中华鳖生长性状受肌肉发育等诸多遗传和环境因素的影响。生长性状的遗传力低，传统杂交改良周期长，寻找控制中华鳖生长性状的主效基因及其遗传标记，使用标记辅助选择加快选育进程，这对提高中华鳖生长性状具有重要意义。研究发现，MSTN基因对中华鳖肌肉生长具有调控作用^[1]，随着高通量测序技术的发展，新的生长性状候选基因不断被挖掘，如GRBP2基因和THSP基因^[2]。同时，仍然有较多报道从基因功能来推测基因可能影响生长性状，通过扩增多态位点进行关联分析来证明SNP与生长性状的关系，如IGF2基因^[3]和GHRL基因^[4]。这些研究使得生长性状可利用的标记不断增加。

MyoD1（Myogenic differentiation 1）是生肌调节因子家族（MRFs）的重要成员，在肌形成早期阶段参与决定肌形成的发生^[5-6]。该基因与肌肉基因启动子的特异性区域（E-BOX）相结合后激活肌肉特异性转录，促进肌前体细胞的增殖和分化，可使成纤维细胞及脂肪细胞等转化为成肌细胞，并最终分化为成熟肌纤维^[7]。目前，在金头鲷（Sparus aurata）^[8]、鳕（Gadus macrocephalus）^[9]、文昌鱼（Branchiostoma belcheri）^[10]、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）^[11]、鳜鱼（Siniperca chuatsi）^[12]和长丝裂腹鱼（Schizothorax dolichonema）^[13]等水产动物已完成MyoD基因的克隆、序列分析和表达等研究。鉴于MyoD1基因是影响动物生长性状的重要候选基因，且中华鳖MyoD1基因多态性与生长性状的相关研究尚未见报道，本研究通过直接测序法检测MyoD1基因多态位点，以期获得与中华鳖生长相关的SNP，为中华鳖分子标记辅助选育奠定工作基础。

1 材料与方法 1.1 材料

本实验中华鳖取自安徽省农业科学院水产研究所稻田养鳖基地，随机选择同批繁殖、同块稻田养殖的2冬龄健康中华鳖共178只（其中雄性135只，雌性43只）。测量样本体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、裙边后侧宽和体高7项生长指标。同时剪取200 mg左右的裙边组织，按照天根生化科技（北京）有限公司试剂盒说明书提取中华鳖组织DNA，使用琼脂糖和紫外分光光度计测定DNA质量和浓度，-20℃保存。2×Taq PCR master mix和DNA分子量标准购自宝生物（大连）工程有限公司；引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；琼脂糖为Sigma公司（美国）产品。

1.2 方法 1.2.1 MyoD1基因的扩增及突变位点基因分型

根据NCBI数据库中登录的中华鳖MyoD1基因序列（GenBank登录号：NW_005858157.1）设计4对引物（表 1），以中华鳖基因组DNA为模板，采用PCR技术分别扩增MyoD1基因的各个片段。PCR扩增反应总体积为20.0 μL，PCR反应体系包括10.0 μL 2×Taq PCR master mix、上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL、模板DNA 0.5 μL，加dd H₂O至20.0 μL。PCR反应程序：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。将PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物纯化后送至生工生物工程有限公司测序。测序结果用BioEdit软件进行序列比对分析，获得SNP位点。

1.2.2 构建连锁图谱

利用Haploview软件进行SNP位点间连锁分析。

1.2.3 数据统计分析

利用Picalc程序包计算各位点的多态信息含量（PIC），利用Popgene 32软件计算观测杂合度（H_o）、期望杂合度（H_e）、有效等位基因数（N_e）和哈温平衡常数。采用SPSS 20软件的GLM程序对MyoD1基因SNP与生长性状的进行关联分析，因变量为中华鳖7项生长指标，自变量为筛选到的突变位点不同基因型。其生物统计模型为：Y_ij=μ+G_i+S_j+e_ij，式中，Y_ij表示某性状第i个标记在第j个个体上的观测值，μ表示试验观测的所有个体平均值，G_i表示第i个标记的基因型效应，S_j表示第i个标记的性别效应，e_ij表示对应个体观测值的随机残差效应。

2 结果 2.1 MyoD1基因突变位点筛选

通过序列比对，MyoD1基因有6个碱基位置发生突变，其中2个突变发生在启动子区域（T-49G和A-38G），2个突变发生在内含子1（C91T和A187T），1个位点突变发生在外显子2（C880T），还有1个突变发生在外显子2下游区域（T1522A）。其中，C880T位点为错义突变，导致所编码的氨基酸由丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V），核酸位置以所参考序列的第一个碱基为参考值1。等位基因频率和基因型频率，见表 2。

2.2 MyoD1基因突变位点在中华鳖群体中的遗传结构分析

对178只中华鳖MyoD1基因的6个SNP位点进行分型，统计其遗传参数（表 2）。结果表明，多态信息含量（PIC）为0.168 9-0.373 0，期望杂合度（H_e）为0.186 8-0.497 4，有效等位基因数（N_e）为1.228 9-1.984 0，PIC和H_e多数处于0.25-0.50之间（除C880T位点），说明多数SNP位点具有中度多态性。经卡方适合性检验，MyoD1基因除A187T位点外，其余5个位点在中华鳖群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P > 0.05）。

2.3 MyoD1基因SNP位点间的连锁分析

利用Haploview软件对中华鳖群体的MyoD1基因的6个SNP位点进行连锁分析，并且构建连锁图谱，结果如图 1可以看出，6个SNPs之间r²均没有大于或等于0.8，说明中华鳖群体连锁不紧密，没有形成连锁区块，故按照单标记分析进行突变位点与生长性状的关联分析。

2.4 MyoD1基因突变位点与生长性状的关联分析

采用一般线性模型分析中华鳖MyoD1基因6个多态位点不同基因型与生长性状的相关性（表 4）。T-49G位点不同基因型个体间的背甲宽存在显著差异（P < 0.05），突变型（GG）显著大于野生型（TT），为优势基因型；A-38G位点不同基因型个体间的背甲宽存在显著差异（P < 0.05），突变型（AG）显著大于野生型（AA），为优势基因型；A187T位点不同基因型个体间的体高存在显著差异（P < 0.05），突变型（TT）显著大于野生型（AA），为优势基因型；T1522A位点不同基因型个体间的体质量存在显著差异（P < 0.05），突变型（AA）显著大于野生型（TT）和杂合型（TA），为优势基因型。

3 讨论

基因组中的SNPs多数位于非编码区域，因受到选择压力较小容易积累变异，而外显子变异率仅为周围序列的1/5^[14-16]。本研究中，MyoD1基因在中华鳖群体中共检测到6个SNP位点，其中T-49G和A-38G位点位于基因启动子区域，C91T和A187T位点位于基因内含子1，C880T位于基因外显子2，T1522A位于基因外显子2下游区域。虽然基因非编码区的突变位点不参与氨基酸编码，但会改变基因表达效率进而影响机体的生命活动^[17-19]。C880T位点仅存在CC和CT基因型，可能是实验群体经多代选育，人工选择使部分等位基因频率发生改变，需扩大样本群体做进一步研究。

生肌调节因子家族由MyoD、Myf5、MyoG和MrF4 4个成员组成，在肌肉生成、肌原纤维蛋白合成及肌纤维数量调节等方面起到重要作用，其中，MyoD基因在骨骼肌发育过程起关键的正向调控作用，促进骨骼肌的形成和分化^[20-21]。研究表明，MyoD基因突变体会引起斑马鱼胚胎期体节肌肉减少^[22]。MyoD基因多态性与生长性能的关联研究在水产动物中报道不多。于凌云等^[23]在获取大口黑鲈MyoD基因序列后筛选出7个与生长性状相关联的突变位点；陈松波等^[24]在牙鲆MyoD基因内含子1上发现2个SNP对体重、体长和体高等生长性状影响显著；Chen等^[25]分析了MyoD1a基因和MyoD1b基因在虹鳟群体的多态性，发现多个突变位点对肉质性状有显著影响；陈静等^[26]在草鱼MyoD基因内含子1上发现SNP在体质量、体宽、体高和眼间距等生长性状存在显著差异。

在本研究中MyoD1基因多态性位点与中华鳖生长性状的相关分析结果表明，基因启动子区域T-49G位点的不同基因型在背甲宽存在显著差异（P < 0.05），GG基因型显著大于TT基因型；基因启动子区域A-38G位点的不同基因型在背甲宽存在显著差异（P < 0.05），AG基因型显著大于AA基因型；内含子1 A187T位点的不同基因型在体高存在显著差异（P < 0.05），TT基因型均显著大于AA基因型，体重、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、裙边后侧宽虽无显著差异，但TT基因型也均大于AA和AT基因型。外显子2下游区域T1522 A位点的不同基因型在体质量存在显著差异（P < 0.05），AA基因型显著大于TT和TA基因型。因此，MyoD1基因可作为研究中华鳖生长性状的候选基因，下一步工作要增加关联的样本数，着重分析T-49G、A-38G、A187T和T1522A位点的影响效用，进一步筛选出中华鳖分子标记辅助选育的有效标记。

4 结论

本研究在中华鳖MyoD1基因上鉴定出6个SNP位点（T-49G、A-38G、C91T、A187T、C880T和T1522A），其中C880T位于外显子上，属于错义突变。除A187T位点外，其余5个位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg定律。分析各位点与中华鳖生长性状之间的相关性发现，T-49G位点GG基因型个体的背甲宽显著大于TT基因型，A-38G位点AG基因型个体的背甲宽显著大于AA基因型，A187T位点TT基因型个体的体高显著大于AA基因型，T1522A位点AA基因型个体的体质量显著大于TT、TA基因型，其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。