辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒属一年生草本植物，在我国蔬菜产业中占有重要地位。优良品种的培育可以提高辣椒的产量和质量，因此，培育出优良的品种有着重要的意义。辣椒是常异花授粉植物，杂交优势明显，在生产中，F1杂交品种已广泛应用。辣椒胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是杂交优势利用的基础和主要途径，是辣椒育种研究的主要方向。CMS在自然界普遍存在，已在200多个物种中发现[1]。CMS植株不能产生正常可育的花粉、花药或雄配子，大量研究表明，这种雄性不育现象与植物的能量代谢异常有关[2]。
线粒体是植物正常生长的能量工厂，为植物提供能量。COX3是线粒体呼吸链第4个复合体亚基细胞色素氧化酶第三亚基编码的基因，是呼吸链的重要组成部分，与线粒体的能量代谢直接有关[3]。线粒体呼吸链包含多个复合体：复合体Ⅰ（NADH脱氢酶）、复合体Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）、复合体Ⅲ（细胞色素C还原酶）和复合体Ⅳ（细胞色素C氧化酶）[4]。除此之外，还有复合体Ⅴ，即F0F1-ATP合酶，通常代表F0F1-ATP合酶的F0亚基部分。
在野生型水稻CMS系RT98A和烟草CMSⅠ、CMSⅡ中鉴定到复合体Ⅰ的nad7和nad9[5]。在烟草CMSⅡ中，整个nad7缺失导致CMS，烟草CMSⅠ中，nad7外显子缺失导致CMS[5]。在复合体Ⅳ中，DC-CMS萝卜的orf463序列是由部分COXⅠ序列和一段未知的1 261 bp序列组成[6]。HL-CMS水稻中，orfH79与COXⅡ表现出高度的同源性[7]。在复合体Ⅴ中，Boro CMSⅡ-型水稻和向日葵PEF1-CMS，水稻的orf79和atp6共转录[8-9]，向日葵中检测到与CMS相关的0.5 kb序列插入到atp9的3'上游序列[10]。同时，在线粒体中有很多与呼吸链相关的基因被克隆，其中，甜菜CMS的atpA、COXⅠ、COXⅡ和orf187被克隆，并进行了表达分析，发现保持系和CMS系编码的氨基酸和核苷酸序列都发生了改变，此外相同基因在两系同一个花蕾发育时期的表达存在差异[11]。周晓娟等[12]发现洋葱atp6在保持系和CMS系之间的表达存在差异。刘科伟等[13]发现辣椒CMS相关基因orf456只在CMS系中表达，推测该基因控制辣椒花药中蛋白的表达，引起小孢子败育，进而导致败育。
在辣椒CMS中，很多能量代谢相关基因在CMS系和保持系的小孢子发育表达量存在差异[14-16]。但有关COX3在辣椒胞质雄性不育中的相关研究未见报道。本研究以辣椒CMS系和保持系为实验材料，分析COX3在两系中的差异，为研究辣椒CMS与能量代谢的关系提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料实验材料为湖南省蔬菜研究所选育的辣椒CMS系9704A和保持系9704B，种植于云南农业大学园林园艺学院试验基地。取盛花期保持系9704B的茎、叶、胎座、果皮、种子5个不同的组织进行表达。同时取两系花蕾的4个不同发育阶段（造孢细胞增殖期、花粉母细胞减数分裂期、小孢子单核期和小孢子成熟期）为实验材料进行发育过程表达分析。
1.2 方法 1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成采用Trizal试剂提取所有材料的RNA，在-80℃保存RNA，利用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，对符合要求的RNA样品用TaKaRa试剂盒进行反转录成cDNA，-20℃保存。
1.2.2 COX3的克隆根据NCBI数据库中辣椒线粒体DNA的全序列，用Primer 5.0软件设计特异引物，用于COX3编码区全序列的扩增，上游引物F1：5'-TCGGGTCATTTCTTGGTG-3'，下游引物R1：5'-TAGACCCCAAAGAGCCCT-3'。所用引物由擎科生物技术有限公司昆明分部合成。PCR反应体系为1 µL cNDA、22 µL金牌mix和上下游引物各1 µL。PCR反应程序为98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 18 s，35个循环；72℃ 5 min。
1.2.3 生物信息学分析对获得的PCR扩增条带进行双向测序，根据获得的序列进行相关分析：推导出该基因的氨基酸序列及分子量、等电点；预测蛋白质的二级结构、亚细胞定位情况和保守结构域；分析氨基酸的同源性及构建多种物种进化树。所用的软件及服务器网址参照邵贵芳等[4]报道。
1.2.4 实时荧光定量PCR分析采用TaKaRa荧光定量试剂盒，以两系4个不同发育阶段的花蕾cDNA为模板，设计引物F2：5'-ACTGCTCGTTTTTCCTTC-C-3'，R2：5'-TTTTCGGGCTTCTTCTCAT-3'。以辣椒Actin片段为内标（引物F3：5'-TGCAGGAATCCAC-GAGACTAC-3'和R3：5'-TACCACCACTGAGCACAA-TGTT-3'），运用Applied Biosystem荧光定量PCR仪进行q-PCR扩增。反应体系为10 µL的SYBR Premix ExTaqⅡ、上下游引物各0.8 µL（10 µmol/L）、2 µL的cDNA模板、0.4 µL的POX Reference DyeⅡ和6 µL的ddH2O。反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环，每个样品重复3次。数据用2-ΔΔCt法进行相对表达量计算[17]。
2 结果 2.1 CaCOX3的扩增以辣椒CMS系和保持系的cDNA为模板，采用特异性引物F1和R1扩增CaCOX3（图 1）。经测序，获得大小为1 100 bp片段，与预期目的基因大小相符。
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| 图 1 辣椒CaCOX3的扩增结果 M：DL2000；A：9704A；B：9704B |
经RT-PCR扩增获得目的基因CaCOX3的编码区全长为798 bp，编码265个氨基酸（图 2）。生物信息学分析，CaCOX3编码氨基酸的分子量为29.88 kD，等电点为6.854。通过SOPMA程序预测蛋白质二级结构，含有α螺旋135个（50.94%）、延伸链43个（16.23%）、β转角16个（6.04%）和无规则卷曲76个（26.79%）。预测辣椒CaCOX3蛋白定位在细胞质中的概率为94.1%。
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| 图 2 CaCOX3的CDS全序列及其编码的氨基酸序列 *代表终止密码子 |
对保持系和CMS系CaCOX3蛋白质一级结构进行对比，两者之间的氨基酸序列没有差异。通过BLASTP比对，辣椒CaCOX3氨基酸序列与烟草（Nicotiana tabacum，BAD83521.2）、马铃薯（Solanum tuberosum，AAM47526.1）、下垂辣椒（C. baccatum，PHT41048.1）、酸浆（Physalis heterophylla，AKZ24 689.1）、维吉尼亚酸浆（Physalis virginiana，AKZ24690.1）、西瓜（Citrullus lanatus，YP_003587238.1）、刺槐（Rhazya stricta，YP_009041182.1）和百脉根（Lotus japonicus，YP_005090497.1）的同源性分别为99%、95%、96%、95%、95%、98%、94%和98%。采用MegAlin、MEGA7.0等构建COX3进化树，结果（图 3和图 4）表明，辣椒CaCOX3与烟草的COX3的亲缘关系近。
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| 图 3 辣椒与其他物种COX3氨基酸比对 |
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| 图 4 辣椒与其他物种COX3氨基酸进化树分析 标尺代表遗传距离；数值代表从1 000次重复计算得到的Bootstrap百分比值 |
通过分析CaCOX3在辣椒保持系9704B不同组织的表达（图 5）发现，该基因在5个组织中表达存在差异，叶中的表达量最低，果中表达最高，它们之间相差9倍，同茎相比，叶和种子的表达量低于茎。
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| 图 5 CaCOX3在9704B不同组织中的表达分析 |
CaCOX3在保持系和CMS系中的表达量如图 6所示。保持系9704B中，该基因在造孢细胞增殖期表达量最高，随着小孢子的发育，其表达量不断降低。CMS系9704A中，该基因在小孢子成熟期表达量最高，在小孢子发育的过程中花粉母细胞减数分裂期表达量最低，小孢子单核期、小孢子成熟期表达量呈现上升趋势。在两系小孢子单核期，两者之间的差异不明显，在其他3个时期存在很大差异。在小孢子发育的造孢细胞增殖期，两系存在差异显著性，保持系是CMS系的6.4倍。在花粉母细胞减数分裂期，保持系和CMS系的表达量接近6:1，保持系明显高于CMS系。在小孢子成熟期，CMS系高于保持系，是保持系的2倍。结果表明，在保持系和CMS系中，该基因的表达量存在较大差异，可能与雄性不育的形成有关。
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| 图 6 9704A和9704B花蕾不同时期CaCOX3的表达分析 1：造孢细胞增殖期；2：花粉母细胞减数分裂期；3：小孢子单核期；4：小孢子成熟期 |
线粒体呼吸链的最后一个酶是线粒体细胞色素c氧化酶，它将电子从细胞色素c驱动到氧分子[18]。COX1、COX2和COX3是由线粒体基因组编码的3个细胞色素c氧化酶的核心基因。研究表明，COX3在细胞色素c氧化酶中最保守，常用作物种分子系统演化和分类的有效基因[19]。在红麻CMS系和保持系线粒体基因组研究中，COX3的组织形式在两系中存在差异[20]。在粘类小麦CMS基因研究中，COX3在4种CMS系中的转录本小于保持系，推测基因可能参与粘类小麦CMS的形成[21]。本研究发现，CaCOX3在花蕾的不同时期，保持系在造孢细胞增殖期、花粉母细胞减数分裂期的表达量远高于CMS系。根据目前研究，花粉败育主要发生在单子叶植株小孢子成熟后期，双子叶植物发生在四分体时期或小孢子发育时期[22]。辣椒是典型的双子叶植物，在小孢子发育时，能量代谢发生改变，易造成不育现象的产生。CaCOX3作为呼吸作用中关键性基因，呼吸作用消耗有机物质，释放出能量用于植物的正常发育，保持系中该基因的表达量高，释放出的能量多，而CMS系该基因表达量少，释放出的能量少，因而造成了CMS系的小孢子不能正常生长发育，这可能是造成CMS的原因。在小孢子单核期，两系之间该基因的表达量几乎一致，但由于CMS系在小孢子花粉母细胞减数分裂期能量不足，小孢子正常生长发育被打破，因而后期的能量是否充足，对小孢子能够正常发育的意义不大。
4 结论克隆获得CaCOX3，其在辣椒胞质雄性不育9704A和保持系9704B中表达量存在差异，可能引起能量代谢异常，造成雄性不育。
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