2. 国家城市供水水质监测网重庆监测站，重庆 400060
2. Chongqing Monitoring Station, Water Quality Monitoring Network of National Urban Water Supply, Chongqing 400060
近年来，内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals，EDCs)环境问题引起全球范围的密切关注和重视，是国际环境科学领域研究的前沿和热点课题之一，美国、欧盟、日本、世界卫生组织(WHO)、联合国环境规划署(UNEP)、经济合作与发展组织(OCED)等国家和组织已制定管理法规和管控措施，中国也在《水污染防治行动计划》(国发[2015]17号)中提出严格控制环境激素类化学品污染并评估风险，实施管控措施[1-3]。类固醇雌激素(Steroid estrogens，SEs)可分为天然和人工合成两大类，是雌情活性最强、最受关注的一类EDCs，在环境中被广泛检测出，主要来源于城市污水处理厂和集约化畜禽养殖场[4-7]。环境中极其微量的SEs便可强烈干扰人类和动物的内分泌系统，导致发育、生殖、神经、免疫等问题[1]，长期暴露于高浓度SEs环境中还会导致鱼类雌性化、雌雄同体、植物生长损伤、微生物功能及群落多样性变化等问题[8-9]，而且不同SEs间存在着复合毒性协同效应，造成的危害更大[10]。酶具有催化效率高、活化能低、反应条件温和、环境友好等特点，被誉为“绿色催化剂”，在SEs的去除中起到重要作用并广受关注[11-17]。本文总结了环境中酶对自由及结合态SEs的去除作用及其反应机理，阐明不同形态SEs的主要酶降解、转化路径，并对酶在环境中SEs去除的应用进行了展望，以期对环境中两种形态雌激素的酶降解转化的研究提供理论借鉴。
1 环境中降解转化SEs酶的基本性质环境中天然SEs可分为自由态(Free estrogens，FEs)和结合态(Conjugated estrogen，CEs)，其结构示意如图 1所示。天然SEs降解、转化过程常用的酶主要分为两大类:(1)氧化还原酶类(Oxidoreductases)，通过催化氧化FEs形成聚合产物，如过氧化物酶(Peroxidases，PODs，EC 1.11.1.X)和漆酶(Laccase，Lac，EC 1.10.3.2)[18-21]；(2)水解酶类(Hydrolases)，通过解离结合基团将CEs水解为相对应的FEs，如芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase，ArySTS，EC 3.1.6.1)和β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUSB，EC 3.2.1.31)[22-25]。典型SEs降解、转化酶的物理化学性质及三维结构，见表 1和图 2。除以上几种酶外，还有一些细菌产生的酶对SEs具有降解、转化作用，如亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)可产生单加氧酶(Monooxygenase)、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)及不动杆菌属(Acinetobacter sp.)可产生双加氧酶(Dioxygenase)、红球菌属(Rhodococcus sp.)及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)可产生单加氧酶、双加氧酶、羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSD)等[26-27]。
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| 图 1 天然SEs结构示意图 |
FEs主要包括雌酮(Estrone，E1)、17α-雌二醇(17α-Estradiol，17α-E2)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，17β-E2)、雌三醇(Estriol，E3)。氧化还原酶去除FEs的主要作用机制为氧化耦合反应，催化FEs A环酚羟基形成高氧化潜能、高活性的C2、C4位自由基与C3位苯氧自由基等自由基中间体(图 3)，通过C-O-C、C-C共价键自耦合、相互耦合形成二聚体，同时受到溶剂类型、pH、A环取代位置等影响[14, 18, 21, 31-32]。FEs A环C3位氧原子的电荷密度较高而自旋密度较低，因此与C-O-C键相比，在动力学上更有利于形成C-C键聚合产物[33]。二聚体可继续形成自由基，作为酶的底物继续氧化耦合生成三聚体、低聚体，甚至高聚体，但聚合物的溶解度随相对分子质量增加急剧降低，难以进一步耦合形成高分子量的聚合物[32, 34]。氧化还原酶催化FEs生成的聚合产物溶解度较低，在污水处理过程中易于通过吸附、过滤、沉淀等作用被去除。氧化还原酶的催化能力通常与氧化还原电位(表 1)和糖基化程度相关，高氧化还原电位有利于酶对SEs的催化氧化，在一定范围内，酶的稳定性随糖基化程度的增加而提高，其中LiP的糖基化程度较高，为20%-30%，高于HRP(18%-22%)、Lac(10%-20%)和MnP(5%-15%)[35-36]。PODs和Lac催化机理的主要区别在于电子受体，通常PODs以H2O2作为电子受体催化其活性，同时还需要辅酶因子的参与，而Lac以空气或水中的氧分子作为电子受体，不需额外添加氧化剂[17, 34, 37-39]。FEs在Lac催化体系中的去除速率低于PODs，但PODs不稳定，在复杂基质及过量H2O2条件下易于失活，而Lac的稳定性更强[34]。另外，与A环C3位相结合的CEs(如E1-3S、17β-E2-3S、E1-3G、17β-E2-3G)受到硫酸盐或葡糖苷酸盐基团的保护，不易被氧化还原酶催化氧化形成自由基[22]。不同基质中氧化还原酶对FEs的去除效率如表 2所示。
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| 图 3 自由及结合态SEs的酶降解、转化路径图 |
PODs在自然界中分布广泛，可由动植物、真菌、细菌产生，根据是否含血红素分为血红素(Heme-peroxidases)及非血红素过氧化物酶(Non-heme peroxidases)[51-52]。在FEs的催化氧化中应用较多的PODs主要为血红素过氧化物酶，包括两大类:(1)真菌分泌的胞外木质素降解酶(Lignin modifying enzymes，LMEs)，如LiP、MnP、VP。(2)植物产生的HRP[51]。PODs的催化机理为:血红素蛋白被H2O2或小分子过氧化物氧化为化合物Ⅰ(卟啉π阳离子自由基氧铁基团，FeⅣ=O·+)，随后化合物Ⅰ从底物得到一个电子还原为化合物Ⅱ(氧铁基团，FeⅣ=O)，再氧化底物得到一个电子将酶还原为基态FeⅢ，其中最后一步为限速步骤[13, 53]，FEs被催化氧化生成自由基后通过耦合反应生成聚合产物。
2.1.1 木质素降解酶LiP在酸性条件下催化去除FEs效果较好，Wang等[41]实验结果表明，在pH3，0.2 mol/L H2O2条件下，120 U/L LiP对2.7 mg/L E1和17β-E2的去除率为60%-90%。Mao等[19]实验表明在pH4.6，0.05 mmol/L H2O2条件下，2.5 mg/L 17β-E2可被20 U/L LiP完全去除，主要产物为17β-E2低聚物，少量转化为中间产物E1。藜芦醇作为白腐真菌(White-rot fungi，WRF)的次生代谢产物以及与LiP共生的活性底物，具有较强的氧化能力，在LiP催化FEs过程中可被氧化成阳离子自由基，保护LiP避免失活并增强其活性，且对失活的LiP有一定的恢复作用[19, 32, 40]。无藜芦醇时，初始浓度为5 mg/L的17β-E2反应60 min后去除率仅为40%，而添加藜芦醇能够提高LiP对FEs的催化去除效率，反应20 min便能将5 mg/L 17β-E2完全去除[19]。
MnP是一类以多种形式存在的糖基化血红素过氧化物酶，其结合位点的结构与其他PODs有所不同，通过将Mn2+氧化为Mn3+完成催化氧化[54]。Tamagawa等[44]试验结果表明，经600 U/L MnP处理1 h后，0.01 mmol/L E1被完全去除，2 h后雌激素活性得以完全去除。
VP是一种混合酶，结合了LiP和MnP两种酶的底物特异性，在H2O2、Mn2+以及底物的共同作用下，将Mn2+氧化为Mn3+，催化氧化FEs形成聚合产物[21]。Eibes等[42]考察了VP对E1和17β-E2的去除，结果表明在低酶活性(10 U/L)条件下，反应25 min内两种化合物能够被完全去除。Taboada-Puig等[21, 43]实验结果表明，在最优条件下，VP可去除污水中高浓度(1.3-8.8 mg/L)及环境浓度(1.2-6.1 μg/L)的E1和17β-E2，并形成二聚体、三聚体和羟基雌酮(Hydroxyestrone，OH-E1)等产物。
2.1.2 辣根过氧化物酶HRP是一种含铁卟啉辅基的PODs，含有两个不同的金属中心:血红素和两个钙原子，主要由植物分泌，在辣根(Horseradish)中含量最高，并因此而得名[35, 55]。Auriol等[18, 56]研究发现在pH为7，温度为25℃条件下，被H2O2激活后，32 U/L HRP在1 h内可去除人工污水中97%的100 ng/L E1、17β-E2或E3，反应5 h后去除率为99%；但在实际污水中，去除相同浓度的FEs需添加8 000-10 000 U/L HRP，说明复杂污水基质成分使得HRP氧化能力受到抑制，从而显著影响了FEs的氧化去除。
值得注意的是，H2O2作为PODs的电子受体，同时又是这几种酶的抑制剂，过量H2O2会使反应过程中过渡态化合物形成无反应活性的化合物Ⅲ(铁超氧化物，FeⅢ=O2·-)，称之为“自杀性失活”(Suicide inactivation)[13, 57]。而作为一种混合酶，VP的“自杀性失活”更加复杂，由于其存在3个氧化位点及多个催化产物，对H2O2浓度最敏感[57]。有研究表明，添加稳定剂可保护酶活性避免失活，如聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)、聚乙烯(Polythene，PE)、明胶(Gelatin)、多糖(Polysaccharide)等[13, 36]。
2.2 漆酶的催化氧化作用Lac是一类多酚氧化酶，自然界中Lac可由高等植物、昆虫、细菌、真菌产生，其中真菌漆酶(Fungal Laccase)的底物特异性低，氧化能力强，应用最为广泛[14, 37, 51-52]。Lac催化活性中心通常含有4个铜离子，三环的铜簇位点以空气或水中的氧分子作为电子受体，形成自由基后，T1铜中心参与FEs单电子氧化，将O2还原为水，生成C-O-C、C-C聚合产物[11, 55, 58]。FEs在A环C3位含有酚羟基，能够被Lac催化产生苯氧自由基，通过氧化耦合反应形成二聚体、三聚体，有研究表明Lac还可将17β-E2氧化为E1[20, 39, 50, 59]，而与之相反，Singh等[48]在反应产物中未检测出E1和E3。
Lloret等[39]研究发现，在水相反应体系中，pH4时Lac的酶活性最高，但稳定性较低，而其酶活性在pH7时较低，但稳定性高，同时可观察到反应初期Lac在pH4时有显著失活，而在pH7条件下，6 h内酶活性较稳定。Singh等[55]实验研究表明，在2 500 U/L Lac条件下，在水相体系中反应5 h后0.2 mg/L 17β-E2去除率为93%，而在土壤中去除率为87.1%。土壤含水率对Lac处理效果也有影响，经24 h 10 U/g Lac处理后，非饱和土壤中0.2 mg/g 17β-E2去除率仅为32.1%，而在饱和土壤中去除率达到62.6%，这可能由于Lac酶分子在水相中有利于与17β-E2接触，从而去除效果增强[48]。在pH为7，温度为25℃条件下，20 000 U/L Lac在1 h内可完全去除人工及实际污水中100 ng/L E1、17β-E2或E3，实验结果表明其催化FEs耦合反应受污水基质成分的影响较小[46]。有研究表明在相同浓度下，Lac催化氧化E1的反应速率仅为17β-E2的60%，其区别在于二者在C17位与Lac的亲和性[22]。Lac的稳定性在水相和土壤体系中有较大差异，虽然在水相(0.46 h-1)中其失活速率比在土壤(0.003 1 h-1)中快很多，但水相中Lac对17β-E2的去除速率比在土壤中高100多倍[48]，Lac在土壤中的活性持续时间较长、稳定性强的特点弥补了其反应速率慢的缺点。
漆酶介导反应体系(Laccase mediator system，LMS)指Lac在介体和氧分子存在时进行催化氧化的反应体系，介体的氧化还原电位较高，可分为天然及人工合成介体，如紫脲酸(Violuric acid，VA)、丁香醛(Syringaldehyde，SA)、1-羟基苯并三氮唑(1-hydroxy-benzotriazole，HBT)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2，2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfnoic acid)，ABTS)等[45-46, 60-62]。介体在酶和目标化合物间起到“电子穿梭”的作用，作用机制主要包括氢自由基转移、电子转移以及离子氧化，添加介体可提高FEs的氧化程度，从而增强Lac催化去除FEs反应[17, 61, 63]。Auriol等[46]实验结果表明，当Lac酶活性低于20 000 U/L时添加HBT可提高17β-E2的去除效率，而当酶活性高于20 000 U/L时，两种条件下17β-E2的去除率没有明显差异。Sei等[64]实验结果表明，在无介体条件下，300 U/L Lac反应6-12 h后可完全去除20 mg/L 17β-E2和E3，24 h后E1的去除率为90%，添加介体ABTS或HBT后E1仅在3 h内可被Lac完全去除。Lloret等[62]实验表明，不添加介体条件下，经Lac处理24 h后17β-E2得以完全去除，而E1不易去除，在Lac-VA、Lac-HBT和Lac-SA体系中E1的去除率分别为100%、88%和74%。在以后的研究中，应探索成本低、性质稳定、毒性低及水溶性好的介体。
2.3 有机质对氧化还原酶催化FEs的影响土壤与水体环境中富含有机质，有研究表明高浓度有机质可显著降低FEs的酶催化去除速率，这是由于有机质含有大量酚类官能团，形成自由基后可与FEs及其自由基相互耦合，形成交叉耦合化合物，从而抑制FEs自耦合产物的形成[33-34, 65-66]。Mao等[32]试验证实，藜芦醇对LiP催化能力的增强会受到有机质的抑制。当有机质和藜芦醇同时存在时，二者在LiP表面活性位点产生竞争，导致17β-E2的去除率有所降低，这是由于有机质和17β-E2的交叉耦合反应抑制了藜芦醇对LiP去除17β-E2的增强作用[23, 40]。Huang等[65]研究了有机质对HRP去除17β-E2的影响，发现有机质不仅抑制17β-E2的去除，还会影响17β-E2氧化自耦合产物二聚体、三聚体的形成。Sun等[66]研究发现有机质可与Lac表面活性位点竞争或与17β-E2结合，从而抑制17β-E2的酶催化氧化去除，且其抑制率随有机质浓度增加而升高，有机质浓度为50 mg/L时，Lac对17β-E2的去除率不足5%。夏青[55]通过试验研究表明，有机质对HRP去除E1、17β-E2的抑制作用并不明显，去除率仍高于80%，而在Lac催化体系中，有机质对E1、17β-E2的去除有抑制作用，说明有机质对HRP活性的影响较小。
3 水解酶对CEs的降解转化作用FEs羟基可与硫酸盐或葡糖苷酸盐通过酯化作用形成CEs，其中单羟基化合物E1的结合态为单一形式，多羟基化合物E2、E3则可与一个或多个结合基团形成硫酸盐(CSEs)、葡糖苷酸盐(CGEs)、硫酸盐-葡糖苷酸盐(CS-GEs)形式的CEs。与FEs相比，CEs的水溶性、迁移性高，而吸附性较低。研究普遍认为CEs无生物毒性，但其解离后又重新生成雌情活性高的FEs，潜在的生态风险不应被忽视。CEs结合基团的解离主要为ArySTS和GUSB的作用，其活性与温度及微生物丰度密切相关，酶催化条件下CEs的解离在热力学上不可逆[16]。CGEs可被GUSB解离为相对应的FEs，ArySTS通过水解硫酯键将CSEs酶解为其对应的FEs[25, 67]。研究表明，GUSB和ArySTS活性与有机质含量、土壤黏粒显著相关[23, 68-69]。目前有关CEs酶降解、转化的研究多集中在E1及E2的结合态，而有关E3结合态形式酶解的研究相对较少。
3.1 芳基硫酸酯酶的水解作用ArySTS可由微生物、动植物分泌，在污水及活性污泥中活性和含量水平较高[70-71]。土壤中ArySTS主要以吸附态存在于腐殖质、黏土矿物，稳定性增加且不易失活，而很少以游离态形式存在[68]，Bai等[72]研究也表明ArySTS仅在土壤吸附相中保持活性，而在水相中几乎没有活性。水体中ArySTS主要来自底泥微生物的分泌，也可通过径流、合流制污水管网溢流等方式携带产生ArySTS的微生物进入水体[25, 70]。然而，由于环境中ArySTS活性与丰富度水平相对较低，CSEs硫酯键的解离作用通常较弱[73]。Liu等[74]的实验结果表明，在1 mL pH5的缓冲液，55℃条件下，添加50 μL ArySTS反应3 h后，E1-3S和E3-3S的解离效率超过75%，而17β-E2-3S的解离效率低于60%。Bai等[72, 75]实验表明，ArySTS对17β-E2-17S的解离作用仅为A环羟基化作用的1/10，主要产物为OH-17β-E2-17S和diOH-17β-E2-17S。Ma和Yates[76-77]也发现农田土壤、河水及沉积物中17β-E2-3S主要通过C17位羟基的氧化生成初级代谢产物E1-3S，而酶的解离作用次之。另外，氧化还原条件也会影响ArySTS的活性，Zheng等[78]测定了奶牛养殖场污水17α-E2-3S的转化产物，结果表明，在有氧条件下主要通过D环C17位的羟基氧化为酮基，从而生成E1-3S，而在厌氧条件下A环C3位硫酯键的酶解占据主导代谢地位。
值得注意的是，芳基磺基转移酶(Arylsulfotran-sferase，ArySULT，EC 2.8.2.1)与ArySTS的作用则相反，能够将FEs重新转化为CSEs[67]。Goeppert等[67, 79]研究了土壤中17β-E2的转化路径，结果表明17β-E2可先降解为E1，随后在ArySULT的作用下转化为E1-3S。
3.2 β-葡糖苷酸酶的水解作用GUSB属糖苷类水解酶，细菌、真菌及高等动植物均可产生，广泛存在于污水、活性污泥、土壤、沉积物中[23]。在河水及沉积物中，Ma和Yates[76-77]观察到17β-E2-3G主要通过C3位结合基团的解离生成17β-E2，而在农田土壤中主要为C17位羟基氧化作用生成E1-3G，这可能由于土壤中GUSB含量水平不足所致。Kumar等[80]实验结果表明，在河水中反应5 d后，E1-3G完全解离为E1，而仅有64%的17β-E2-3G解离为17β-E2及随后的转化产物E1，这可能由于GUSB对两种CGEs的解离存在差异。
粪大肠菌群，例如埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)可合成GUSB和ArySTS，从蜗牛(Helix pomatia，H.pomatia)中提取的GUSB-ArySTS混合酶也广泛应用于CEs的酶解及检测[71, 74]。E.coli合成的ArySTS较少且活性、亲和性相对较弱，H.pomatia中提取的GUSB-ArySTS混合酶中ArySTS活性也相对较低[23, 81]，因此与CGEs相比，CSEs在环境中的稳定性和持久性更强[80, 82]。Ben等[82]实验表明，10 μmol/U酶抑制剂STX 64和D-葡糖二酸-1，4-内酯可分别有效抑制污水中ArySTS和GUSB活性，从而阻碍CEs的解离。结合基团(硫酸盐或葡糖苷酸盐)及位置(A和/或D环)的差异会影响CEs的酶降解、转化过程。D’Ascenzo等[83]的实验结果表明，A环(E1-3G、17β-E2-3G、E3-3G)CGEs比D环(17β-E2-17G、E3-16G)CGEs易于解离，不过一旦反应启动，一天内均可完全解离为相对应的FEs；而对于CSEs，E1-3S、17β-E2-3S和E3-3S完全解离需6-8 d，说明污水中ArySTS活性相比于GUSB弱得多。Liu等[16]比较了5种CEs的解离速率，并划分为低(E1-3S)、中等(E1-3G、17β-E2-3S和E3-3G)和高(E3-16G)解离速率。Gomes等[84]通过活性污泥批试验表明，CEs(E1-3S、E1-3G和E3-16G)在微生物分泌的酶作用下可解离为FEs，而灭菌条件下未检测到FEs，解离优先顺序为E1-3G＞E3-16G＞E1-3S，其影响因素为:结合基团＞基团位置＞SEs类型。
水解酶通过解离硫酸盐或葡糖苷酸盐结合基团将CEs水解为相对应的FEs，氧化还原酶可催化FEs形成C2、C4位自由基及C3位苯氧自由基中间体，通过C-O-C、C-C共价键自耦合、交叉耦合形成二聚体、三聚体，甚至高聚体。环境中自由及结合态SEs的酶降解、转化路径如图 3所示。
4 展望酶对环境中自由及结合态SEs的去除的应用受到诸多因素限制，对今后酶在SEs降解转化的规模化应用、机理研究、联合应用、固定化酶、酶工程等方面进行了展望。
酶催化去除SEs的研究大多处于小试、中试试验阶段，在污水、污染土壤修复中的应用相对较少[31, 43, 47, 49, 52]，由于理论研究与实际应用存在差异，评估酶在实际应用中的可行性十分重要。污水中各种干扰因素会对酶的催化氧化效果产生影响，如pH、温度、盐度、溶解氧、重金属、抑制物质等[36]。应进一步研究酶处理含SEs污水的工作机理和环境因素的影响，将理论应用于实际工业化处理中。酶膜反应器(Enzymatic membrane reactor，EMR)可应用于污水中有机污染物连续处理[14, 38, 85]，目前已有研究在小试阶段应用EMR处理FEs，去除效率可达到80%-100%[20, 43, 60]，常用的膜材料有醋酸纤维素(Cellulose acetate，CA)、硝酸纤维素(Nitrocellulose，NC)、聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)、聚丙烯腈(Polyacrylonitrile，PAN)、聚醚砜(Poly-ethersulfone，PES)、聚酰胺(Polyamide，PA)等[85]。在规模化应用时，需要解决酶失活以及膜的持续性能问题，同时，EMR在SEs特别是CEs去除方面的应用仍需进一步开发和研究。酶催化应用于SEs污染土壤修复不会产生二次污染，然而不同土壤类型、气候条件、微生物群落等均会对酶修复SEs污染土壤产生影响，实现场地修复仍需要长期系统地研究。
在酶处理SEs过程中伴随着中间产物的产生，且有些产物仍具有雌情活性，而大多数研究没有检测反应后总雌情活性，以及对降解、转化产物进行鉴定。随着高分辨质谱(HRMS)、核磁共振(NMR)等分析检测技术的发展[58, 86]，应在反应中间产物的鉴定，自由基的生成，C-O-C、C-C键聚合产物优先顺序及比例等方面展开研究，进一步阐明SEs的酶催化反应机理，比较不同类型的酶对SEs的去除效率，深入分析SEs的降解、转化产物及路径。
WRF(如Trametes versicolor、Phanerochaete chr-ysosporium)可分泌Lac、LiP、MnP，且不同种类的菌分泌的酶类型存在差异，利用WRF分泌的胞外酶体系催化氧化FEs，可作为规模化应用发展的方向[51, 59]。通常污水、污泥、土壤中存在着多种类型的自由态和结合态SEs，是十分复杂的混合体系，而单一种类的酶很难同时去除不同形态的SEs。在GUSB-Lac联用酶体系处理污水中不同形态SEs(E1、17β-E2、17β-E2-3G)的试验中，Tanaka等[22]发现几种化合物均能够得到有效去除。水解酶与氧化还原酶联用同时处理复杂基质中的FEs和CEs(CSEs和CGEs)，或产生这些酶的微生物的联合使用(如WRF和E.coli)可作为今后研究的重要课题。
溶解态的游离酶在污水中存在易变性失活、易流失、难以回收等问题，从而导致处理成本过高，限制了其大规模应用。酶固定化技术可以提高酶的稳定性，实现重复利用，并在SEs的去除中得以应用[54, 87-89]，主要分为物理法(如吸附)和化学法(如包埋、微胶囊、交联、共价结合)，且各有优缺点，载体材料及固定化技术的选择取决于酶的类型和催化过程[54, 90]。探寻经济、高效、生物相容且环境友好的固定化材料，降低酶活性损失并提高稳定性是未来发展的方向。
自然条件下微生物产生酶的量非常少，提高酶产量和催化效率，降低应用成本等是需要解决的主要难题，可通过酶工程(如纳米酶、修饰酶和超酶)、基因编辑、DNA重组等技术提高酶产量、稳定性及活性、催化效率及降低酶的别构调节[51-52, 91]。
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