光周期的变化在调节脊椎动物繁殖方面起着关键的作用。长日照（白天长度 > 12 h）繁殖动物一般在春季或夏季繁殖，如鸟类和小型啮齿类动物，而有蹄类哺乳动物等短日照（白天长度 < 12 h）的繁殖动物往往将其繁殖季节限制在前一个秋季^[1]。甲状腺激素（Thyroid hormone，TH）通过TH中Ⅱ型脱碘酶（Type Ⅱ iodothyronine deiodinase gene，DIO2）和Ⅲ型脱碘酶（Type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）基因表达的相互调节来指导季节性繁殖，该基因表达在中脑基底下丘脑（Medio-basal hypothalamus，MBH）的室管膜区中的瞳孔内^[2]。研究表明，日本鹌鹑垂体结节部（Pars tuberalis，PT）分泌的促甲状腺激素（Thyroid stimulating hormone，TSH）是DIO2、DIO3基因表达的主要光周期依赖性上游调节物^[3]。长日照会诱导PT的TSH生成，增加DIO2表达并抑制DIO3表达，从而提高MBH中的TH信号^[4]，光周期信号级联转导通过作用于下丘脑-垂体-性腺（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）轴调节DIO2、DIO3基因的表达，进而调节脊椎动物的生殖活动^[5]。从眼部输入的光信号可通过昼夜节律起搏器，视交叉上核传输到松果体，根据季节性信号通过DIO2、DIO3基因转化为褪黑素分泌模式，TSH在管腔中分泌受到褪黑激素分泌的调节，导致下丘脑室管膜细胞中DIO2、DIO3基因表达模式的变化，并沿HPG轴诱导神经内分泌级联转导^[6]。因此，TSHB-DIO2/DIO3逆向调控通路在哺乳动物季节性繁殖调节过程中发挥着重要作用。

牦牛（Bos grunniens）是我国青藏高原及其周边地区的珍稀畜种，是世界畜种中分布区域极少的家畜之一^[7]，属于季节性繁殖动物。但其繁殖性能较低，产犊间隔长，多为三年二胎或三年一胎^[8]。为探索TSHB-DIO2/DIO3逆向调控通路在牦牛季节性发情的调控机制及其在HPG轴上的表达变化，本研究以TSHB、DIO2、DIO3基因为研究对象，选取处于发情期的健康成年母牦牛的下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢等组织作为试验材料，对TSHB、DIO2、DIO3基因克隆测序及生物信息学分析，进而通过qPCR技术检测其在HPG轴的表达情况，并进行表达差异性分析，旨为研究牦牛TSHB-DIO2/DIO3逆向调控机制奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与组织的采集

发育良好且处于发情期的健康成年母牦牛5头，采自四川成都青白江唐家寺屠宰场。屠宰后立即采集牦牛下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢新鲜组织剪碎，用无菌生理盐水清洗，置于不含RNase的离心管中，锡箔纸密封后立即投入液氮罐并送至实验室，于-80℃保存备用。

1.1.2 主要仪器、试剂

PCR仪（Biometra），荧光定量PCR仪（Bio-Rad），Trizol试剂（Invitrogen），反转录试剂盒（MBI），荧光定量试剂盒与pMD-19T载体购自大连宝生物工程公司；Taq聚合酶和感受态细胞E.coli DH5α购自天根生化科技有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Ki康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.2 方法 1.2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因克隆

选用Trizol法提取牦牛各组织总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度，将A₂₆₀/A₂₈₀在1.8-2.1之间的RNA，用反转录试剂盒合成cDNA。根据GenBank上普通牛TSHB基因序列（NM_174205.1）、DIO2基因序列（AY858551.2）和牛DIO3基因序列（AY858552.1），用Primer Premier5.0设计PCR克隆引物（表 1），PCR扩增总体系为10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，2×Long Taq PCR Mix 5 μL，cDNA模板1 μL和2 μL ddH₂O。扩增条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸80 s，35个循环，72℃延伸10 min，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，将目的片段与pMD19-T载体连接后，转化到DH5α感受态细胞中，均匀涂布到含有0.1%氨苄的LB固体培养基上，37℃恒温培养24 h，挑取单个菌落进行目的基因检测，送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息学分析

通过NCBI中BLAST在线比对工具检索TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列，Megalign软件进行同源性比对并构建进化树。通过开放阅读框（ORF）预测目的基因氨基酸序列，利用ProtParam程序分析蛋白的主要结构及理化参数，ProtScal程序分析疏水性，SOPMA程序预测蛋白二级结构。

1.2.3 qPCR检测组织TSHB、DIO2、DIO3基因表达

根据已克隆出的牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列设计实时荧光定量PCR引物（表 2），内参基因选用GAPDH，检测各基因表达量。反应总体系为20 μL：Green Supermix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH₂O 8 μL。反应条件为：预变性95℃ 2 min；变性95℃ 10 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40个循环，每个样品重复检测3次。

1.2.4 统计分析

运用SPSS软件对实验数据进行分析，以垂体的Ct值为参考对牦牛各组织的差异定量分析，采用比较阈值法（2^-ΔΔCt法）进行相对定量分析，通过LSD法进行其差异性分析。

2 结果 2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的克隆

PCR扩增获得417 bp、951 bp、874 bp大小的条带（图 1），经NCBI ORF在线程序比对分析，获得TSHB基因的CDS区417 bp，编码139个氨基酸；DIO2基因的CDS区为951 bp，编码132个氨基酸；DIO3基因CDS区为874 bp，编码278个氨基酸。将cDNA序列和推导的氨基酸序列通过BankIt提交NCBI，登录号分别为MH598976、MH598977和MH598978。

2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息学分析

ProtParam结果表明，牦牛TSHB、DIO2、DIO3蛋白的分子式分别为C₇₀₀H₁₀₇₁N₁₇₃O₂₀₀S₂₁、C₆₄₈H₁₀₃₆N₁₇₂O₁₉₁S₆和C₁₄₀₇H₂₁₇₈N₃₉₈O₄₀₈S₁₃，相对分子量分别为15783.50、14484.75和31613.97，理论等电点分别为8.19、6.26和6.07，在哺乳动物网织红细胞中半衰期均为30 h，不稳定参数分别为46.33、50.10和59.00，三者均属于不稳定蛋白；脂溶性系数依次为63.88、104.77、84.86，ProtScal分析其疏水性平均值为0.066、0.173、-0.304，预测TSHB和DIO2蛋白为疏水性蛋白，DIO3蛋白为亲水性蛋白；TMPRED分析3个蛋白均无跨膜结构；SOPMA分析二级结构：TSHB主要由无规卷曲组成，占53.96%，并含有α-螺旋，β-折叠和延伸链；DIO2二级结构主要由α-螺旋组成，占44.70%，并含有延伸链和无规卷曲；DIO3二级结构主要由α-螺旋组成，占46.76%，并含有延伸链、β-折叠和无规卷曲。

2.3 同源性比较

通过NCBI中BLAST在线比对工具对来自其他物种的TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列进行比较和搜索，Megalign软件同源性比对：牦牛TSHB基因同源性与各物种都很近，均在90%以上，其中与普通牛（Bos taurus）最近，达98.8%，说明该基因具有高度保守性；牦牛DIO2基因与普通牛同源性最高，达99.7%，牦牛DIO3基因也与普通牛的同源性最高达99.8%，山羊（Capra hircus）97.5%。

Megalign软件构建TSHB、DIO2、DIO3基因物种进化树，结果如图 2-图 4，其中牦牛的序列前用▲表示，可见牦牛TSHB基因，普通牛（NM_174205.1）和牦牛聚为一类，再与绵羊（X90775.1）、山羊（NM_001287576.1）聚为一类，与物种进化一致；牦牛DIO2基因，普通牛（AY858551.2）和牦牛聚为一类，再与绵羊（GQ468498.1）、山羊（XM_018053898.1）聚为一类；牦牛DIO3基因和普通牛（AY858552.1）聚为一类，再与山羊（KJ184352.1）、绵羊（AY656759.1）聚为一类，与其遗传进化规律相符。

2.4 TSHB、DIO2、DIO3基因的表达水平

实时荧光定量PCR检测TSHB、DIO2、DIO3基因在牦牛各组织中的表达情况，结果如图 5-7，TSHB基因在垂体组织中的表达水平高于其他组织，差异极显著（P < 0.01）；在下丘脑、卵巢、子宫和输卵管中表达水平较低；DIO2基因在各组织中均有表达，在子宫的表达水平高于其他组织，差异极显著（P < 0.01），卵巢的表达水平显著高于垂体、下丘脑和输卵管（P < 0.05）；DIO3基因在子宫组织未检测到表达，卵巢组织表达水平高于垂体、下丘脑和输卵管，差异极显著（P < 0.01）。

3 讨论

研究表明，TSH亚基基因TSHB在垂体TH中的表达主要通过甲状腺激素脱碘酶基因DIO2、DIO3和下丘脑PT促甲状腺激素释放激素来调节^[9]。本研究克隆了牦牛TSHB基因，编码区cDNA序列长417 bp，编码138个氨基酸，与山羊^[10]、绵羊^[9]等物种一致；测序结果经生物信息学分析可知，TSHB蛋白为不稳定疏水性蛋白，无跨膜结构，二级结构主要由延伸链和无规卷曲组成；通过同源比对，牦牛TSHB基因与其他8个物种的同源性均在90%以上，其中与普通牛的最近，高达98.8%，说明该基因具有高度保守性；进化树结果表明，牦牛和普通牛、山羊、绵羊有着最近的分子进化关系，该结论和山羊的研究一致^[9]。目前对绵羊^[9]、山羊^[10]、大鼠^[11]、小鼠^[12]等动物的研究表明TSHB基因主要在垂体中表达，这与本研究TSHB基因在牦牛HPG轴的表达情况一致，表明TSHB基因在牦牛HPG轴组织中发挥重要作用，该基因在垂体的高表达量与牦牛的季节性繁殖密切相关。

DIO2和DIO3基因表达的变化与动物繁殖状态的季节性变换显著相关，通过去碘作用，DIO2可以将四碘甲状腺原氨酸（Thyroxine，T4）转化为生物活性更强的三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine，T3），而DIO3将催化T4和T3分别转化为其生物活性代谢物三碘甲状腺原氨酸和二碘甲状腺原氨酸^[13]。通过调节TH水平，DIO2和DIO3基因在许多物种的光周期反应相关的季节性繁殖调节中发挥重要作用。本研究克隆了牦牛DIO2基因，获得了951 bp的cDNA，编码132个氨基酸和一个终止密码子（TGA）；测序结果经生物信息学分析可知，DIO2为不稳定疏水性蛋白，无跨膜结构，二级结构主要由α-螺旋组成；DIO2是一种硒蛋白，其SeCys（U）残基的活性位点由TGA编码^[14]，SeCys残基上的硒氢基团参与机体的激素调节、细胞信号转导等生命过程^[15]，提示可能与DIO2、DIO3相互转化相关。对牦牛DIO2基因进行同源性比对同时构建进化树发现，该基因与普通牛同源性最高，符合进化关系。研究发现啮齿动物DIO2基因主要表达于下丘脑^[16-17]，小脑^[18]、甲状腺^[19]、以及睾丸等组织^[20]，同时有研究表明，DIO2在包括人类在内的多种动物中均可表达^[18-21]，这可能与甲状腺激素功能广泛有关。本研究还发现，该基因在牦牛5个组织均有表达，但表达量存在差异，这与前述各种动物DIO2广泛表达相似，也与在山羊各组织的表达水平研究一致^[22]。目前对DIO2基因组织表达主要集中在啮齿动物和鸟类的下丘脑、小脑、甲状腺、睾丸、子宫。本研究首次对牦牛HPG轴组织进行检测，发现该基因在HPG轴广泛表达，其中在子宫的表达量高于其他组织。Detti等^[21]对人类子宫内膜的研究发现，DIO2基因在诱导排卵的妇女子宫内膜早期蜕膜分化过程中的表达量显著低于发育正常的子宫内膜，推测DIO2基因可能对牦牛子宫也具有调控作用。

本研究克隆了牦牛的DIO3基因，获得873 bp的cDNA，编码278个氨基酸和一个终止子（TAA）；生物信息学分析结果表明，DIO3蛋白为不具有跨膜结构的不稳定亲水蛋白，二级结构主要由α-螺旋组成。研究发现，DIO3基因在大鼠小脑^[23]、大脑皮层^[24]和海马^[25]及心肌细胞^[26]中表达，还有研究发现DIO3在早期妊娠小鼠子宫内膜、鸟类^[18-19]和绵羊^[16]下丘脑以及人的胎盘均有表达^[27-28]。本研究通过qPCR方法检测发现，DIO3主要表达于牦牛HPG轴上卵巢、垂体和输卵管组织，且卵巢组织表达量高于其他组织。在下丘脑和子宫中仅有微弱表达，该结论和DIO3基因在季节性发情的辽宁青山羊组织表达中保持一致^[22]，表明DIO3基因在牦牛HPG轴组织中发挥重要作用。以上研究表明，DIO2、DIO3基因在调节季节性繁殖活动中发挥重要作用。

4 结论

本研究成功克隆出牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因cDNA序列，片段大小分别为417 bp、951 bp和874 bp，编码139、132和278个氨基酸。TSHB基因在垂体中的表达量高于下丘脑、卵巢、输卵管和子宫；DIO2基因在检测组织中均有表达，并且在子宫中的表达量高于其他4个组织；DIO3基因在子宫组织中未检出，卵巢组织的表达量高于垂体、下丘脑和输卵管。