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范磊, 戴冬洋, 熊安平, 盛云燕, 于明珠, 秦瑛聪
分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株
生物技术通报, 2019, 35(4): 195-200

FAN Lei, DAI Dong-yang, XIONG An-ping, SHENG Yun-yan, YU Ming-zhu, QIN Ying-cong
Molecular Marker-assisted Selection in Melon Sex Expression
Biotechnology Bulletin, 2019, 35(4): 195-200

文章历史

收稿日期:2018-10-18

分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株
范磊1, 戴冬洋1,2, 熊安平1, 盛云燕1, 于明珠1, 秦瑛聪1     
1. 黑龙江八一农垦大学农学院,大庆 163319;
2. 石河子大学农学院,石河子 832003
摘要:运用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型,为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。根据已发表的甜瓜CmACS-7(A基因)与WIP1+Gyno-hAT(G基因)基因结构设计PCR引物,对47个重组自交系群体家系及14份甜瓜材料进行检测验证。引物CmACS-7扩增产物在383 bp进行酶切,基因型为AA不能被酶切,扩增产物均被酶切的为基因型aa,酶切位点可分辨共显性基因型;针对WIP1+Gyno-hAT基因结构设计2对引物同时扩增,扩增条带197 bp和184 bp区别G(g)基因基因型。利用自主设计的引物可用于甜瓜苗期筛选雌雄异花同株、全雌系、雄全同株和完全花植株的分子标记辅助选择育种。
关键词甜瓜    性别基因    分子标记辅助选择    
Molecular Marker-assisted Selection in Melon Sex Expression
FAN Lei1, DAI Dong-yang1,2, XIONG An-ping1, SHENG Yun-yan1, YU Ming-zhu1, QIN Ying-cong1     
1. College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319;
2. College of Agronomy, Shihezi University, Shihezi 832003
Abstract: The objective of this study is to identify the sex type of melon via using A and G genes, and to provide a method for molecular marker-assisted breeding of other traits in melon. Based on the structures of the published CmACS-7(A)gene and WIP1+Gyno-hAT(G)gene in melon, PCR primers were designed, by which the detection of 47 recombinant inbred lines families and 14 melon materials was verified. Results indicated that PCR products from primer CmACS-7 was enzymatically digested at 383 bp, those with the genotype AA was not able to be digested by enzyme, and those digested by enzyme were in genotype aa, moreover, endonuclease locus discernible co-dominant genotype. Two primers were designed based on WIP1+Gyno-hAT gene structure, G(g)genotype was distinguished between 197 and 184 bp of the amplified bands. In conclusion, the self-designed primers can be used in the molecular marker-assisted selection breeding of monoecious, gynoecious, pure male line, and complete-flower melon at seedling stage.
Key words: melon    sex expression    marker-assisted selection    

甜瓜(Cucuumis melo L.)是葫芦科重要的经济作物之一,性别分化类型丰富,主要受两个基因控制——A基因和G基因[1, 2]。G基因(WIP1)抑制心皮发育导致雄花发育。研究表明,CmACS7在甜瓜完全花早期发育过程中引起雄蕊退化,产生雌雄异花同株和全雌系[2]。其中全雌系植株的产生是由于一个hAT转录因子家族的插入而引起的[1]。甜瓜性别分化是甜瓜单性材料育种的重要理论依据,而甜瓜单性花育种是培育新品种的重要目标之一。但是,通过传统表型选择方法筛选单性甜瓜材料,不仅要求丰富的经验而且耗费大量的人力、物力,而且甜瓜性别分化容易受多条件限制,培育优良单性品种需花费7-8年甚至十几年时间。因此,提高选择的效率和减少育种过程中的盲目性是育种工作的关键。

分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)可以从分子水平快速准确地分析个体的遗传组成。前人甜瓜QTL主效基因的定位和克隆进行了较多的研究[5-8],但是应用到分子标记辅助选择育种过程中的标记较少。甜瓜性别分子标记研究较多[9-12],主要集中在控制雄全同株Cm-Acs-7(A基因)基因位点,张乔玲等[10]甜瓜纯合单性花材料与两性花材料在CmACS-7(A)基因缺失位点开发出了InDel-1标记,用于甜瓜性别早期选择。李凤梅等[11]建立了甜瓜单性花Cm-ACS7分子标记体系。前期研究主要集中在单性花基因Cm-ACS7上,对于共同筛选A、G基因的报道相对较少。

本研究利用已经克隆的甜瓜2个性别基因,设计分子标记,在苗期,利用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型,可以大大缩短选择育种的年限,加速分子聚合育种的进程,为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。

1 材料与方法 1.1 材料

甜瓜母本为WI998,厚皮网纹甜瓜,全雌系;父本为TopMark,厚皮网纹甜瓜,雄全同株,二者均来源于美国威斯康星大学瓜类遗传育种研究室。以单粒传的方式获得F8重组自交系群体,选择47个家系(以WT命名,按照顺序编号,每个家系种植12个单株)用于分子标记辅助选择,同时选择14份甜瓜材料为验证材料(表 1)。

表 1 供试甜瓜材料
1.2 方法 1.2.1 分子标记

选择甜瓜两片真叶展开时的新鲜叶片组织,利用CTAB法提取DNA,DNA浓度为15-50 ng/L。根据NCBI genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的甜瓜A基因(CmACS-7,ID:103492295)和G基因(WIP1+Gyno-hAT,ID:103491671)序列设计引物,CmACS-7转化Caps标记,命名为Cmacs7,引物序列为F:5' -CAGTGGC-ACCAGCAGTTA-3' ;R:5' -GGAAAGCGTATGATGA-AG-3' ,利用AluⅠ对其产物进行酶切。G基因位点设计2个引物,区分是否含有Gyno-hAT插入位点的引物Cmhat:F:5' -ATGGCAGACAGATTGTTATTAG-TG-3' ;R:5' -GAGTAGAAGGTACTCCAAATGAAT-GGC-3' ;区分G(g)位点杂合与纯合性引物Cms,F:5' -CGGTTCGGTCCAGTAACATT-3' ;R:5' -AGGGGGAAGAAAAAGGGATT-3' 。

PCR反应体系采用10×扩增缓冲液1 μL(MgCl2+)、dNTPs(1 mmol/L)0.2 μL、引物(5 pmol/L)2 μL、模板DNA(15-20 ng/μL)1 μL、Taq DNA聚合酶(1 U/μL)0.1 μL,ddH2O补至10 μL。

PCR扩增程序为94℃ 30 s;94℃ 30 s,50-68℃ 30 s,72℃ 40 s,25个循环;72℃ 5 min。扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,拍照。Cmacs-7扩增产物在37℃下酶切3 h。

1.2.2 田间性状调查

2013年、2014年及2018年分别种植验证材料及重组自交系群体,调查单株开花类型,记录植株性别:雌雄异花同株(雄花和雌花)、完全花植株(只着生完全花)、全雌株(只着生雌花)和雄全同株(雄花和完全花);2013年及2014年调查甜瓜重组自交系群体家系每个单株主蔓30节前所有雌花、雄花及完全花的开花率,验证性别表现;2018年调查植株开花类型;对DNA分子标记检测结果进行验证。

2 结果 2.1 CmACS-7基因位点检测结果分析

利用CmACS-7标记对亲本、重组自交系群体及验证材料进行分析,所有供试材料在383 bp产生一个位点,经ALUⅠ酶切3 h后,酶切产物分为3种类型(图 1)。当PCR产物在383 bp被全部酶切,该位点所显示基因型为aa;当PCR产物不能被酶切时,该位点代表AA基因型,当酶切位点和PCR产物位点均有扩增条带时,代表基因型为Aa,呈杂合状态。

图 1 甜瓜CmACS-7扩增产物检测 A:甜瓜CmACS-7扩增产物;B:CmACS7 PCR产物酶切结果。M:marker;1:No.3-2-2(AAGG);2:TopMark(aaGG);3:WI998(AAgg);4:WI846(aaGG);5:7223H(aagg);6:No.3-2-2×TopMark-F1(AaGG);7:WI998×TopMark-F1(aaGG);8:WI998×No.3-2-2-F1(AAGg);9:ms5(aaGG);10:ms2(aaGG);11:1284(aaGG);12:1244(aaGG);13:绿皮甜瓜(aaGG);14:白皮甜瓜(aaGG);15:WT9(AAGG);16:WT31(aaGG);17:WT57(aagg);18:WT47(AAgg)。下同
2.2 重组自交系群体G基因位点的检测

利用NCBI公布的Gyno-hat序列与WIP1序列,设计2对引物,以期区分纯合位点与杂合位点,基因结构示意图与引物设计原则如图 2所示。由于插入3 kb GYno-hat序列,Cmhat引物扩增条带过大无法检测到,因此当Cmhat引物产生扩增条带(197 bp)时,说明该材料基因型为G,而该位点无产物则基因型为g;在gyno-hat共有序列WIP1连接处设计引物Cms,扩增产物在184 bp有条带时说明该位点为g,如果无扩增产物则为G。利用2对基因共同扩增待测DNA,即可检测G基因位点基因型。

图 2 CmhatCms标记检测G位点结果
2.3 分子标记检测的准确性

对甜瓜重组自交系群体的47个家系、3个F1及14个纯合品系进行分子标记的检测(表 2)。No.3-2-2和WI846为雌雄异花同株,与3年的田间鉴定结果相吻合,而且基因型纯合。WI998为全雌系,TopMark为雄全同株,与3年的田间检测结果吻合,基因型纯合。3个杂交组合F1代,分子检测结果和田间观察结果相同,基因型为杂合型。

表 2 甜瓜重组自交系群体植株与验证植株性别表达田间鉴定

对研究材料开展田间表型鉴定,以单株开花雌花、雄花及完全花的比率确定性别类型,61份材料中,59份材料基因型和表现型结果相互吻合,WT7-2为全雌株(表 2)。2013年田间检测为全雌株,2014年和2018年田间检测为雌雄异花同株;WT113基因型鉴定为雄全同株,2013年表型鉴定为雄全同株,2014年和2018年鉴定为雌雄异花同株;田间检测47个甜瓜重组自交系中19个家系为雌雄异花同株,4个家系为全雌株,24个家系雄全同株,1个家系株完全花株。分子标记选择效率为96.3%。结果表明,通过这两个分子标记能够分别鉴定基因纯合型和杂合型,并且能较为准确地鉴定甜瓜性别类型。

3 讨论

DNA分子标记辅助选择是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标进行间接的选择,基因克隆技术和分子生物技术的飞速发展,使目的性状的选择越来越准确。通过分子标记的早期选择可以克服隐性基因识别难度的问题,并且能够区别基因纯合型及杂合型,从而提高育种效率,加速育种进程[13-15]。通常情况下,分子标记辅助选择是根据QTL找到与其紧密连锁的分子标记,通过标记进行筛选,瓜类作物一些重要的性状主效QTL的已经被报道[5, 16],这些瓜类性状紧密连锁的标记可直接用于分子标记辅助选择。但是分子生物信息学研究发现,即使与性状连锁距离小于1 cm,在连锁区域包含很多候选基因,而基因间的互作可能影响对目标性状鉴定的准确性。因此,通过获得目的基因序列,设计引物,能够更加直接有效地鉴定目的性状。

甜瓜性别基因的研究始终绕着甜瓜性别表达、甜瓜性别基因定位展开,直到2008年甜瓜性别基因A基因和G基因的克隆才为甜瓜性别类型的选择提供了重要的理论依据[1-2]。本研究根据已经克隆的A基因和G基因,设计引物,目的在于不仅能够鉴定甜瓜性别,而且还能区分基因纯合型及杂合型,可以直接用于甜瓜育种工作。本研究表明分子标记能够成功地鉴定甜瓜性别类型,而且杂合基因型也能够准确地鉴定。本研究中WT7-2和WT113基因型鉴定分别为全雌株和雄全同株,由于甜瓜的性别表现受到环境因素等多方面的影响,而且部分雌雄异花同株植株在花芽类型的开放顺序也不尽相同(有的早期大量开放雌花,后期开放雄花;有的早期大量开放雄花,后期开雌花),可能是造成田间性状统计结果不同的原因之一。

此外,本研究种植每个家系12个单株,统计平均值作为田间调查的依据对研究结果也存在一定影响。WT113分子基因型鉴定为雄全同株,2013年田间鉴定结果与分子鉴定结果相同,但是2014年和2018年田间表现均为雌雄异花同株,除了受到环境条件的影响之外,花器官发育相关基因的表达差异也是影响甜瓜性别表达的因素之一。研究者曾经对甜瓜不同性别转录组分析,挖掘甜瓜性别相关差异基因的研究中发现,花粉不育基因在雄全同株和雌雄异花同株中差异表达,WT113田间性状的变化及与分子鉴定结果的不同,也可能是通过环境变化诱导差异基因表达,形成不同植株类型。

4 结论

利用已发表的甜瓜性别基因序列设计分子标记,在甜瓜苗期鉴定雄全同株、全雌株、雌雄异花同株及完全花株,并且能够区分鉴定基因杂合型位点。

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