发酵食品是指利用微生物加工制造而成的一类具有独特风味与营养价值的食品,分布广泛且制造和食用历史悠久,同时具有丰富的微生物资源,供研究者探索研究[1]。在过去的20年中,新一代测序技术和质量分析仪,以及其他新技术的出现,大大提高了发酵食品的研究进展。高通量测序等方法的频繁应用,为发酵食品微生物群落分析作出了巨大贡献,如干酪、葡萄酒的研究。本文通过宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学对发酵食品的分子机制进行了探讨;着重关注微生物的演替贡献、功能基因及酶资源的挖掘,讨论了现有的局限性,以期对未来食品发酵研究提供相关线索。
1 宏组学技术发酵食品中的微生物是一个复杂系统集合,从这个复杂系统中获取的DNA、RNA、蛋白质和代谢物进行的研究称之为宏组学。进入后基因组学时代,测序技术飞速发展,测序成本明显下降,形成了涵盖宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学在内的宏组学技术,推动了对微生物群落的多样性、结构及潜在基因功能方面的深入研究。
1.1 宏基因组学宏基因组[2],其最初的含义指的是生态环境中全部微生物遗传物质的总和。现在,宏基因组指的是特定环境中细菌和真菌的遗传物质的总和。宏基因组学则是一种不依赖于纯培养的基因组分析手段,它是通过收集环境样品并提取样品中的优质DNA来构建宏基因组文库,通过高通量测序,对测序结果进行数据分析来研究样品中微生物的一种方法。宏基因组学方法包括全宏基因组技术及16S rDNA片段扩增技术,借助高通量测序,打破了传统以培养为主的微生物研究方式,缩短了实验时间,具有高效性、准确性等特点。目前宏基因组学技术正日臻成熟,也形成了比较完善的研究流程,其中DNA测序和数据分析是宏基因组学研究的关键部分。
宏基因组学研究主要分成两个层面,一是分析环境中特定基因,即通过构建宏基因组文库,基于序列筛选或者基于功能筛选分析某种功能基因,并进一步对筛选到的基因进行深度测序;二是针对环境中所有DNA进行深度测序,分析该环境中微生物的组成与相关功能。这两方面的相关分析都依赖于测序的深度和广度。宏基因组测序能够对开菲尔粒中的低丰度物种进行鉴定,表明了其在微生物群落分析中具有更高的分辨率和丰度准确度[3]。借由宏基因组,得以发现大量不可培养的微生物,以及认知更多新的功能基因或新基因簇,极大地增加了人类对微生物群落组成、演替及其互相作用的认识。
1.2 宏转录组学就环境样品微生物研究而言,基因组学的手段无法说明微生物基因的表达量情况,当生境或其他因素变化时,同一微生物个体的基因表达也会由于适应环境出现变化,这时需结合宏转录组学,它将生境中全部RNA作为研究对象,从转录组水平分析样本微生物的组成及活性基因表达情况。宏转录组学是指在某个特定条件或特定时空,群落中所有微生物基因转录本的总和,可用于原位衡量微生物群落宏基因组表达水平,筛选出高表达活性功能基因和微生物[4]。以前主要采用基因芯片或微阵列技术,而随着新一代高通量测序技术的快速发展,生境中的RNA也可以直接利用高通量测序技术进行分析。针对动态表达的基因,宏转录组学在群体RNA逆转录后对cDNA进行测序。揭示了特定生境因素,特定时间下微生物基因表达和调控机制,并且更易发现新的基因,这些基因可在某些特定环境条件下发挥很大作用[5]。
1.3 宏蛋白质组学宏蛋白质组学是在特定时间点对环境微生物群的所有蛋白质的组成进行大规模鉴定。宏蛋白质组技术分析因蛋白质复杂多样的特点,因此对检测技术要求具有高通量、高灵敏度、动态范围广、质量估计精确等特点,而质谱分析法是最合适条件的检测平台。一般而言,宏蛋白质组学依据宏基因组数据,通过质谱技术采集特定环境条件下微生物种群中全部蛋白质信息,探索微生物组成及代谢方式,揭示环境中蛋白质的组成与丰度、蛋白质的不同修饰、蛋白质和蛋白质之间的相互关系,可以认识微生物群落的发展、种内相互关系、营养竞争关系等。宏蛋白质组的研究方法,其流程一般包括蛋白质样品制备、蛋白分离和蛋白鉴定等。研究策略主要有2种,一种采用双向凝胶电泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-D PAGE)结合质谱(Massspectrometry,MS)技术,能对复杂蛋白质混合样品进行定性和定量分析;另一种是多重色谱分离与MS联用技术进行宏蛋白质组分析。目前,宏蛋白质组学研究中常用的研究方法是:2-D PAGE与基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)联用[6]和液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)[7]。特别是新兴起的轨道离子阱(Orbitrap)质谱技术,可利用痕量样品就可以鉴定蛋白质,可以用于环境样品中低丰度的蛋白质分析检测。因此,色谱串联质谱法有望在宏蛋白质组学研究中获得更为广泛的应用[8]。
在近10年中,宏蛋白质组学技术已经应用于多个环境微生物群落的研究中,从活性污泥、土壤到人类肠道微生物群,对微生物生态系统功能产生了许多重要见解[9]。在发酵食品中仍然有一些蛋白质组学和宏蛋白质组学的报告,如在高酸度醋发酵过程中的乳酸菌、醋酸菌、巴氏醋酸杆菌[10]、普洱茶固态发酵及中国白酒类等。宏蛋白质组学仍然是发酵食品中一个很有前景但尚未充分开发的领域。
1.4 代谢组学代谢组学则是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。研究代谢组可以了解生物体的基因型和表型是如何关联的,以及外界环境如何对生物代谢产生影响的。靶向或非靶向代谢组学分析都依赖于代谢物分离、检测、鉴定和定量以及多元数据分析[11]。代谢物的分离与检测是代谢组学研究的关键步骤,目前最常用的代谢组学分析技术是核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)、液相色谱串联质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和气相色谱串联质谱(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),这些分析方法都可以鉴定代谢物的结构和测定分子浓度[12-13]。核磁共振技术样品预处理方法简单,能够快速准确地对样品进行高通量分析。在乳酸菌代谢组学测定分析中应用较为广泛的是GC-MS和LC-MS,这两种技术可以检测包括糖、糖醇、有机酸、氨基酸、脂肪酸及大量次级代谢物在内的数百种化合物[14]。代谢组学能高通量的鉴定和定量代谢物的变化[15]。它已成功应用于各种发酵食品中的代谢物概况,以评估食品质量、可追溯性、真实性和安全性。当与其他宏组学方法相结合时,代谢组学为揭示发酵食品生产的潜在机制提供了重要的见解。
2 宏组学工具在发酵食品微生物群落研究中的应用 2.1 奶酪奶酪也称乳酪或干酪,是动物乳经发酵产生的有机酸或凝乳酶使蛋白质凝固,并经进一步成熟而形成的具有不同风味的乳制品。奶酪微生物群落包括细菌、酵母和霉菌等,它们在蛋白质凝固和独特风味形成过程中发挥着决定性的作用。
美国哈佛大学学者Wolfe[16]对10个国家的137种奶酪表皮群落进行了宏基因组直接测序,揭示了奶酪表皮中广泛分布着24种主要的细菌和真菌。测序样本表明这些奶酪中分布的微生物具有高度可重复性,并将奶酪表皮作为一种模式生态系统,用来研究微生物之间的相互作用和变化机制。微生物宏基因组研究及数据分析很大程度上依赖于参考菌株数据库的丰富度,传统奶酪发酵是一个典型微生物群落作用的结果,然而,目前对奶酪发酵的群落结构、安全性、不同微生物作用等特征的研究还不够成熟,一个重要原因就是参考菌株数据库的缺乏。Almeida等[17]利用测序技术建立了奶酪菌群数据库,对其67个属中137个物种的142株菌株进行了基因组测序,并重构117个基因组。其中包括了目前未在公共数据库中出现的克吕沃氏菌属,藤黄球菌属和海生乳杆菌属等微生物,这对乳制品微生物的群落研究起到了重要作用。用这些乳制品基因组作为参考,观察到传统奶酪中一些微生物最初并没有被接种,如假交替单胞菌,或静止嗜冷杆菌,却是发酵过程中的优势菌种,对奶酪产品的特性起作用。宏基因组学方法应用于墨西哥奶酪Cotija微生物群的分类和功能特性中[18],其中细菌菌群由约98%的厚壁菌门组成,包括3种优势菌属(乳酸杆菌、明串珠菌和魏斯氏菌)以及500多种非优势属,分属细菌和古细菌的31个门。宏基因组数据表明,Cotija菌群具有产生特有风味和香味化合物的代谢潜能,主要参与支链氨基酸和游离脂肪酸代谢。全面解析奶酪样品中微生物群落多样性,比较不同种类奶酪样品微生物群落结构差异,对解析奶酪蛋白质凝固和风味质构形成具有重要的参考价值。同时,也为发掘和分离奶酪中的微生物菌株资源奠定基础。
宏转录组学应用于发酵食品是探索各种微生物在发酵过程中的代谢途径,并揭示其特定功能和对风味的贡献。目前奶酪表皮微生物群落的参考基因组序列较为丰富,为宏转录组分析奶酪成熟过程中表皮微生物群落提供了更大可能性,奶酪持续成为发酵食品微生物研究的热点对象。Monnet等[19]分别在第5、14、19和35 d通过宏转录组学分析了瑞布罗申奶酪(Reblochon)中微生物的活性。另外,宏转录组学也可以揭示高温驱动奶酪成熟过程中微生物群落及其功能的变化[20],在奶酪成熟过程中,温度上升显著提高了奶酪成熟率,并且与蛋白质水解、脂类分解、氨基酸或脂质分解代谢有关微生物的基因表达也发生了上调。这些宏转录组数据分析的结果可应用于工业生产,通过调控温度进而达到调节微生物的代谢产物的目的。因此,宏转录组学对优化生产效率及提高产品质量有重要的指导意义。
随着组学技术的成熟和成本的降低,研究者们正试图用多种组学数据结合分析来更好地揭示发酵过程中微生物的功能及其相互作用机制,以期获得突破性的研究成果。Dugat-Bony等[21]通过宏基因组学,宏转录组学和生化分析研究了4周成熟期内6种细菌和3种酵母组成的表面成熟的奶酪群体变化。在成熟初期,乳酸乳球菌和乳酸克鲁维酵母迅速消耗乳糖产生大量乳酸。乳酸再被汉逊德巴利酵母和假丝地霉酵母迅速消耗,这表达了高水平的乳酸脱氢酶转录本。大多数的RNA测序片段匹配到假丝地霉酵母的基因上,表明该菌对酪蛋白和脂肪降解起重要作用。测序数据表明与氨基酸降解相关的转录本源于假丝地霉酵母、干酪棒杆菌和蜂房哈夫尼亚菌,这一数据结果与假丝地霉酵母、干酪棒杆菌和蜂房哈夫尼亚菌在后期奶酪表皮旺盛生长相符。在这篇报道中作者结合不同的数据分析,获得了奶酪成熟过程中各种微生物的代谢产物及其可能的相互作用机制。此外,还采用差异表达分析提供了一组用于监测奶酪制作过程的生物标记基因,为监控奶酪制作过程提供了有价值的工具。
2.2 发酵酒精饮料发酵酒精饮料是以粮食、水果等为主要原料通过发酵或半发酵手段制成的可食用型饮料酒。研究者利用微生物培养法和分子生物学方法对发酵过程中生产环境和原料中的各种微生物群落进行了研究,如日本的清酒[22]、中国浓香型酒[23]和葡萄酒[24]等。
在印度米酒酒曲研究中,Bora等[25]首次应用宏基因组学揭示了更为全面的微生物群落特征,其中微生物包括以乳酸菌为主的细菌、根霉、毛霉和曲霉等产淀粉酶菌株,季也蒙毕赤酵母、威克汉姆西弗酵母、酿酒酵母等产乙醇菌株。但对于所获得的宏基因组数据,作者仅报道了分类学研究结果,并没有进一步分析功能基因组和其代谢途径。
微生物群落在酒发酵过程中扮演着不同的角色,对酒的发酵起着至关重要的作用。研究者们利用宏基因组数据,构建代谢途径,能够为微生物群落的代谢特征提供更加详细的解析。例如,在酱香型白酒发酵过程中,Chen等[26]报道,宛氏拟青霉具有最高的葡糖淀粉酶活性,米曲霉在可培养的真菌物种中显示出最高的a-淀粉酶活性。此外,在宛氏拟青霉和米曲霉生长与堆积发酵过程中淀粉和还原糖含量变化是一致的,表明它们在提供淀粉酶水解淀粉方面发挥着重要作用。在中国浓香型白酒中,克氏梭菌被认为是主要风味化合物己酸乙酯前体己酸的主要生产者[27]。在越南米酒的微生物演替和功能特性研究中,根霉被确定为主要的淀粉降解菌,酿酒酵母为主要的乙醇生产者。
酿酒酵母长期用于制备发酵酒精饮料和其他发酵食品,对其基因组学进行分析有助于研究其在发酵酒精饮料中的功能和演替特性。有研究者通过宏基因组学和宏转录组学对从茅台酒制造环境中分离出的酿酒酵母MT1[28]进行研究,结果表明MT1具有独特的多碳协同作用,它可以同时利用各种糖,包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、蜜二糖、海藻糖、棉子糖和松二糖。并且在低浓度葡萄糖存在下,己糖转运蛋白HXT5和HXT13的基因在MT1中的表达也会受到抑制。Song等[29]对酵母研究群体中常用的25种酿酒酵母菌株的基因组进行了重新测定,并开发了一套自动化泛基因组分析。他们还将11种替代酿酒酵母参考菌株的基因组序列和相应的注释整合到酵母基因组数据库中,为进一步研究提供数据库。
宏蛋白质组学方法在发酵酒精饮料中也有相关应用,它提高了人们对发酵酒精饮料的认识。有研究者对使用30年和300年的中国浓香型白酒窖泥采用宏蛋白质组学方法进行比较,鉴定出63种差异表达蛋白;59种蛋白在300年的窖泥种高度表达[30],这些蛋白参与甲烷生成,形成己酸和丁酸,因此它们在300年窖泥发酵过程中可能有助于产生更多的有机化合物。
在酒同步糖化发酵过程中,像丝状真菌类的微生物能分泌水解酶,使淀粉降解成可发酵糖,而酿酒酵母使糖转化为乙醇和风味物质。在茅台酒生产中,通过代谢物谱比较和分析,发现米曲霉不仅为酿酒酵母提供可发酵糖,而且在糖消耗中与酿酒酵母互相竞争,导致茅台酒形成了不同的风味成分[31]。白酒易被链霉菌属[Streptomyces(St.)spp.]污染,从而产生土腥素导致白酒带有泥土味,这是白酒发酵生产中普遍存在的问题。研究人员从茅台大曲中分离出的拮抗芽孢杆菌菌株[32]具有显著抑制土腥素主要生产者St.sampsoni的生长,并且在模拟发酵实验中有效地降低了土腥素的产生。最后通过超高相液相色谱串联质谱仪(UPLC-ESI/Q-TOF MS)鉴定了芽孢杆菌中的抗菌物质为脂肽。这两项研究强调了基于综合代谢组学方法分析白酒发酵的条件优化和生物防治的潜力,可以为中国白酒的工艺改良和品质的提高提供必要的理论依据和奠定技术基础。
2.3 发酵蔬菜发酵蔬菜种类繁多,如豆瓣酱、泡菜等。在蔬菜起始发酵和主发酵阶段,占优势的细菌包括肠膜状明串珠菌、短乳杆菌、啤酒片球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌及粪链球菌等,其中乳酸菌是发酵的主体。近年来,宏组学方法已应用于蔬菜发酵过程中的微生物群落研究。
泡菜是用蔬菜(卷心菜、韭菜和萝卜等)和各种香料(红辣椒粉、大蒜和姜等)混合发酵制得,有时添加发酵剂。泡菜中的代谢物在发酵或长期储存过程中会发生变化,这与微生物的演替有关[33]。核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)分析表明,泡菜发酵过程中会产生有机酸、甘露醇和γ-氨基丁酸(Gamma- aminobutyric acid,GABA),明串珠菌和沙克乳杆菌分别被确定为甘露醇和GABA的生产者。为了评价泡菜中发酵剂植物乳杆菌的发酵特性,采用了GC-MS和主成分分析(Principal component analysis,PCA)方法,揭示了植物乳杆菌对代谢组学的影响,在发酵过程中植物乳杆菌引起乳酸和甘油增加,也导致了缬氨酸、亮氨酸、柠檬酸和蔗糖减少[34]。
宏基因组学方法也应用于泡菜中,并有了一定的成果。Jung等[35]运用宏基因组学研究了泡菜29 d发酵过程中的微生物群落。通过宏基因组的16S rRNA基因数据构建的系统发育树分析表明泡菜中优势菌属为明串珠菌属、乳杆菌属和魏斯氏菌属。在基因功能注释方面,采用宏基因组注释技术,揭示了一系列碳水化合物异型乳酸发酵的相关基因,这与检测到的发酵产物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯和乙醇等相一致。大多数泡菜的宏基因组序列与肠膜明串珠菌和沙克乳杆菌基因有很高的同源性,说明这两种菌在泡菜发酵中发挥着重要作用。在宏基因组数据库中也鉴定出了大量的噬菌体DNA序列,说明发酵过程中微生物群落受到了噬菌体感染。这些结果不仅深入揭示泡菜发酵中微生物的功能,也揭示了微生物群落对泡菜发酵过程的影响。
这些代谢组学和宏基因组学报告使我们更好地认识各种微生物在泡菜发酵过程中发挥的重要作用,其结果有益于提高发酵蔬菜的质量和安全性。
2.4 发酵茶发酵茶因其有益健康而一直深受世界各地人们的喜爱。例如,中国普洱茶、茯砖茶和泰国的Miang[36]。普洱茶是一种典型的发酵茶,它分为生茶和熟茶两种,是在较高温度和湿度下加速发酵制得[37]。Tian等[38]通过微生物培养和PCR-DGGE方法研究了普洱茶生长和成熟不同时间段(从 < 1-192个月)样品中的细菌和真菌群落。研究结果表明,普洱茶贮存时间和质量之间的关系很复杂,涉及多酚含量、微生物丰度和多样性变化。真菌和细菌丰度随着贮存时间延长而降低,且熟茶微生物种类显著多于生茶。细菌多样性与老化时间呈正相关,老化前60个月生茶和熟茶的真菌多样性增加,随后下降,这与多酚含量变化有关。Lyu等[39]通过普洱熟茶发酵的初步宏基因组学研究划定了微生物群落的分类和功能特性,确定了3个优势细菌门(变形杆菌,放线菌和厚壁菌门)和一个处于主导地位的真菌门(子囊菌门)。鉴定并分析了涉及16种途径的69个酶基因,如萜类化合物和聚酮化合物的代谢以及其他次生代谢物的生物合成。这些宏基因组数据表明普洱茶发酵的主要微生物包含细菌和酵母,功能基因的挖掘和代谢途径的分析有利于在分子水平上对普洱茶发酵机理作进一步研究。
通过细菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因的扩增子测序,在普洱茶中鉴定出变形杆菌(48.42%)、厚壁菌门(19.91%)、放线菌(16.91%)和蓝藻(9.95%)为主要细菌,曲霉菌(94.98%)为主要真菌[40]。通过液相色谱-质谱联用仪或质谱仪(LC-MS / MS)进一步对相同样品进行宏蛋白质组学分析,确定了至少有两种独特肽的335种蛋白质。在曲霉菌中发现了一半已鉴定的蛋白质,这进一步说明曲霉是优势真菌和固态发酵的主要贡献者。鉴定出的蛋白质,包括涉及降解植物细胞壁的酶和过氧化物的氧化还原酶等与普洱茶发酵密切相关的酶,以及与儿茶素氧化有关的过氧化氢酶和过氧化物酶。另外,代谢组学也被应用在发酵茶挥发性和非挥发性化学成分动态变化的研究中。研究者通过超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS)的非靶向代谢组学方法分析了红茶茶树某品种在发酵14 h期间代谢产物的变化[41],并鉴定出61种代谢产物。这项研究提供了红茶发酵过程中非挥发性代谢物变化的综合概况[42]。
在对发酵茶的研究过程中,宏组学技术为阐明微生物在发酵过程中的作用提供了全面而系统的概述。使人们更好地了解了普洱茶发酵过程中微生物的消亡规律和其对普洱茶品质的影响。
2.5 发酵豆制品发酵豆制品主要有两种,一种是黏性大豆食品,如日本纳豆、韩国chungkookjang;另一种是由丝状霉菌如曲霉、毛霉和根霉发酵的咸大豆产品。
各种黏性性大豆制品的黏性是由聚-γ-谷氨酸(Poly-gamma-glutamic acid,PGA)产生,其最主要的细菌通常是枯草芽孢杆菌[43],且印度Kinema的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和索诺拉沙漠芽孢杆菌[Bacillus(B.)sonorensis]均产生PGA[44]。Jung等[45]通过16S rRNA基因扩增子测序和1H NMR专门研究了韩国大豆酱发酵中的细菌群落,发现主要的芽孢杆菌属和肠球菌属的丰度与代谢物变化无关,而四联球菌是产生有机酸和生物胺的主要原因,并且乳杆菌是γ-氨基丁酸的主要生产者。从韩国chungkookjang中分离出的Bacillus sp.LM7抗菌菌株[46],其分泌的抗菌物质具有极高稳定性和广泛抗菌谱。通过LC-MS分析确定该物质为4种杆菌霉素D和4种表面活性素类似物的脂肽混合物。
另一个重要的发酵豆制品是酱油,工业上常用曲霉菌发酵制得。将酱油菌株米曲霉3.042与米曲霉RIB40的基因组测序比较[47],分析鉴定了与细胞生长、耐盐性、环境抗性和风味形成相关的特异性基因,这基因的发现能够解释菌株产生不同风味酱油的原因。米曲霉100-8及其亲本菌株米曲霉3.042用于酱油发酵,在30、36和42 h的早期发酵中通过转录组和实时定量PCR分析比较它们的基因表达[48],结果显示米曲霉100-8中参与活性氧、细胞内Ca2+浓度和孢子形成有关的基因表达较低,而与糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代谢和β-氧化相关的基因表达较高。这种基因调控说明在米曲霉100-8发酵中高活性的酶是参与糖酵解、氧化磷酸化、氨基酸代谢和β-氧化相关的酶。除真菌外,16S rRNA基因的DGGE和1H NMR代谢物分析鉴定出色盐杆菌在韩国酱油发酵过程中会产生有机酸和腐胺。在对酱油卤水发酵过程中微生物演替及其功能的研究中,Sulaiman等[49]通过宏基因组研究传统酱油发酵过程的微生物群落演替和基因功能,并分析了优势菌群代谢与卤水特性变化的关联。该研究发现在6个月的发酵过程中,中国酱油卤水是先以魏斯氏菌属为主,后由真菌念珠菌属发酵制得。通过宏基因组序列的代谢重建,揭示了蛋白质和碳水化合物异型发酵的特征,与检测到乙醇和pH值下降相符。这些研究深入剖析了豆制品发酵过程中微生物群落结构以及多种优势微生物的基因组和代谢途径特性,为今后豆制品优质发酵提供了有效的依据。
2.6 食醋食醋是由含糖底物发酵产生的传统醋酸产品。其品质取决于多种因素,包括酒精发酵和醋酸发酵阶段的原料和微生物多样性[50]。目前,许多微生物学研究已揭示了传统发酵食醋酿造过程中微生物群落的多样性和形成规律,但是对群落中微生物的相互作用及主要代谢产物形成之间的关系仍不清楚。基于宏基因组测序分析等技术的应用是有效解决上述问题的重要手段。
谷物酸固态醋酸发酵是一种混合培养发酵过程[51]。研究者发现镇江香醋的细菌群落演替和风味形成相关[52],其主要风味物质是通过在群落中微生物的代谢和相互作用而产生。通过rRNA基因扩增子测序和风味分析发现,镇江香醋在18 d发酵过程中产生风味的核心微生物主要有醋酸杆菌、乳杆菌、曲霉菌和交链孢霉[53]。同时应用双向正交偏最小二乘法(Bidirectional orthogonal partial least squares,O2PLS)的微生物演替与风味动力学相关性分析强调了细菌的重要性。根据其在微生物群落中的主导地位和功能,建议将醋酸杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、乳酸球菌、葡萄糖酸杆菌、芽孢杆菌和葡萄球菌7个属作为食醋风味的功能性核心菌群。通过宏组学技术研究微生物在食醋发酵中的功能可能有助于弄清其代谢所产生的益处,提高食醋的营养价值。
3 总结与展望如上所述,近年来,随着高通量测序技术迅速发展,以其为主要手段的宏基因组、宏转录组和宏蛋白质组等技术在大量的食品微生物中应用,对食品微生物的研究方法和研究内容产生了深远的影响。然而,目前的宏组学分析仍存在一些局限性。例如,宏基因组技术依赖于总DNA提取与测序深度。天然环境复杂多样,环境中的核酸酶及腐殖质都会影响总DNA提取,因此需要根据不同环境样品优化提取条件与提取方法。现有的测序技术如Illumin适用高通量测序,但是序列片段短,拼接具有一定难度;宏转录组学也存在许多技术上的挑战,如mRNA半衰期短、富集非常困难、cDNA合成和扩增存在偏差等;宏基因组和宏转录组测序数据量较大,测序数据的后续分析也依赖于硬件系统与算法程序的精确性,因此后续数据处理结果的准确性取决于硬件系统和算法程序的开发。另外,由于测序费用昂贵导致测序重复样本较少,降低了实验结果的可靠性和再现性;宏蛋白质组学在研究环境中微生物区系的活动中具有很大潜力,但是环境样品(如土壤和沉积物等)成分复杂,蛋白质提取是该技术最大挑战,而且蛋白质不能扩增,稳定性差,环境中蛋白质含量少等因素,影响提取效果与提取效率。
随着宏组学技术提取方法的改进和高通量测序技术的发展,相信这些技术的缺点将会逐渐被解决,并在多种生态领域得到快速的发展和应用。目前,具有更多优势的三代测序技术也已经应运而生,如太平洋测序生物科学公司Pac Bio RS平台具有超长读取长度(10 kb)和极低的鸟嘌呤核酸和胞嘧啶核酸(Guanylic acid andcytidylic acid,GC)偏好性,有利于基因组的组装[54];在高等动植物基因组和转录组的研究中测序技术和光学图谱技术的结合使用,为发酵食品微生物群落结构的研究提供了更加准确的方法。随着测序、MS技术的进步和统计算法软件快速的更新换代,相信包括宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢学在内的综合宏组学技术的联系将会更加紧密。宏基因组学提供环境总DNA信息,宏转录组学提供环境总RNA信息,宏蛋白质组学提供实时状况下环境功能信息,代谢组学提供环境代谢产物的总体信息。将这些“组学”有效地结合起来并用于研究复杂的发酵食品体系中的微生物资源,可使人们从系统角度全面认识微生物群落与其功能,利用其规律、挖掘新的微生物菌种及其酶资源等,这将是未来微生物生态学研究的新趋势。
[1] |
Bokulich NA, Lewis ZT, Boundy-Mills K, et al. A new perspective on microbial landscapes within food production[J]. Curr Opin Biotechnol, 2016, 37: 182-189. DOI:10.1016/j.copbio.2015.12.008 |
[2] |
Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural products[J]. Chem Biol, 1998, 5(10): 245-249. DOI:10.1016/S1074-5521(98)90108-9 |
[3] |
Albantoglu U, Cakar A, et al. Metagenomic analysis of the microbial community in kefir grains[J]. Food Microbiol, 2014, 41: 42-51. DOI:10.1016/j.fm.2014.01.014 |
[4] |
Poretsky RS, Bano N, Buchan A, et al. Analysis of microbial gene transcripts in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7): 4121-4126. DOI:10.1128/AEM.71.7.4121-4126.2005 |
[5] |
Reyes A, Haynes M, Hanson N, et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers[J]. Nat, 2010, 466(7304): 334-338. DOI:10.1038/nature09199 |
[6] |
Lacerda C, Choe LH, Reardon KF. Metaproteomic analysis of a bacterial community response to cadmium exposure[J]. J Proteome Res, 2007, 6: 1145-1152. DOI:10.1021/pr060477v |
[7] |
Park C, Helm RF. Application of metaproteomic analysis for studying extracellular polymeric substances(EPS)in activated sludge flocs and their fate in sludge digestion[J]. Water Sci Technol, 2008, 57: 2009-2015. DOI:10.2166/wst.2008.620 |
[8] |
于仁涛, 高培基, 韩黎, 等. 宏蛋白质组学研究策略及应用[J]. 生物工程学报, 2009, 25(7): 961-967. DOI:10.3321/j.issn:1000-3061.2009.07.001 |
[9] |
Wilmes P, Heintz-Buschart A, Bond PL. A decade of metaproteomics:where we stand and what the future holds[J]. Proteomics, 2015, 15(20): 3409-3417. DOI:10.1002/pmic.201500183 |
[10] |
Mangiapane E, Mazzoli R, et al. Ten years of subproteome investigations in lactic acid bacteria:a key for food starter and probiotic typing[J]. J Proteomics, 2015, 127: 332-339. DOI:10.1016/j.jprot.2015.04.028 |
[11] |
Mozzi F, Ortiz ME, et al. Metabolomics as a tool for the comprehen-sive understanding of fermented and functional foods with lactic acid bacteria[J]. Food Res Inter, 2013, 54(1): 1152-1161. DOI:10.1016/j.foodres.2012.11.010 |
[12] |
Reaves ML, Rabinowitz JD. Metabolomics in systems mi-crobiology[J]. Curr Opin Biotechnol, 2011, 22(1): 17-25. |
[13] |
Nicholson JK, Lindon JC. Systems biology:metabonomics[J]. Nat, 2008, 455(7216): 1054-1056. DOI:10.1038/4551054a |
[14] |
黄强, 尹沛源, 路鑫, 等. 色谱-质谱联用技术在代谢组学中的应用[J]. 色谱, 2009, 27(5): 566-572. DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2009.05.007 |
[15] |
German JB, Hammock BD, Watkins SM. Metabolomics:building on a century of biochemistry to guide human health[J]. Me-tabolomics, 2005, 1(1): 3-9. |
[16] |
Wolfe BE, Button JE, Santarelli M, et al. Cheese rind communities provide tractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity[J]. Cell, 2014, 158(2): 422-433. DOI:10.1016/j.cell.2014.05.041 |
[17] |
Almeida M, Hébert A, Abraham AL, et al. Construction of a dairy microbial genome catalog opens new perspectives for the metagenomic analysis of dairy fermented products[J]. BMC Genomics, 2014, 15(1): 1101. DOI:10.1186/1471-2164-15-1101 |
[18] |
Escobar-Zepeda A, Sanchez-Flores A, Baruch MQ. Metagenomic analysis of a Mexican ripened cheese reveals a unique complex microbiota[J]. Food Microbiology, 2016, 57: 116-127. DOI:10.1016/j.fm.2016.02.004 |
[19] |
Monnet C, Dugat-Bony E, Swennen D, et al. Investigation of the activity of the microorganisms in a reblochon-style cheese by metatranscriptomic analysis[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 536. |
[20] |
De Filippis F, Genovese A, Ferranti P, et al. Metatranscriptomics reveals temperature-driven functional changes in microbiome impacting cheese maturation rate[J]. Sci Rep, 2016, 6: 21871. DOI:10.1038/srep21871 |
[21] |
Dugat-Bony E, Straub C, Teissandier A, et al. Overview of a surface-ripened cheese community functioning by meta-omics analyses[J]. PLoS One, 2015, 10: e0124360. DOI:10.1371/journal.pone.0124360 |
[22] |
Bokulich NA, Ohta M, Lee M, Mills DA. Indigenous bacteria and fungi drive traditional kimoto sake fermentations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(17): 5522-5529. DOI:10.1128/AEM.00663-14 |
[23] |
Zhang L, Zhou R, Niu M, Zheng J, Wu C. Difference of microbial community stressed in artificial pit muds for Luzhou-flavour liquor brewing revealed by multiphase culture-independent technology[J]. J Appl Microbiol, 2015, 119(5): 1345-1356. DOI:10.1111/jam.2015.119.issue-5 |
[24] |
Bokulich NA, Thorngate JH, et al. Microbial biogeography of wine grapes is conditioned by cultivar, vintage, and climate[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(1): E139-148. DOI:10.1073/pnas.1317377110 |
[25] |
Bora SS, Keot J, Das S, et al. Metagenomics analysis of microbial communities associated with a traditional rice wine starter culture(Xaj-pitha)of Assam, India[J]. Biotech, 2016, 6(2): 153. |
[26] |
Chen B, et al. Filamentous fungal diversity and community struct-ure associated with the solid state fermentation of Chinese Maotai-flavor liquor[J]. Int J Food Microbiol, 2014, 179: 80-84. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.03.011 |
[27] |
Hu XL, Du H, Xu Y. Identification and quantification of the caproic acid-producing bacterium Clostridium kluyveri in the fermentation of pit mud used for Chinese strong-aroma type liquor production[J]. Int J Food Microbiol, 2015, 214: 116-122. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.07.032 |
[28] |
Lu X, Wu Q, et al. Genomic and transcriptomic analyses of the Chi-nese Maotai-flavored liquor yeast MT1 revealed its unique multi-carbon co-utilization[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 1064. DOI:10.1186/s12864-015-2263-0 |
[29] |
Song G, Dickins BJA, Demeter J, et al. AGAPE(automated genome analysis PipelinE)for Pan-genome analysis of Saccharomyces cerevisiae[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0120671. DOI:10.1371/journal.pone.0120671 |
[30] |
Zheng Q, Lin B, Wang Y, et al. Proteomic and high-throughput analysis of protein expression and microbial diversity of microbes from 30-and 300-year pit muds of Chinese Luzhou-flavor liquor[J]. Food Res Inter, 2015, 75: 305-314. DOI:10.1016/j.foodres.2015.06.029 |
[31] |
Wu Q, Chen B, Xu Y. Regulating yeast flavor metabolism by controlling saccharification reaction rate in simultaneous saccharification and fermentation of Chinese Maotai-flavor liquor[J]. Int J Food Microbiol, 2015, 200: 39-46. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.01.012 |
[32] |
Zhi Y, Wu Q, Du H, et al. Biocontrol of geosmin-producing Streptomyces spp.by two Bacillus strains from Chinese liquor[J]. Int J Food Microbiol, 2016, 231: 1-9. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2016.04.021 |
[33] |
Jeong SH, Jung JY, et al. Microbial succession and metabolite changes during fermentation of dongchimi, traditional Korean watery kimchi[J]. Int J Food Microbiol, 2013, 164(1): 46-53. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.03.016 |
[34] |
Park SE, Yoo SA, Seo SH, et al. GC-MS based metabolomics approach of Kimchi for the understanding of Lactobacillus plantarum fermentation characteristics[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 68: 313-321. DOI:10.1016/j.lwt.2015.12.046 |
[35] |
Jung JY, Lee SH, Kim JM, et al. Metagenomic analysis of kimchi, the Korean traditional fermented food[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(7): 2264-2274. DOI:10.1128/AEM.02157-10 |
[36] |
Xu A, Wang Y, Wen J, et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fuzhuan brick-tea[J]. Int J Food Microbiol, 2011, 146(1): 14-22. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.01.024 |
[37] |
Lv H, Zhang Y, Lin Z, et al. Processing and chemical constituents of Pu-erh tea:a review[J]. Food Res Inter, 2013, 53(2): 608-618. DOI:10.1016/j.foodres.2013.02.043 |
[38] |
Tian J, Zhu Z, Wu B, et al. Bacterial and fungal communities in Pu'er tea samples of different ages[J]. J food Sci, 2013, 78(8): M1249-M1256. DOI:10.1111/1750-3841.12218 |
[39] |
Lyu C, Chen C, Ge F, et al. A preliminary metagenomic study of puer tea during pile fermentation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2013, 93(13): 3165-3174. DOI:10.1002/jsfa.2013.93.issue-13 |
[40] |
Zhao M, Zhang D, Su X, et al. An integrated metagenomics/metaproteomics investigation of the microbial communities and enzymes in solid-state fermentation of Pu-erh tea[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 10117. DOI:10.1038/srep10117 |
[41] |
Tan J, Dai W, Lu M, et al. Study of the dynamic changes in the non-volatile chemical constituents of black tea during fermentation processing by a non-targeted metabolomics approach[J]. Food Res Inter, 2016, 79: 106-113. DOI:10.1016/j.foodres.2015.11.018 |
[42] |
Wang Q, Gong J, Chisti Y, et al. Fungal isolates from a Pu-Erh type tea fermentation and their ability to convert tea polyphenols to theabrownins[J]. J food Sci, 2015, 80(4): M809-M817. DOI:10.1111/jfds.2015.80.issue-4 |
[43] |
Chettri R, Tamang JP. Bacillus species isolated from tungrymbai and bekang, naturally fermented soybean foods of India[J]. Int J Food Microbiol, 2015, 197: 72-76. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.12.021 |
[44] |
Chettri R, Bhutia MO, Tamang JP. Poly-γ-glutamic acid(PGA)-producing Bacillus species isolated from Kinema, Indian fermented soybean food[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 971. |
[45] |
Jung WY, et al. Functional characterization of bacterial communities responsible for fermentation of Doenjang:a traditional Korean fermented soybean paste[J]. Front Microbiol, 2016, 7: 827. |
[46] |
Lee MH, Lee J, Nam YD, et al. Characterization of antimicrobial lipopeptides produced by Bacillus sp.LM7 isolated from chungkookjang, a Korean traditional fermented soybean food[J]. Int J Food Microbiol, 2016, 221: 12-18. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.12.010 |
[47] |
Zhao G, Yao Y, et al. Comparative genomic analysis of Aspergillus oryzae strains 3.042 and RIB40 for soy sauce fermentation[J]. Int J Food Microbiol, 2013, 164(2-3): 148-154. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.03.027 |
[48] |
Zhao G, Yao Y, Hao G, et al. Gene regulation in Aspergillus oryzae promotes hyphal growth and flavor formation in soy sauce koji[J]. Rsc Advances, 2015, 5(31): 24224-24230. DOI:10.1039/C4RA16819D |
[49] |
Sulaiman J, Gan HM, Yin WF, et al. Microbial succession and the functional potential during the fermentation of Chinese soy sauce brine[J]. Front Microbiol, 2014, 5: 556. |
[50] |
Li S, Li P, Feng F, et al. Microbial diversity and their roles in the vinegar fermentation process[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(12): 4997-5024. DOI:10.1007/s00253-015-6659-1 |
[51] |
Wu JJ, Gullo M, Chen FS, et al. Diversity of Acetobacter pasteurianus strains isolated from solid-state fermentation of cereal vinegars[J]. Current Microbiology, 2010, 60(4): 280-286. DOI:10.1007/s00284-009-9538-0 |
[52] |
Wang ZM, Lu ZM, Yu YJ, et al. Batch-to-batch uniformity of bacterial community succession and flavor formation in the fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar[J]. Food Microbiology, 2015, 50: 64-69. DOI:10.1016/j.fm.2015.03.012 |
[53] |
Wang ZM, Lu ZM, Shi JS, et al. Exploring flavour-producing core microbiota in multispecies solid-state fermentation of traditional Chinese vinegar[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 26818. DOI:10.1038/srep26818 |
[54] |
Zhang GQ, Xu Q, Bian C, et al. The Dendrobium catenatum Lindl.genome sequence provides insights into polysaccharide synthase, floral development and adaptive evolution[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 19029. DOI:10.1038/srep19029 |