泛素化是真核生物体内重要的蛋白翻译后修饰机制，泛素经泛素活化酶E1活化后，在泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的级联作用下传递至底物蛋白，决定底物蛋白的命运[1]。之前人们认为真核生物体内仅存在一种泛素活化酶Uba1（又称Ube1）[2-3]，2007年有三篇文章接连报道发现了第二个泛素活化酶Uba6[4-6]，两种泛素活化酶E1在将泛素传递至各种不同的泛素结合酶E2时虽有所重叠，但也各具有不同的活性[4]。真核生物体内存在近40个E2和600多个E3[7-8]，每个E2可与多个E3反应每个E3可识别多个底物蛋白进行泛素化修饰；多个E2也可与同一个E3反应，不同的E2-E3配对可将不同长度和不同拓扑结构的泛素链传递至底物蛋白上，形成错综复杂的泛素传递网进而修饰胞内蛋白[9]。
鉴于泛素化过程中E1-E2-E3的交叉反应性，目前很难针对某一条特异性的泛素化通路，对其E2-E3间及E3-底物蛋白间的相互作用进行研究，且对于后发现的泛素活化酶Uba6的功能研究仍不够深入。为探究Uba6泛素活化酶介导的泛素化通路，我们已通过正交泛素转移的方法，对比探索了泛素活化酶Uba1与Uba6在哺乳动物细胞中分别对应的泛素化过程，找到了494个在Uba1介导的泛素化通路中对应的底物蛋白，528个在Uba6介导的泛素化通路中对应的底物蛋白及225个二者的共同底物[10]。尽管Uba6与Uba1有着共同作用的泛素结合酶E2，但泛素结合酶USE1被证明是Uba6的特异性E2，与Uba1无交叉反应活性[3]，且近期有研究表明，USE1在肺癌细胞中存在过表达现象，可能与肺癌细胞的形成、转移、扩散相关，可作为肺癌发生的生物标记[11]。为进一步探究Uba6-USE1这条特异性泛素化通路的功能，我们在前期研究的基础上，通过RNA干扰技术构建靶向USE1基因的慢病毒载体，包装感染HEK-293细胞，抑制细胞中USE1基因的表达，后期将与过表达USE1基因、正常表达USE1基因细胞株对比其细胞中Uba6-USE1泛素化过程，利用LC-MS液质联用色谱及生物信息学方法找出3条USE1基因表达量不同的泛素化通路中的下游底物，旨为进一步研究Uba6-USE1特异性泛素化通路功能提供实验依据，奠定实验基础。
1 材料与方法 1.1 材料人胚肾HEK-293细胞购自中国科学院细胞库，慢病毒抑制表达载体pLL3.7由上海交通大学药学院孙磊惠赠；Gel/PCR纯化试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒购自Favorgen公司；限制性核酸内切酶BamH I，Xho I及其缓冲液、T4 DNA连接酶及其缓冲液、anti-USE1抗体购自Thermo Fisher公司；anti-GAPDH抗体购自上海优宁维生物科技股份有限公司；RNA反转录试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技公司；大肠杆菌DH5α菌种购自天根生化科技（北京）有限公司；引物的合成及质粒的测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 shRNA的设计与合成根据NCBI数据库中USE1基因的mRNA序列（NM_023079），利用Invitrogen公司提供的BLOCK-iTTM RNAi Designer工具，设计靶向USE1基因的shRNA序列。选择5'端以G开头，GC值在35%-55%之间，且靶点序列起始位置不同的三条序列作为候选，如表 1所示。根据慢病毒抑制表达载体pLL3.7的特点及要求，在寡核苷酸链最两端加上BamH I和Xho I酶切位点，并在5'端加上重建U6启动子的T碱基，在shRNA序列后加上Loop环序列TTCAAGAGA，在3'端加上终止序列TTTTTT。
将合成好的寡核苷酸单链经退火后形成双链，酶切保护碱基后与pLL3.7空载体经T4 DNA连接酶作用于16℃连接过夜，连接产物转化至DH5α感受态细胞后，均匀涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，倒置于37℃恒温培养箱过夜，次日挑取单克隆至含相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中震荡培养过夜，提取质粒，然后进行测序。
1.2.3 细胞的培养冻存的HEK-293细胞经37℃水浴复苏后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、含5% CO2的培养箱中培养，定期观察细胞状态，根据细胞生长情况适时更换培养基，一般2 d传代一次。
1.2.4 慢病毒质粒共转染HEK-293细胞及慢病毒的包装当HEK-293细胞融合度达70%-80%时准备转染。将3种含不同干扰序列的pLL3.7-shRNA慢病毒重组质粒及作为阴性对照的pLL3.7慢病毒空载体分别与慢病毒包装载体psPAX2、VSVG按照质量比1:3:4混合均匀，加入Opti-MEM培养基；另取相同体积的Opti-MEM培养基与转染试剂PEI进行混合，室温静置5 min后，将分别含有质粒和转染试剂的两管Opti-MEM培养基混匀，室温静置20 min，更换细胞培养基为无血清的DMEM，将混合液加至细胞培养皿中，于37℃、含5%CO2的培养箱中培养6-8sh，更换培养基为完全培养基，继续培养48 h，收集病毒上清液，离心浓缩，冻存于-80℃。
1.2.5 慢病毒滴度的测定及最佳稀释倍数的确定将HEK-293细胞按照每孔2×104个的密度铺于96孔板，培养24 h后，用DMEM完全培养基将浓缩后的病毒上清按10倍递减法依次稀释，培养48 h后，于荧光显微镜下观察病毒感染细胞状况，确定最佳稀释倍数，并按照以下公式计算病毒滴度。
病毒滴度（TU/mL）=荧光细胞数/相应稀释倍数
1.2.6 实时定量PCR及Western Blot检测基因表达量病毒感染前一天，按照每孔5×104个的密度将HEK-293细胞铺于24孔板，次日按照最佳稀释倍数加入病毒稀释液感染细胞，培养24 h后，弃病毒液，更换为DMEM完全培养基，继续培养48 h，收集细胞提取总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH为内参，通过实时定量PCR测定目的基因的表达量，其引物序列如下：
USE1-F：5'-ACAGGCCCATTTGACACTCC-3'
USE1-R：5'-CCCATTGCGGTAGAAGTTGG-3'
GAPDH-F：5'-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3'
GAPDH-R：5'-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3'
按照上述同样的方法将HEK-293细胞铺于24孔板并进行病毒感染并培养48 h后，每孔加入适量5×蛋白上样缓冲液裂解细胞，收集裂解液并金属浴加热10 min使蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳（分离胶浓度为10%），将蛋白条带转印至NC膜后，用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，洗去膜上残留的牛奶，分别用anti-USE1抗体（1:1 000稀释）和anti-GAPDH抗体（1:1 000稀释）敷育，4℃过夜，次日用TNET缓冲液洗膜3次，洗去残留在膜上的一抗，用相应的兔源二抗（1:10 000稀释）室温敷育1 h，用TNET缓冲液洗膜3次后用Odyssey双色红外荧光成像系统扫膜观察结果。
2 结果 2.1 三种USE1抑制表达慢病毒重组质粒pLL3.7-shRNA的鉴定将构建好的质粒送去测序，结果表明插入序列与shRNA设计的目的基因片段完全一致，说明质粒构建成功，可以用于后续实验。
2.2 USE1抑制表达慢病毒重组质粒包装结果USE1抑制表达慢病毒重组质粒pLL3.7-shRNA及包装质粒共转染至HEK-293细胞48 h后，于荧光显微镜（400×）下观察，包装结果如图 1所示。由于pLL3.7抑制表达载体可同时表达GFP绿色荧光蛋白，慢病毒包装后的细胞在蓝色荧光激发下在视野中呈现绿色，其中分图AB、CD、EF和GH分别代表 3种抑制表达重组质粒pLL3.7-shRNA1，2，3及阴性对照pLL3.7慢病毒空载体在同一视野下白光和荧光的包装结果。结果表明，转染48 h后，80%以上的HEK-293细胞均呈现较强绿色荧光，说明3种慢病毒质粒及pLL3.7慢病毒空载体均成功转染至细胞中，即慢病毒包装成功。
|
| 图 1 慢病毒重组质粒转染HEK-293细胞48 h后病毒包装结果（400×） A：pLL3.7-shRNA1白光；B：pLL3.7-shRNA1绿色荧光；C：pLL3.7-shRNA2白光；D：pLL3.7-shRNA2绿色荧光；E：pLL3.7-shRNA3白光；F：pLL3.7-shRNA3绿色荧光；G：pLL3.7 vector白光；H：pLL3.7 vector绿色荧光 |
将收集的慢病毒上清经离心浓缩后，按照10-106倍梯度稀释后感染细胞48 h，在400倍放大的荧光显微镜下观察呈现绿色荧光的细胞个数，计算得三种抑制表达USE1的慢病毒质粒pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3的病毒滴度分别为0.7×106 TU/mL，1.0×106 TU/mL和1.5×106 TU/mL，符合滴度要求。同时发现，经10倍、100倍、1000倍稀释的病毒感染细胞后，视野中呈现绿色荧光的细胞数逐渐减少，10倍稀释的病毒感染细胞后仍有约70%的细胞呈现绿色荧光，图 2中A-I分别表示3种pLL3.7-shRNA1，2，3慢病毒包装上清液在稀释10倍、100倍、1 000倍后感染HEK-293细胞在荧光显微镜下的结果。由于浓缩后的病毒上清直接感染细胞48 h后会导致细胞死亡，故选择10倍稀释的病毒上清感染细胞进行后续实验。
|
| 图 2 三种梯度稀释的慢病毒包装液感染HEK-293细胞48 h后结果（400×）s A，B，C：10倍，100倍，1 000倍稀释的pLL3.7-shRNA1慢病毒包装上清液感染细胞，绿色荧光；D，E，F：10倍，100倍，1000倍稀释的pLL3.7-shRNA2慢病毒包装上清液感染细胞，绿色荧光；G，H，I：10倍、100倍、1 000倍稀释的pLL3.7-shRNA3慢病毒包装上清液感染细胞，绿色荧光 |
表 2显示了USE1基因的表达量，将表 2中数据经Graph Pad Prism软件处理后得到如图 3所示的结果。从图中可以看出，与未经病毒感染的空白对照CON组相比，包装了pLL3.7-shRNA1质粒的慢病毒上清液感染HEK-293细胞后，USE1基因表达量没有明显减少，差异统计学意义不大（*P > 0.05），而包装了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重组质粒的慢病毒上清感染HEK-293细胞后对USE1目的基因有50%的抑制作用（*P < 0.05），差异具有统计学意义，说明在设计的3条shRNA干扰序列中，shRNA2和shRNA3能够有效抑制HEK-293细胞中USE1基因的表达。
|
| 图 3 RT-PCR检测USE mRNA在HEK-293细胞中的表达（*P < 0.05） |
从感染了10倍稀释慢病毒上清液的HEK-293细胞中裂解蛋白，经Western Blot实验从蛋白水平上检测USE1基因的抑制表达效果，如图 4-A所示。其中1号孔为未经病毒感染的HEK-293细胞中USE1基因正常表达量，2号孔为阴性对照即转染了pLL3.7-vector的HEK-293细胞中USE1基因的表达量，3-5孔分别为感染了包装pLL3.7-shRNA1、pLL3.7-shRNA2、pLL3.7-shRNA3质粒的慢病毒上清后细胞中USE1基因表达水平，从结果中可以看出与1号孔正常HEK-293细胞USE1基因的正常表达量和2号孔阴性对照组相比，3号孔中USE1基因表达量没有明显减少，而4、5号孔中USE1基因表达量明显降低。经灰度量化分析后得到如图 4-B所示的结果，结果进一步表明，相对于空白对照组，包装了pLL3.7-shRNA2和pLL3.7-shRNA3重组质粒的慢病毒上清感染细胞后具有约50%抑制USE1基因表达的效果（*P < 0.01）。
|
| 图 4 Western Blot检测USE1基因在HKE-293细胞中的表达（*P < 0.01） A:Western Blot of USE1 and GAPDH:1:CON; 2:pLL3.7-NC; 3:pLL3.7-shRNA1;4:pLL3.7-shRNA2;5:pLL3.7-shRNA3。B:Protein level of USE1 expression |
泛素化作为普遍存在于真核生物体内的蛋白翻译后修饰机制，在介导内源性蛋白降解、调控细胞周期与细胞凋亡、参与多种信号转导、参与DNA损伤修复及转录调控、协同自噬作用等多个重要的胞内反应中发挥重要作用[12]。泛素化作用底物繁多且通路网络复杂，当其机制出现异常，往往会导致胞内蛋白水平失衡，胞内多种生理活动不能正常进行，进而引发包括肿瘤、神经退行性疾病、炎症及风湿性疾病等[13-15]，因此，维持泛素化正常进行对于更新胞内蛋白、清除衰老及错误折叠蛋白、维持机体内环境稳定具有重大意义[16]。由于泛素结合酶E2和泛素连接酶E3成员众多，彼此间作用相互交错导致目前对某条特异的泛素化通路中，E2-E3及E3-底物蛋白间的具体的相互作用仍然模糊。而第二个泛素活化酶Uba6自发现以来，对其功能的认识依然不足，而对其特异性泛素结合酶USE1的研究更少，对这条特异性泛素化通路的研究对发现泛素活化酶Uba6功能、发现潜在有价值的底物蛋白、丰富泛素化理论等方面具有重要意义。
慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒HIV-1为基础建立的，对分裂细胞和非分裂细胞均有强感染力的一种载体，被广泛应用于RNA干扰技术、基因治疗等研究中[17-18]。当慢病毒进入细胞后，病毒RNA反转录进入细胞核中，可稳定整合至宿主基因组上，通过转染至细胞中可产生表达shRNA的高滴度病毒，实现在多种细胞中特异、稳定的基因沉默效果[19-20]。根据靶标基因的序列设计的shRNA可通过克隆到慢病毒表达载体上，经转录后折叠形成发卡结构，在细胞内进一步加工成siRNA，诱导同源靶基因的mRNA降解，发挥RNA干扰作用，沉默靶标基因的表达[21]。
基于以上理论基础，本实验在前期探索泛素活化酶Uba1和Uba6分别对应的特异性泛素化通路研究的基础上，加入了对Uba6的特异性泛素结合酶USE1研究，利用慢病毒载体干扰技术，设计3条靶向USE1基因的shRNA干扰序列，构建3种抑制USE1基因表达的慢病毒载体，经慢病毒包装、感染细胞后检测其抑制USE1基因表达情况，得到能够有效抑制USE1基因表达的细胞株。本实验成功构建了3种序列正确的USE1基因抑制表达慢病毒载体，经mRNA水平及蛋白水平检测，其中2种慢病毒重组质粒经包装转染至HEK-293细胞后，可有效抑制USE1基因的表达，编号分别为shRNA-2、shRNA-3，病毒包装液感染细胞后可得抑制USE1基因表达的细胞株，为后续实验中对比、寻找过表达USE1基因和正常表达USE1基因细胞株中泛素化对应的下游底物奠定基础，也为进一步研究Uba6-USE1这条特异性泛素化通路的功能提供依据。
4 结论本研究基于泛素活化酶Uba6及其特异性泛素结合酶USE1的泛素化通路，为得到USE1基因的抑制表达细胞系，设计了3条靶向USE1基因的shRNA序列，成功构建了3种RNA干扰USE1基因表达的慢病毒重组质粒，经慢病毒包装感染HEK 293细胞后检测蛋白表达情况，最终确定并得到了其中2种抑制USE1基因表达率在50%左右的shRNA序列及其慢病毒包装上清液，病毒上清感染细胞后即可得到抑制USE1基因表达的细胞株。
| [1] |
Rotin D, Kumar S. Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(6): 398-409. DOI:10.1038/nrm2690 |
| [2] |
Pickart CM, Eddins MJ. Ubiquitin:structures, functions, mechanisms[J]. Biochimica Biophysica Acta.Molecular Cell Research, 2004, 1695(3): 55-72. |
| [3] |
Pickart CM. Back to the future with ubiquitin[J]. Cell, 2004, 116(2): 181-190. DOI:10.1016/S0092-8674(03)01074-2 |
| [4] |
Jin J, Li X, Gygi SP, et al. Dual E1 activation systems for ubiquitin differentially regulate E2 enzyme charging[J]. Nature, 2007, 447(7148): 1135-1138. DOI:10.1038/nature05902 |
| [5] |
Chiu YH, Sun Q, Chen ZJ. E1-L2 activates both ubiquitin and FAT10[J]. Mol Cell, 2007, 27: 1014-1023. DOI:10.1016/j.molcel.2007.08.020 |
| [6] |
Pelzer C, Kassner I, Matentzoglu K., et al. UBE1L2, a novel E1 enzyme specific for ubiquitin[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(32): 23010-23014. DOI:10.1074/jbc.C700111200 |
| [7] |
Metzger MB, Hristova VA, Weissman AM. HECT and RING finger families of E3 ubiquitin ligases at a glance[J]. Journal of Cell Science, 2012, 125(Pt 3): 531. |
| [8] |
Zhou MJ, Chen FZ, Chen HC. Ubiquitination involved enzymes and cancer[J]. Medical Oncology, 2014, 31(8): 93. DOI:10.1007/s12032-014-0093-6 |
| [9] |
Zhao B, Bhuripanyo K, Zhang KY, et al. Orthogonal ubiquitin trans-fer through engineered E1-E2 cascades for protein ubiquitination[J]. Chemistry & Biology, 2012, 19(10): 1265-1277. |
| [10] |
Liu X, Zhao B, et al. Orthogonal ubiquitin transfer identifies ubiqu-itination substrates under differential control by the two ubiquitin activating enzymes[J]. Nat Commun, 2017, 8: 14286. DOI:10.1038/ncomms14286 |
| [11] |
Kim SJ, Lee TH, Sang HN, et al. Association of Uba6-Specific-E2(USE1) With Lung Tumorigenesis[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2016, 109(3): 1-11. |
| [12] |
Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system[J]. Annual Review of Biochemistry, 1998, 67: 425-479. DOI:10.1146/annurev.biochem.67.1.425 |
| [13] |
王佳悦, 赵博. 泛素化在肿瘤治疗方面的应用及展望[J]. 生命的化学, 2017, 37(6): 879-887. |
| [14] |
何伟珍, 徐晓东. 泛素-蛋白酶体途径与疾病[J]. 海南医学, 2007, 18(3): 141-142. DOI:10.3969/j.issn.1003-6350.2007.03.082 |
| [15] |
唐珍, 罗蓉. 泛素-蛋白酶体通路与疾病发生的研究进展[J]. 兰州大学学报:医学版, 2014, 40(3): 71-75. |
| [16] |
Dou QP, Zonder JA. Overview of proteasome inhibitor-based anti-cancer therapies:perspective on bortezomib and second generation proteasome inhibitors versus future generation inhibitors of ubiquitin-proteasome system[J]. Current Cancer Drug Targets, 2014, 14(6): 517-536. DOI:10.2174/1568009614666140804154511 |
| [17] |
Sumimoto H, Kawakami Y. Lentiviral vector-mediated RNAi and its use for cancer research[J]. Future Oncol, 2007, 3(6): 655-664. DOI:10.2217/14796694.3.6.655 |
| [18] |
Katayama K, Koichiro W, Miyoshi H, et al. RNA interfering approach for clarifying the PPAR pathway using lentiviral vectors expressing short hairpin RNA[J]. FEBS Letters, 2004, 560(3): 178-182. |
| [19] |
Kafri T, Praag HV, Ouyang L, et al. A Packaging cell line for lentivirus vectors[J]. Journal of Virology, 1999, 73(1): 576. |
| [20] |
Naldini L, Blömer U, Gallay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science, 1996, 272(5259): 263-267. DOI:10.1126/science.272.5259.263 |
| [21] |
张景海, 杨保胜, 颜真, 等. 药学分子生物学[M]. 第4版. 北京: 人民卫生出版社, 2013.
|