮元素的影响最为明显，利用氮限制方式培养微藻，也常常被用来评价微藻油脂的生产能力[4]。氮源和氮浓度对真眼点藻生理生化的影响，国内已开展大量的研究工作。苏怡等[5]对8株真眼点藻纲微藻的生长和油脂积累进行了研究，结果表明，不同硝酸钠浓度对8株微藻的油脂含量的影响极为明显，8株微藻均在3 mmol/L氮浓度条件下油脂含量达到最高，其中魏氏真眼点藻油脂积累量约为60%干重（Dry weight，DW）。周芷薇等研究表明，斧形魏氏藻和点状魏氏藻在硝酸钠浓度为3.6 mmol/L条件下，两种微藻的油脂含量分别为56.4% DW和64.7% DW[6]。何思思等[7]对一株魏氏真眼点藻的研究表明，该株在低氮（3 mmol/L）条件下总脂含量高达60.81%，明显高于其在高氮组（17.6 mmol/L）的总脂含量。
本论文以获得的适应高盐的真眼点藻SCSIO-45821藻株为实验材料，通过研究其在不同氮源和氮浓度条件下的生长及油脂积累情况，对该藻株的应用潜力进行初步评估。设置硝酸钠（NaNO3）、尿素（Urea）、碳酸氢铵（NH4HCO3）三种氮源，每种氮源设置高、中、低三种氮浓度（3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L），跟踪测定藻细胞生长、总脂含量、脂类及脂肪酸组成，并计算总脂产量和EPA产量，研究结果为该真眼点藻SCSIO-45821的开发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 藻种本实验研究的藻株采自宁夏固原市罗洼乡，利用多次平板涂布法获得该藻的纯培养藻株，再将藻株进行海水驯化，保藏于中国科学院南海海洋研究所海藻资源与生物技术实验室，藻种编号为SCSIO-45821。
1.1.2 培养条件微藻培养于光径为3.0 cm、长度为60 cm、有效培养体积为320 mL的柱式光生物反应器中，培养温度为25±1℃，荧光灯提供单侧光源，培养光强为300 μmol·photons/m2 s，连续鼓入二氧化碳加富的压缩空气提供碳源和搅拌（CO2:Air，1:99）。所用培养基为15‰海水BG-11，用15‰海水按改良的BG-11培养基配方配制而得[8]。
1.2 方法 1.2.1 培养方法在15‰海水BG-11无氮培养基中，分别以硝酸钠、尿素、碳酸氢铵为氮源，每种氮源设置3.5 mmol/L、5.9 mmol/L、17.6 mmol/L三种初始氮浓度（换算成N浓度相同），以光径为3.0 cm的光生物反应器作为培养体系，在温度为25℃，光强为300 μmol·photons/m2 s条件下，采用24小时不间断光照以及连续通入含1%CO2的压缩空气培养，培养时间为14 d，每2 d测定生物质浓度，第0天、第4天、第8天、第12天、第14天离心收取藻泥，冷冻干燥并测定总脂含量及脂肪酸组成。
1.2.2 测序方法和引物序列提取该藻的DNA，采用18S rDNA基因引物，在PCR内扩增后测序，正向引物：CTGGTTGATCCTGCCAGT，反向引物：CACCTACGCAAACCTTGTTACGACTT。
1.2.3 生物质浓度的测定利用干重法进行测定，取一定量的藻液，用预先在80℃烘箱中烘干至恒重的混合纤维滤膜（0.45 μm）进行抽滤，再将有藻细胞的滤膜放置在80℃烘箱烘至恒重，称重，用减差法得到微藻细胞干重。
1.2.4 总脂的测定与分级总脂的提取与含量的测定采取改良的Khozin-Goldberg方法[9]，利用Christie的方法[10]，将总脂分为中性脂、糖脂、磷脂。
1.2.5 脂肪酸的测定称取25 mg冻干藻粉于10 mL玻璃离心管中，加入2 mL 2% H2SO4无水甲醇:甲苯（9:1，V:V），充入氮气后，用80℃水浴搅拌1小时，再依次加入1 mL去离子水和1 mL正己烷，充分震荡后3 500 r/min离心5 min，将上层有机相转移至另一离心管中，氮气吹干，再加入1 mL含有C17标准品的正己烷，并用孔径为0.22 μm的滤膜过滤至1.5 mL的小玻璃瓶中，最后利用气相色谱仪测定脂肪酸。
1.2.6 产量计算总脂产量（g/L）=Mt×Lt，Mt为收藻时微藻的生物质浓度（g/L），Lt为相对应的总脂含量（DW，g/L）。EPA产量（mg/L）=Mt×Ft×1000，Mt为收藻时微藻的生物质浓度（mg/L），Ft为收藻时微藻EPA绝对含量（DW，g/L）。
1.2.7 统计分析本论文中所有图表所示的平均值和标准偏差均由2个生物学重复和3个测定重复计算获得；利用Origin 8.1和Excel对实验数据进行分析（ANOVA）；采用S-N-K方法对不同处理组进行多重比较；用最小显著性差异（LSD）分析样品均值之间的差异，置信度为0.05。
2 结果 2.1 藻株的分子鉴定图该藻生长在海拔高、降水少、风沙大及植被稀少的黄土高原上，为了确定该藻的分类学特征，将其18S rDNA基因序列输入到NCBI数据库进行比对，得到与该藻基因序列相似度最大的藻株分别为波氏真眼点藻（Eustigmatospolyphem CCAP 860/8）和大真眼点藻（Eustigmatosmagnus SAG 2266），根据18S rDNA基因序列构建系统发育进化树。如图 1所示，该藻株命名为真眼点藻SCSIO-45821。
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| 图 1 基于18SrDNA基因序列对该藻构建的进化树 |
如图 2所示，经过0-2 d的生长延滞期，从第2天开始，真眼点藻SCSIO-45821藻细胞在三种不同氮源中均开始迅速增长，第10天后，藻细胞生长变缓，在以尿素为氮源的培养基中，三种不同氮浓度下的藻细胞生物质浓度无明显差异（P > 0.05），至第14天，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三种氮浓度处理组的生物质浓度分别为6.49 g/L、5.39 g/L和5.66 g/L。在以碳酸氢铵为氮源的培养基中，三种不同氮浓度下的藻细胞长势差异明显（P < 0.01），3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三种氮浓度处理组的生物质浓度分别为5.72 g/L、6.48 g/L和7.07 g/L。在以硝酸钠为氮源的培养基中，3.5 mmol/L、5.9 mmol/L和17.6 mmol/L三种氮浓度处理组的生物质浓度分别为6.73 g/L、6.76 g/L和5.93 g/L。由上述分析可知，真眼点藻SCSIO-45821在碳酸氢铵为氮源，浓度为17.6 mmol/L时，取得了高于其他氮源和氮浓度处理组的生物质浓度，为7.07 g/L。
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| （A.尿素；B.碳酸氢铵；C.硝酸钠） 图 2 不同氮源及氮浓度对真眼点藻SCSIO-45821生长的影响 |
对不同氮源及氮浓度条件下藻细胞油脂进行提取和分析发现（图 3），整个培养周期内，真眼点藻SCSIO-45821的总脂含量均呈增加趋势，但不同处理组之间的油脂积累规律存在明显差异。三种氮源3.5 mmol/L组的油脂积累速率均高于5.9 mmol/L组和17.6 mmol/L组（P < 0.01），培养至第14天，尿素组总脂含量最高为63.2% DW，其次为硝酸钠（60.5% DW）和碳酸氢铵（59.9% DW）。17.6 mmol/L条件下，至培养结束均未超过35.0% DW。
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| （A.尿素；B碳酸氢铵；C硝酸钠） 图 3 不同氮源及氮浓度对真眼点藻SCSIO-45821油脂积累的影响 |
按照总脂分级方法，对实验获得的总脂进行分级，结果如图 4所示，随着氮浓度的降低及培养时间的延长，真眼点藻SCSIO-45821的中性脂比例也随之增加。培养至第14天，三种氮源条件下，3.5 mmol/L处理组的中性脂比例显著高于17.6 mmol/L处理组，然而与5.9 mmol/L处理组相比无明显差异（P > 0.05），尿素、碳酸氢铵和硝酸钠在3.5 mmol/L条件下的中性脂比例分别为79.0% TL（Total lipid）、77.0% TL和75.7% TL，而它们在17.6 mmol/L条件下的中性脂比例均未超过70% TL。
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| （A.尿素；B.碳酸氢铵；C.硝酸钠；a. 3.5 mmol/L；b. 5.9 mmol/L；c. 17.6 mmol/L） 图 4 不同氮源及氮浓度对真眼点藻SCSIO-45821总脂组分的影响 |
真眼点藻SCSIO-45821脂肪酸组成显示，该藻的脂肪酸主要包括：C14:0（豆蔻酸）和C16:0（棕榈酸）两种饱和脂肪酸，C16:1（棕榈油酸）和C18:1（油酸）两种单不饱和脂肪酸以及C18:2（亚油酸）、C20:4（Arachidonic acid，AA）和C20:5（eicosapentaenoic acid，EPA）三种多不饱和脂肪酸，其中C16:1的含量远高于其他脂肪酸。在三种不同的氮源组分中，随着氮浓度的升高，真眼点藻SCSIO-45821细胞中C14:0、C16:1和C18:1的百分含量下降，C16:0、C18:2、C20:4和C20:5（EPA）的含量上升（表 1），在以硝酸钠为氮源的处理组中，17.6 mmol/L条件下C20:5（EPA）的百分含量最高，为7.18% TFA（Total fatty acid），尿素氮源次之（6.20% TFA），最小为碳酸氢钠（4.82% TFA）。
培养至14 d，真眼点藻SCSIO-45821总脂和EPA产量如表 2所示，该藻株在低氮组和高氮组中的总脂产量差异明显（P < 0.01）。随着氮浓度的升高，该藻的总脂产量降低，低氮条件下总脂产量最高。在低氮条件下，以尿素为氮源的培养基中的该藻油脂产量最高，为4.18 g/L，在高氮条件下该藻的总脂产量仅有1.64 g/L。本实验结果表明，在3.5 mmol/L条件下，以碳酸氢铵和硝酸钠为氮源培养的该藻总脂产量分别为3.42 g/L和4.07 g/L，可见尿素可作为该藻生产油脂的最佳氮源。EPA的产率随氮浓度的升高而升高，该藻在氮浓度为17.6 mmol/L硝酸钠的培养基中EPA产量最高，为85.71 mg/L。
氮源是微藻生长所必需的营养元素之一[11-12]，本研究结果显示，在以碳酸氢铵为氮源的实验组中，真眼点藻SCSIO-45821在17.6 mmol/L处理组中的生物质浓度高于其在3.5 mmol/L和5.9 mmol/L处理组中的生物质浓度，与已有实验结果相符[13]。而在以尿素和硝酸钠为氮源的实验组中，SCSIO-45821藻株的生长随着浓度的降低而得以显著提高，3.5 mmol/L最低浓度组远高于高浓度17.6 mmol/L处理组，这一现象较为罕见，造成这一现象的深层机制还有待进一步考究。
3.2 不同氮源及浓度对真眼点藻SCSIO-45821总脂及脂肪酸积累的影响低氮胁迫可诱导该藻积累油脂，本实验结果显示，三种氮源中3.5 mmol/L组的油脂积累量均高于5.9 mmol/L组和17.6 mmol/L组。有报道指出，在氮饥饿（3.5 mmol/L和5.9 mmol/L）条件下，藻细胞因缺少氮元素而抑制蛋白质合成，从而使微藻细胞内的碳流向油脂转化，而在高氮（17.6 mmol/L）条件下，微藻细胞可以正常分裂，细胞内碳流向蛋白质积累转化，油脂含量降低[14]。本实验设置的三种氮源中，低氮组的油脂含量均显著高于高氮组，这一结果与已有的文献报道结果一致[15-16]。而由于低氮组细胞生长均高于高氮组，该藻株在硝酸钠和尿素为氮源低氮组培养中，其油脂产量均显著高于碳酸氢铵组的最大油脂产量，其中低浓度尿素更为适宜油脂生产。目前已知的大多数微藻在低氮条件下大幅提高油脂含量，但同时也显著抑制生长，导致油脂产量不高甚至降低，因此，这一现象对微藻油脂的高效积累具有重要意义，具有进一步探索的价值。
本研究还发现，三种氮源中，随着氮浓度的升高，SCSIO-45821藻株EPA含量也随之升高，在以硝酸钠为氮源的处理组中，17.6 mmol/L条件下C20:5（EPA）的百分含量最高，为7.18% TFA，在3.5 mmol/L条件下EPA百分含量仅为1.79%（表 1）。有文献报道，真眼点藻的EPA存在于细胞膜脂上[17-18]，低氮条件下，中性脂含量均大幅提高，膜脂降解程度高，因此高氮条件下会获得更高的EPA含量，本研究结果表明，高浓度的硝酸钠条件更宜于SCSIO-45821藻株的EPA积累。
3.3 真眼点藻SCSIO-45821的耐高盐性及潜在价值SCSIO-45821藻株细胞内含有豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸以及二十碳五烯酸（EPA）等7种脂肪酸，其中棕榈油酸的含量最高，占总脂肪酸的50%以上，该藻株脂肪酸组成与类波氏真眼点藻基本一致[19]。在低氮条件下，该藻株的油脂产率高、中性脂比例高，流动性好，在食用油脂及生物能源行业具有极大的开发前景。而其EPA产量随着氮浓度的升高呈上升趋势，最高含量达1.59%（占干重），最高产量达到85.71 mg/L。EPA具有很好的保健功能[20]，降低人患心脑血管疾病的风险以及抗癌抗肿瘤等作用[21-22]。此外，棕榈油酸占该藻总脂肪酸的50%以上，棕榈油酸具有抗炎，改善皮肤色泽和缓解肥胖症等作用[23-24]，因此，该藻在医药保健品及化妆品行业具有极大的开发应用价值。
随着我国耕地资源和淡水资源的日益紧缺，利用海水以及滩涂、盐碱地建立微藻规模化养殖技术具有重要意义。SCSIO-4582藻株具有良好的耐高盐性，在15%-20‰的海水中能够正常生长，可望作为海水新资源藻种，开发前景广阔。
4 结论低氮（3.5 mmol/L）胁迫真眼点藻SCSIO-45821积累油脂，以尿素为氮源更有利于该藻积累油脂；高氮（17.6 mmol/L）有利于诱导真眼点藻SCSIO-45821的EPA的积累，并且以硝酸钠为氮源可获得较高产量的EPA，运用不同的氮浓度可诱导真眼点藻SCSIO-45821积累不同的高值化产品，因此，该藻具有极大开发应用潜力。
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